第九章 微生物和酶制剂工业 9．1 概述 酶是一种具有催化活性的蛋白质，因此酶具有催化剂的特点，即：能够加快特定反应的速率但不能改变反应的平衡，在反应中不消耗, 反应结束时回复到原来的形态；同时酶又具有蛋白质的属性，即：酶由氨基酸通过肽键连接而成，只有在适当的温度, pH和离子强度下才具有生物活性，有些酶还需要辅酶或者辅因子。由于酶催化反应能够在常温常压下进行，而且具有很高的效率和专一性，酶的应用日益受到了人们的重视。 在细胞中有数以千计的酶同时催化着成千上万个反应，因此可以毫不夸张地说，酶是一切生命活动的基础。目前已经知道的酶超过了2000种，但是根据最简单的原核生物大肠杆菌染色体的基因图谱分析, 就可能包含3000-4500种不同酶蛋白的信息，所以还有更多的酶有待于鉴别。 人类早在认识酶以前就知道利用酶为生产和生活服务，例如面粉发酵，酿造，鞣革及制造奶酪等已经有几千年的历史，都是人类不自觉地利用酶的例子。1783年，Spallanzani提出消化不是磨碎而是胃液在起作用的概念，对酶有了初步的认识； 到了十九世纪人们已经认识到了酶的存在，建立了酶的概念。1833年Payer用乙醇抽提麦芽，并用于淀粉水解和织物退浆；1887年B(chner发现磨碎的酵母仍然能够使糖液发酵产生酒精和二氧化碳；1926年Sumner第一次分离出脲酶并获得了该蛋白质的结晶；四十年代末，生产α-淀粉酶的液体深层发酵首先在日本实现了工业化生产，标志着现代酶制剂工业的开始。 商品酶制剂根据其来源可以分为动物、植物及微生物酶；依据其用途可分为工业用、分析用及药用；而且不同用途酶制剂产品的价格和生产规模也有很大的差别，见表9.1.1。由于用微生物发酵的方法能够不受原料的限制，实现大规模工业化的酶制剂生产，成本低、效率高，因此在目前已经能够大规模工业化生产的100多种酶中，极大部分都是通过微生物发酵生产的。 表9.1.1 商品酶的来源、用途及生产规模 工业用酶 分析用酶 药用酶  生产规模 以吨计 毫克-克 毫克-克  纯度 粗酶制剂 纯结晶 纯结晶  来源 微生物 微生物、动物、植物 微生物、动物、植物  产品价格 低 中—高 中—高   9．1．1酶的分类和命名 我们知道，酶可以分为六个大类。根据酶委员会(Enzyme Commission)的命名规则，酶的命名以酶委员会英文的头一个字母E.C.开始，后面跟随着四组数字，第一个数字表示酶的大类，第二和第三个数字代表所催化的反应，第四个数字用于根据所催化的底物区分具有类似功能的酶。 氧化还原酶(Oxidoreductase) 这类酶催化将氢或氧或电子从一种底物转移到另一种物质的反应，常称为氧化酶或脱氢酶，如葡萄糖氧化酶及乙醇脱氢酶。氧化还原酶的前三位数字的意义是： 第一个数字 第二个数字 第三个数字 1．（氧化还原酶） 1.醇 1.NAD+或NADP+ 2.醛或酮 2.Fe3+ 3.烯-CH=CH- 3.O2 4.伯胺 4.其它 5.叔胺 6.NADH或NADPH 2)转移酶(Transferase) 转移酶催化基团转移反应，一般形式为： AX + B BX + A 但不包括氧化还原反应和水解反应。前三位数字的意义是： 第一个数字 第二个数字 第三个数字 2.(转移酶) 1.一碳基团 转移基团的性质 2.醛基或酮基 3.酰基(-CO-R) 4.葡萄糖基 7.磷酸基 8.含硫基团 3)水解酶(Hydrolase) 水解酶催化水解反应, A—X + H2O X—OH + HA 前两位数字的意义是: 第一个数字 第二个数字 第三个数字 3.(水解酶) 1.酯键 2.糖苷键 4.肽键 5.除肽键外的C-N键 6.酸酐键 4）裂合酶(Lyase) 裂合酶催化除水解外的从底物中脱除基团的反应或其逆反应，产物一般含有一个双键，第二个数字代表所断裂键的类型，第三位数字代表所除去的基团。催化逆反应的酶又称为合成酶。 第一个数字 第二个数字 第三个数字 4．（裂合酶） ` 1.C-C 1.羧基 2.C-O 2.醛基 3.C-N 3.酮酸 4.C-N 5）异构酶（Isomerase） 异构酶催化异构化反应, 前三个数字的定义是: 第一个数字 第二个数字 第三个数字 5.(异构酶) 1.消旋反应或差相异构化反应 1.氨基酸 2.顺反(cis-trans)异构反应 2.羟酸 3.分子内氧化还原反应 3.碳氢化合物 4.分子内基团转移反应 6）连接酶(Ligase) 连接酶催化各种键的合成，键的形成反应含能化合物（如ATP或核苷三磷酸）键的断裂同时发生，反应的一般形式是： X + Y + ATP X—Y + ADP + PI 或 X + Y + ATP X—Y + AMP + PPI 连接酶的第二个数字代表所形成键的类型。 第一个数字 第二个数字 第三个数字 6.(连接酶) 1.C-O 2.C-S 3.C-N 4.C-C 以乙醇脱氢酶为例，它的酶编号为：EC 1.1.1.1，说明它属于氧化还原酶，电子供体是CH-OH，电子受体是NAD+。因此它的正式命名应该是乙醇：NAD+氧化还原酶。 9.1.2主要的微生物酶制剂 目前，上述六大类中都有一些酶可以通过微生物发酵生产。部分典型的酶制剂及其生产菌列于表9.1.2。 表9.1.2只列出了一小部分工业酶制剂，从中可以看到酶的用途已经渗透到各个工业部门和人们的日常生活。以酶的工业应用为例, ((淀粉酶和糖化酶已经代替传统的酸法水解用于从淀粉生产葡萄糖及纺织品的退浆；蛋白酶、脂肪酶及纤维素酶广泛用于洗涤剂、食品、纺织、精细化学品及手性化合物斥分和合成等；由葡萄糖异构酶催化的从葡萄糖生产高果玉米糖浆(High Fructose Corn Syrup, HFCS)年产量已超过1,000万吨；通过青霉素酰化酶催化青霉素G分解生产6-APA已成为半合成抗生素最重要的中间体, 等等。许多酶直接应用于疾病的诊断和治疗, 如链激酶, 葡萄糖氧化酶及乳酸脱氢酶等。更多的酶则被用于科学研究, 可以毫不夸张地说, 没有众多的工具酶, 就没有人类基因组计划和以基因重组为核心的现代生物技术。随着人们对酶的认识不断深入和更多的酶被发现, 酶的应用领域将更加广阔, 微生物酶制剂工业也必将得到进一步发展。 表9.1.2 部分典型的酶制剂及其生产菌 酶名称 酶类型 典型生产菌名称 用途  中文 英文     淀粉酶 Amylase 水解酶 Bacillus subtilis 淀粉水解  葡萄糖苷酶 Amyloglucosidase 水解酶 Aspergillus niger 葡萄糖生产  碱性蛋白酶 Alkaline protease 水解酶 Streptomyces grisus 洗涤剂（pH8.0）  中性蛋白酶 Protease 水解酶 Bacillus subtilis 洗涤剂（pH7.0）  脂肪酶 Lipas 水解酶 Rhizopus japonicus 洗涤剂等  纤维素酶 Cellulase 水解酶 Trichoderma reesei 纤维素水解等  果胶酶 Pectinase 水解酶 Eriwinia carotovora 食品加工等  葡萄糖异构酶 Glucose isomerlase 异构酶 Bacillus coagulans 高果糖浆制造  青霉素酰化酶 Penicillin acylase 转移酶 Escherichia coli 6-APA制造  天冬氨酸转氨酶 Aspartic acid Transaminase 转移酶 Escherichia coli L-苯丙氨酸制造  延胡索酸酶 Fumarase 裂合酶  L-苹果酸制造  葡萄糖氧化酶 Glucose oxidase 氧化酶 Bakers Yeast 酶电极制备  T4 DNA 连接酶 T4 DNA Ligase 连接酶 T4 感染的E. coli 分子生物学研究  漆酶 Laccase 氧化酶 Coliolus versicolor 木质素降解   9.1.2产酶微生物的来源和特点 从表9.1.2中可以发现，能够生产酶的微生物菌种分布很广，属于原核生物和真核生物的许多微生物都能用于酶制剂的生产。往往有许多种微生物能够用于同一种酶的生产，例如，枯草杆菌，曲霉及根霉等都可以用于生产淀粉酶，产品都能够用于降解淀粉，但是每种微生物所生产的淀粉酶分子量、最适pH、最适温度及反应速率等都会有所差别，表9.1.3所列的数据就说明了这种差别。另外，同一种微生物能够产生几种不同的酶或能够催化类似反应、但是作用位点不同的几种酶，例如，黑曲霉（Aspergillus niger）既能产生淀粉酶，又能产生纤维素酶或蛋白酶；而枯草杆菌（Bacillus subtilis）产生的淀粉酶中，则可能包括(-淀粉酶、(-淀粉酶、支链淀粉酶及糖化酶等淀粉水解酶，如图9.1.1所示,它们在淀粉分子中的作用位点却完全不同。还有一些酶制剂实际上是几种不同酶的混合物并通过它们的协同作用完成催化作用。例如一般称为纤维素酶的商品酶制剂至少是三种酶的混合物: 内切型葡聚糖酶(EC3.2.1.4, 也称为Cx酶、CMC酶或简称EG) 、外切型葡聚糖酶(EC3.2.1.91, 也称为C1酶、微晶纤维素酶、纤维二糖水解酶或简称CBH)和纤维二糖酶(EC3.2.1.91, 也称为(-葡萄糖苷酶或简称BG)。Cx酶作用于纤维素分子内部的非结晶区, 随机水解(-1,4糖苷键, 将纤维素大分子切割成带还原性末端的许多碎片；C1酶作用于纤维分子末端，水解(-1,4糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子；纤维二糖酶则将纤维二糖进一步水解为葡萄糖。正是在这三种酶的共同作用下，将纤维素最终水解为葡萄糖。 表9.1.3 不同微生物生产的淀粉酶性质比较 微生物 最适pH 最适温度,C( 分子量  杆菌Bacillus subtilis 6.0 60 68,000   B. licheniformis 7.0-9.0 70-90 62,650   B. licheniformis 5.0-8.0 76 22,500  链霉菌Streptomyces aureofaciens 4.6-5.3 40 40,000  微球菌Micrococus halobius 6.0-7.0 50-55 89,000  根瘤菌Bacteroides amylophilus 6.3 43 92,000  黑曲霉Aspergillus oryzae 5.5-5.9 40 52,600  毛霉Mucor pusillus 3.5-4.0 65-70 48,000  施旺氏酵母Schwanniomyces castellii 6.0 60 40,000   (-淀粉酶 支链淀粉酶 (-淀粉酶 糖化酶 图9.1.1 各种淀粉酶在淀粉分子上的作用位点 利用微生物生产酶制剂的主要优点是： 可以通过改变微生物的遗传性质和优化培养条件而大大提高产酶水平。通过对产酶菌种的选育, 可以使参与微生物分解代谢的酶活水平提高几千倍、合成代谢的酶活提高几百倍，这样的例子并不少见； 由于微生物发酵的生产周期短, 培养基价格低廉，酶制剂可以实现大规模、低成本的工业化生产； 微生物的筛选方法比较简单，而且已经很成熟，因此有可能在较短的时间内从成千个菌株中筛选出高产菌种； 同样的反应可以用来源于不同微生物所产的性质略有不同的酶催化，因此生物反应器的操作条件选择具有一定的灵活性和适应性，以便与前后工序相配合； 微生物发酵生产的酶比活高，有利于酶的分离和提纯。 正是由于以上优点, 利用微生物生产酶制剂大大降低了酶的生产成本, 提高了酶制剂的生产能力, 从而推动了工业规模酶制剂生产和酶制剂应用的进展。 一般而言，水解酶都是胞外酶，而其它酶通常属于胞内酶。极大部分酶都属于结构(组成)酶，即微生物的DNA分子中存在着编码该酶蛋白的基因，在细胞生长过程中就会产生这些酶并参于细胞代谢过程，但是酶的产量受到细胞的调节和控制；其中有些属于诱导酶，即需要在培养基中添加特殊的诱导剂才会产生的酶。野生微生物的产酶水平一般都不高,不能直接用于酶制剂的工业化生产，必须进行菌种选育以提高产酶水平。 虽然每一种微生物的代谢过程都需要数以千计的酶参与，但是不是每一种微生物都适合于酶的工业化生产。传统的产酶菌种都是从土壤中筛选得到的，首先获得具有产某种酶能力的微生物，然后通过各种诱变育种方法提高它的产酶水平，直至达到工业化生产的要求。对于产酶的菌种，一般应该符合如下的要求： 菌种的遗传性能应该比较稳定； 菌种具有较高的生长速率； 除了蛋白酶生产菌种外，其它产酶菌种的产蛋白酶活力应该很低，以防止目标酶被蛋白酶水解； 目标酶制剂的产量较高。 随着分子生物学和重组DNA技术的发展，越来越多的酶已经知道了其氨基酸序列和空间结构，因此可以通过基因重组获得基因工程菌生产酶制剂。 9.2酶合成的调节和控制 酶是一种蛋白质。根据生物化学和分子生物学的研究, 蛋白质的合成是一个十分复杂的过程, 涉及到三种RNA(tRNA, mRNA及rRNA), 几种核苷酸(ATP, GTP等), 一系列的酶和蛋白辅助因子, 总共大约有200种细胞成分参与了蛋白质的合成过程。因此与蛋白质合成有关的调节和控制因素都会影响酶的产量。微生物细胞产生的酶可以分为两大类: 胞外酶和胞内酶。胞外酶一般都属于水解酶, 是微生物为了利用环境中的大分子底物(如淀粉、纤维素、蛋白质等)而释放到胞外的, 这样即使水解酶的胞外浓度很高, 在细胞内这类酶仍能维持在较低水平, 所受到的调节和控制相对要少一些, 因此许多野生菌种(如Gram阳性菌及霉菌等)也能达到较高的产水解酶水平。胞内酶的作用是催化在细胞内发生的一系列反应, 由于胞内的代谢中间产物或终产物浓度都必须保持在适当的细胞生理浓度的范围内, 催化这些反应的酶活性或浓度必然会受到更多因素的调节和控制。因此如果要生产胞内酶, 就必须研究它们在合成过程中的调节和控制机理, 找出解除调节和控制的方法, 才能使胞内酶过量积累。 9.2.1酶合成的基因水平调节和控制 9.2.1.1原核生物中酶合成的基因水平调节 在原核生物中, 对蛋白质生物合成过程调节起关键作用的是mRNA, mRNA又受到转录的控制, 因此转录水平的调节是主要的, 翻译水平的调节影响则比较小。原核生物的转录控制主要通过操纵子(Operon)实现, 在操纵子上有一个启动子(Promoter)位点, 在开始转录前RNA聚合酶与启动子结合。在起动子和酶的结构基因之间有一个调节区, 它的作用是控制操纵子转录的频率。调节区有如下两种形式: 1)操纵子模式。这种模式属于负控制, 调节区敞开让RNA聚合酶通过, 当它与组遏蛋白结合后关闭。操纵子模式控制的典型代表是乳糖(lac)操纵子(见图9.2.1), 大肠杆菌的乳糖操纵子含有三个结构基因, 分别表达((半乳糖苷酶(Z)、半乳糖苷渗透酶(Y)和硫代半乳糖苷转乙酰酶(A), 这些基因的表达受到阻遏蛋白的控制, 阻遏蛋白的结构基因则位于乳糖操纵子的第二个转录单元中, lac阻遏蛋白由四个紧密结合在一起的分子量同为38,000的子单元组成, 作用区域位于启动子P和Z基因之间。一旦与操纵子(O)结合, lac阻遏蛋白就很难解离, 加入诱导剂后不能直接取代阻遏蛋白，而是通过与阻遏蛋白和操纵子的复合物作用, 使其结构不稳定并发生构型变化, 然后才能取而代之, 使酶的结构基因发生转录；环腺苷一磷酸(cAMP)、cAMP/CRP（环腺苷酸受体蛋白）复合物及RNA聚合酶(RNAP)则将分别键合到启动子各自的位点上。  图9.2.1 乳糖操纵子原理示意图  图9.2.2 阿拉伯糖操纵子控制原理示意图 2)启动子模式。这种模式属于正控制, 调节区本身是关闭的, 不允许RNA聚合酶通过, 只有当它与活化蛋白结合后, 操纵子打开使RNA聚合酶得以通过, 转录随之开始。启动子模式的典型代表是如图9.2.2所示的阿拉伯糖(ara)操纵子。ara操纵子中包括三种与L-阿拉伯糖转化为D-木酮糖-5-磷酸有关的酶(araB、A和D)、两种传递酶及一种低分子量渗透酶(araE)的结构基因, 操纵子的控制区如图9.2.2的放大部分所示。当araC基因表达的蛋白质是阻遏蛋白构型(Crep)并与操纵子的活性位点结合时, 酶的结构基因转录不能进行，而且占据了两个cAMP/CRP复合物的结合位点。加入诱导剂后, 使Crep改变成了活化型(Cind), cAMP/CRP复合物也重新与操纵子结合, 在两者的共同作用下, 酶的转录开始。  图9.2.3 Salmonella typhimurium中酶合成的双操纵子自诱导模型 除了以上两类由诱导剂引起的酶合成调节机理外, 原核生物中还存在着自发的阻遏蛋白-控制的诱导机制, 典型例子是在沙门氏菌Salmonella typhimirium中与组氨酸酶(hut)有关的双操纵子模型(见图9.2.3)。两个操纵子的核苷序列不完全相同, 右面操纵子与阻遏蛋白的结合能力比左面的强3-4倍, 位于左面操纵子中的hutC基因编码阻遏蛋白, 该蛋白与操纵子结合, 完全阻遏了右面操纵子的转录，但是左面的操纵子仍能够进行少量的转录。由于细胞中总是存在着生理浓度的组氨酸及组氨酸酶, 因此会产生少量的尿狗酸, 尿狗酸则是操纵子的诱导剂, 它使阻遏蛋白失活, 两个操纵子就能够启动结构基因的转录并导致酶蛋白表达。与此同时, hutC基因表达的阻遏蛋白量也增加, 因此系统将处于一个动态平衡中。 9.3.2 真核微生物产酶的基因水平调节和控制 真核微生物产酶的基因水平调节和控制与原核生物有很大的差别, 其调节和控制机理也要复杂得多。 真核微生物mRNA的两端都经过了修饰, 其中5’端是甲基化的核苷酸片段, 有一个含三个磷酸基团的鸟嘌呤残基通过独特的5’-5’键连接截断了mRNA最后第二个碱基。这个5’-帽通过削弱5’外切核苷酸酶的活性从而加强了mRNA的稳定性, 有利于7-甲基鸟嘌呤与核糖体的结合，提高了翻译的效率。mRNA的3’端含有一个很长的腺苷残基(PolyA), 其功能是为蛋白质的键合提供位点, 有利于在细胞质中的传递和稳定性。这种两端修饰过的RNA称为核RNA(hmRNA), 只有经过内切核酸酶的加工才能成为mRNA, 因此与原核生物相比多了一个调节和控制步骤。 在真核微生物中同样存在转录控制。以酵母为例, 已经证实细胞色素C基因(cyc 1)和与嘧啶生物合成有关的ura 3基因都受到转录控制, 存在着与原核生物中类似的操纵子, 但真核生物的操纵子一般都属于正控制。图9.2.4显示了酵母细胞中的半乳糖利用系统, 该系统包括三种酶: 一种激酶(gal 1)、尿嘧啶转移酶(gal 9)、差向异构酶(gal 10)和一种传递蛋白的结构基因。  图9.2.4 酵母细胞中半乳糖利用系统 该系统的调节基因是: gal 4、80(i)和81(c), 其中基因80(i)编码的阻遏蛋白将遏制基因81(c), 基因81(c)和gal 4组成了一个操纵子。gal 4编码的蛋白则对三种酶的结构基因都具有激活作用。 链孢霉Neurospora crassa能够用于胞外碱性蛋白酶的生产, 产酶的控制机理非常复杂, 低浓度的蛋白质能够诱导产酶, 氮源、硫源和碳源分别通过各自的调节基因(cys 3、amr和一个未知基因)对酶的合成进行控制, 只有当链孢霉处于氮、硫或碳飢饿状态时才能解除阻遏, 开始合成碱性蛋白酶。 通过基因水平酶合成调节和控制机理的研究可以为产酶菌种的选育和产酶工艺条件的优化提供方向, 这样就能够大大加快菌种选育的进度, 并大幅度提高酶的产量。 9．3 微生物中酶生物合成调节和控制在菌种选育中的应用 9.3.1 产酶菌种的筛选 产酶菌种的筛选是酶制剂工业化生产的第一步，也是最关键的一步。已知的产酶菌种可以从菌种库或从事该种酶研究的科研单位获得。如果没有这样的条件，就必须从自然界筛选。对于水解酶，可以从具有水解酶产生条件的工厂或场所附近的土样中筛选，例如：从酿造厂附近的土样中可以筛选得到产淀粉酶活力较高的菌株；从腐烂的木材中能够筛选到产纤维素酶的菌株等。筛选用的培养基中应该含有这种酶所催化反应的底物或诱导物，最好能够用简便的方法鉴别出产物生成，如：透明圈法、变色圈法等，以提高筛选工作的效率。但是也有例外，例如有些蛋白酶生产菌(B. licheniformis)的透明圈很小而液体深层发酵的产酶水平却很高。 9.3.2 微生物产酶的诱导及组成型变异株的选育 许多微生物虽然具有目的酶的结构基因，但是如果培养基中不含该酶所催化反应的底物，结构基因将处于无活性状态，即酶的合成受到阻遏。一旦加入底物，结构基因将被激活，酶的合成开始。这种现象称为“诱导”，这种酶称为“诱导酶(Induced enzyme)”。许多参与分解代谢的酶都属于诱导酶，诱导剂一般是该酶所催化反应的底物。例如：淀粉或糊精能够诱导淀粉酶的产生；蔗糖是转化酶的诱导剂；尿素则是脲酶的诱导剂等。某些诱导剂的诱导作用非常强，半乳糖苷可以使E. coli产生(-半乳糖苷酶的活力提高约1,000倍，该酶在E. coli细胞中的含量可以达到胞內蛋白质总量的百分之几。 一些底物的类似物对酶来说是无活性或低活性的, 但是往往具有很强的产酶诱导作用。表9.3.1列出了一些典型的底物类似物。除了底物外，有些酶催化反应的产物也能够起诱导作用，表9.3.2列出了一些产物诱导产酶的例子。 表9.3.1底物类似物诱导产酶 酶 底物 底物类似物诱导剂  (-半乳糖苷酶 乳糖 异丙基-(-D-硫代半乳糖苷  青霉素(-内酰胺酶 苄基青霉素 二甲氧基苯青霉素  马来酸cis-trans异构酶 马来酸 丙二酸  脂族酰胺酶 乙酰胺 N-甲基乙酰胺  酪氨酸酶 L-酪氨酸 D-酪氨酸，D-苯丙氨酸  纤维素酶 纤维素 槐二糖   表9.3.2 产物诱导产酶 酶 微生物 底物 产物诱导剂  糖化酶 Aspergillus niger 淀粉 麦芽糖，异麦芽糖  淀粉酶 Bacillus stearothermophilus 淀粉 麦芽糊精  葡聚糖酶 Penicillum sp. 糊精 异麦芽糖  支链淀粉酶 Klebsiella aerogenes 支链淀粉 麦芽糖  脂酶 Geotrichum candidum 脂肪 脂肪酸  内切聚半乳糖醛酸酶 外切聚半乳糖醛酸酶 果胶脂酶  Acrocylindrium sp.  聚半乳糖醛酸  半乳糖醛酸  色氨酸氧化酶 Pseudomonas sp. 色氨酸 犬尿氨酸  组氨酸酶 Klebsiella aerogenes 组氨酸 尿犬酸  尿素羧化酶 Saccharomyces cerevisiae 尿素 脲基甲酸   有些辅酶也能够诱导酶的产生，例如，在培养基中添加维生素B1可以增加丙酮酸脱羧酶的产量；维生素B6的加入则会起到强化酪氨酸苯酚裂合酶的产生。 通过诱变育种方法可以消除微生物产酶对诱导剂的依赖性。诱变的目的是使酶合成的调节基因发生突变，但是不会影响结构基因，因此这样的诱变育种方法又称为调节突变。调节突变的机理一种是通过调节基因的突变，消除了阻遏酶合成阻遏蛋白的能力；第二种机理是使操纵子基因发生突变，从而防止了操纵子基因与阻遏蛋白的键合, 这样即使能够在胞内合成阻遏蛋白, 但调节酶合成的操纵子无法启动, 酶就能够被大量合成。一种本来需要诱导剂诱导才能产酶的微生物, 经过诱变育种后不再需要诱导剂的突变菌株称为组成型变异株。这类变异株的选育方法很多，下面是几个诱变育种的成功实例: 1）经过诱变处理的E.coli在恒化器中进行培养，通过进口培养基中限制加入诱导剂(-半乳糖苷，Novick 和Horiuchi筛选出了不需要加入诱导剂就能够产生高水平(-半乳糖苷酶的变异株；2）在只含有一种碳源（不是诱导剂）的平板上筛选出产酶的变异株，利用这种方法，Jayaraman等人用2-硝基苯-(-1-阿拉伯糖苷为唯一碳源筛选出了(-半乳糖苷酶的变异株； Hynes 和Pateman用类似的方法以丙烯酰胺为唯一氮源筛选出了产乙酰胺酶的变异株。 9.3.3酶合成的反馈阻遏及其解除 某些酶能够在细胞的生长过程中合成，但是随着代谢途径中终端产物的结累或者在培养介质中加入该物质，酶的合成将受到阻遏。这种低分子量的终端产物（或称为共阻遏物）会与一种胞内蛋白质（阻遏物蛋白）结合，然后被调节基因编码，产生阻遏物，该阻遏物就会切断结构基因对酶蛋白的表达。这类酶称为可阻遏的酶。 催化分解代谢的一些酶会受到直接或间接产物的阻遏。图9.3.1显示了纤维素酶的调节模型。从图中可以看到，胞内的纤维二糖诱导纤维素酶的合成，而胞内的葡萄糖会阻遏纤维素酶基因的转录和翻译。此外，纤维二糖的水解产物葡萄糖和葡萄糖的氧化产物葡萄糖酸内脂及葡萄糖酸对葡萄糖苷酶存在反馈抑制，因此有利于纤维素酶的合成。分泌到胞外的纤维素酶催化纤维素底物水解，产生胞外纤维二糖，而胞外纤维二糖必须通过主动输送才能进入胞内并进一步水解为葡萄糖。可以预料，跨膜输送对纤维素酶的合成也将具有重要的作用。在纤维素酶的工业化生产实践中，已经证明在培养基中添加表面活性剂（如吐温-80）会显著提高纤维素酶的产量。 培养介质 细胞壁 细胞质 反馈抑制 葡萄糖 主动输送 葡萄糖苷酶 葡萄糖氧化酶 纤维二糖 纤维二糖 葡萄糖 葡糖酸内脂+葡糖酸 反馈抑制 诱导剂 诱导剂-阻遏 剂蛋白质 纤维素 诱导 阻遏 转录和翻译 酶释放 胞外纤维素酶 细胞结合的纤维素酶 图9.3.1 Trichoderma viride纤维素酶合成的调节模型 虽然蛋白酶是由氨基酸合成的, 但是蛋白酶的生物合成却受到氨基酸的阻遏。如果在培养基中含有氨基酸，细菌产蛋白酶的能力就很差；反之, 不加氨基酸时却会大幅度提高蛋白酶产量。已经有实验事实证明氨基酸的存在对细胞膜的渗透性有影响, 妨碍了蛋白酶的释放。也有一些实验证明氨基酸的阻遏作用发生在转录水平，而且可能与细菌中mRNA的存在形式有关。 对于尿酶、硝酸还原酶、核糖核酸酶及精氨酸酶而言，因为这些酶能够催化含氮化合物的降解生成氨，在培养介质中限制氨的加入将有利于酶的合成。在利用Bacillus licheniformis生产谷氨酸脱氢酶时，因为谷氨酸是该酶催化反应的产物，在培养基中添加谷氨酸无疑会增加胞内谷氨酸浓度，加重反馈抑制作用。如果用葡萄糖或马来酸代替谷氨酸或酪蛋白水解液作为碳源，就能使谷氨酸脱氢酶的产量提高约20倍。为了避免终端氨基酸产物在胞内积累，可以在培养基中加入该氨基酸代谢途径中某些关键酶的抑制剂，例如在微生物培养基中加入2-噻唑丙氨酸可以使细胞中参与组氨酸合成的十种酶的活力降低约30倍。 一种更为有效的避免终端产物在胞内积累的方法是选育营养缺陷型菌株。这样，只要限制供给营养缺陷型菌株必须的生长因子，就能够降低胞内终端产物浓度，大幅度地提高酶的产量，表9.3.3列出了一些典型的例子。某些部分营养缺陷型菌株（即，能够在最低培养基中缓慢生长而又能受到生长因子刺激生长的菌株）也能显著提高酶的产量，例如Moyed曾经用一株部分嘧啶缺陷型菌株生产天冬氨酸转氨甲酰酶，产量比原菌株提高了500倍。 表9.3.3 通过限制加入营养缺陷型菌株的生长因子解除对酶合成的阻遏 营养缺陷型菌株的生长因子 解除阻遏的酶 产量提高倍数  亮氨酸 乙酰羟酸合成酶  40  硫胺素（维生素B1） 硫胺素生物合成途径的四种酶  1,500  生物素 7-羟基-8-氨基壬酸氨基转移酶  >400  鸟嘌呤 肌苷单磷酸脱氢酶  >45   对于存在反馈阻遏影响酶合成的微生物，也可以选育调节突变株。通过诱变处理后，筛选对终端产物的类似物的抗性突变株。诱变可能引起调节基因发生突变，所合成的阻遏物蛋白没有活性，因此不能与共阻遏蛋白结合；或者使操纵子基因发生突变，使其不能与阻遏蛋白结合。这类突变株即使在含正常水平终端产物的培养基中也能够产酶。利用这种方法，Hollowy 等人曾经选育了一株乙基硫氨酸抗性的突变株，使胱硫醚合成酶的含量提高了120倍，一些甲胺抗性的突变株则可以解除由氨引起的反馈阻遏。 9.3.4酶的分解代谢阻遏及其解除 当微生物在一种容易利用的碳源培养基中快速生长时，某些酶，特别是受分解代谢产物诱导的酶合成将受到阻遏。其主要原因是细胞的快速生长会导致胞內环腺苷酸（cAMP）浓度降低，使结构基因的转录停止。一些酶的分解代谢阻遏见表9.3.4。从表中可以看到分解代谢阻遏对一些重要的酶制剂生产具有很大的影响，其中碳源的选择对酶的产量起着关键作用。一些实验事实证明，若用其它碳源代替会产生分解阻遏的碳源, 能够成百倍地提高酶的产量。例如，Welker 和Campbell用甘油代替果糖作为Bacillus stearothermophilus 的碳源，使淀粉酶的产量提高了25倍；Yamane等用甘露糖为碳源生产纤维素酶，比半乳糖提高了1500倍。如果出于经济考虑必须采用会产生分解阻遏的碳源时，可以采用流加或连续发酵的方法，使发酵罐中的碳源浓度始终能够维持在低水平，以减少阻遏作用。有时产酶诱导剂的迅速代谢也会产生阻遏，这就需要采用缓慢添加诱导剂、寻找不会产生阻遏的诱导剂类似物或诱导剂的衍生物等方法。Reese等人曾用蔗糖单棕榈酸脂代替蔗糖生产转化酶，使酶产量提高了80倍以上。 表9.3.4酶的分解代谢阻遏 酶名称 微生物名称 起阻遏作用的碳源  (-淀粉酶 Bacillus Stearothermophilus 果糖  纤维素酶 Trichoderma viride 葡萄糖、甘油、淀粉、纤维二糖  纤维素酶 Pseudomonas flurorescens 半乳糖、葡萄糖、纤维二糖  蛋白酶 Bacillus megaterium 葡萄糖  蛋白酶 Candida lipolytica 葡萄糖  糖化酶 Endomycopsis bispora 葡萄糖、麦芽糖、淀粉、甘油  聚半乳糖醛酸 反式消去酶 Aeromonas liquefaciens 葡萄糖、聚半乳糖醛酸  转化酶 Neurospora crassa 葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖  次甲基羟化酶 Arthrobacter sp. 醋酸   如果分解代谢阻遏影响酶的产量时，也可以通过诱变育种方法选育出对分解代谢阻遏抗性的菌株。经过诱变处理的菌株可以将分解代谢所阻遏的酶的底物作为唯一氮源，在平板上进行筛选。例如脯氨酸氧化酶的合成受到葡萄糖的分解代谢阻遏，脯氨酸是脯氨酸氧化酶的底物，因而野生型的Salmonnella typhimurium不能在葡萄糖-脯氨酸平板上生长；而对分解代谢阻遏抗性的突变株, 由于它能够合成脯氨酸氧化酶，就可以从脯氨酸氧化获得氮源，因此能够在该培养基上生长，这种方法能筛选到对分解代谢阻遏抗性的脯氨酸氧化酶生产菌株。从野生型的假单胞菌Pseudomonus aeruginusa选育酰胺酶生产菌株也可以采用类似的方法，该微生物存在对琥珀酸的分解代谢阻遏，因此可以在乳酰胺-琥珀酸平板上筛选。若野生型菌株的酰氨酶合成受到阻遏，不能利用酰胺作为氮源，因而不能在该平板上生长。通过上述方法选育得到的酰氨酶生产菌的胞内蛋白质中，酰胺酶的积累量占总蛋白量的10%。 例9.3.1 葡萄糖异构酶的调节机理和菌种选育 过膜传递 木糖异构酶 木酮糖激酶 胞外D-木糖 胞内D-木糖 D-木酮糖 D-木糖-5-鳞酸 xyl T xyl R xyl B xyl A gly S A1 A2 图9.3.2 在Salmonella typhimurium中木糖的代谢途径及调节 葡萄糖异构酶（glucose isomerase），事实上是木糖异构酶，能够催化醛糖-酮糖之间的异构化反应。1957年，Marshall和 Kooi发现这种酶能够催化将葡萄糖异构化为果糖的反应。由于果糖的甜度是葡萄糖的1.8倍, 因此能够用于食品工业以减少糖的用量, 同时也会一些国家过剩的粮食创造了一个巨大的市场。酶法生产高果糖浆具有工艺路线简单和生产成本低的优点,目前全世界已经形成了年产上千万吨高果糖浆（HFCS）的生产规模。 Salmonella typhimuriu中葡萄糖异构酶的调节机理如图9.3.2所示。沙门氏菌Salmonella typhimuriu对木糖的利用受到类似于操纵子的基因片段所控制，该基因片段由三个结构基因（xyl T、xyl B和xyl A）组成，分别负责木糖跨膜传递及木酮糖激酶和木糖（葡萄糖）异构酶的合成。这三个结构基因受到调节基因xyl R的控制，如果培养基中缺少木糖作为诱导剂，xyl R基因的转录产物A1会对操纵子产生阻遏。加入木糖后，木糖与转录产物A1结合产生A2，A2则是操纵子的活化因子，通过复杂的活化过程，使xyl T、xyl B和xyl A 基因开始转录。葡萄糖的加入将通过基因gly S而对操纵子产生阻遏。 已经发现至少有65种微生物能够产生葡萄糖异构酶。沙门氏菌并不是葡萄糖异构酶的生产菌，对工业上使用的菌种，如黄杆菌Flavobacterium arborescens 、链霉菌Streptomyces sp. 或芽孢杆菌Bacillus licheniformis的调节机理还没有进行过仔细的研究，但是上述机理还是很有参考价值的。为了避免使用价格昂贵的木糖作为诱导剂，在进行工业用的葡萄糖异构酶产生菌诱变育种时, 常筛选2-脱氧葡萄糖或(-D-葡萄糖肟缺陷的菌种, 可以降低培养基中20-66%的木糖添加量。 在葡萄糖异构酶的生产菌选育中，另一个值得注意的问题是金属离子的作用。鈷离子对产酶有促进作用，但是出于高果糖浆食用安全性及环境保护的考虑，其用量应该受到限制。过去曾经认为鈷离子对酶催化的异构化反应也有活化作用，但是进一步的研究工作已经证明，只要采用固定化整细胞，是否添加鈷离子对酶的活力并无影响。添加镁离子也能提高葡萄糖异构酶的的产量, 但是铜、锌、鎳、钙等离子及重金属离子会抑制产酶。 9.3.5 酶生物合成与微生物生长的关系 在微生物间歇培养过程中，大多数酶的生物合成都发生在指数生长阶段的后期或稳定期，特别是胞外酶，如枯草杆菌产生的淀粉酶等。但是也有例外，如米曲霉生产的淀粉酶、弧菌SA1生产的蛋白酶等在微生物的指数生长阶段就会产生，因此只有这类微生物才适合于在恒化器中连续生产。 9. 4 酶蛋白的释放 如前所述, 微生物产生的水解酶都能释放到胞外, 因此水解酶通常有较高的产量, 也便于酶的分离和提纯, 从而降低了生产成本。对于众多的胞内酶而言, 酶蛋白在细胞内的大量积累肯定会引起产物抑制, 影响酶的产量, 而且胞内酶的分离提纯也非常困难。正因为如此, 酶蛋白释放的机理引起了人们的重视。通过对酶蛋白释放及其调控机理的研究, 已经证明强化蛋白质的释放不但能够增加本来是胞内酶的产量, 而且也能提高胞外酶的产量。研究酶蛋白的释放机理对改进基因工程蛋白质的释放也具有指导意义。 动物细胞的核糖体可以分为两类: 膜束缚的和游离的核糖体。但是细菌的核糖体紧密地堆积在一起, 又缺乏与动物细胞类似的内质网系统, 因此一直对细菌中是否有膜束缚核糖体存在怀疑。有人曾比较了两株特殊芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens产(-淀粉酶的情况, 发现多核糖体与细胞膜部分缔合的菌株比只含可溶性多核糖体的菌株产酶能力高5倍。用大肠杆菌生产碱性磷酸酯酶和其它蛋白质时也有类似的现象。新的研究工作已经证明, 各种细菌产生的碱性磷酸酯酶、(-淀粉酶、青霉素酶及白喉毒素等都是在膜束缚核糖体中合成的, 细胞质中的蛋白质, 延长因子G和F则是由大肠杆菌中的游离多核糖体所合成的。 细菌产生的蛋白质通过共翻译释放已经被放射性标记方法所证实。许多通过膜释放的酶蛋白链实际上是正在延长的多肽链, 链的起点在附着于细菌原生质膜的核糖体上。推动很大的亲水蛋白质分子通过膜是由以下四种机理实现的: 1)附着在膜上的核糖体为蛋白质链的伸长提供了推动力；2)已经在膜外的亲水蛋白质链卷曲所产生的力将膜内的剩余部分拉到了膜外；3)位于膜上的核糖体使所合成的肽链直接挺出到膜外；4)利用代谢能和有组织的膜结构将肽链送到膜外。 蛋白质共翻译释放的必要条件是核糖体与细胞膜发生缔合, 为此提出了”信号肽”假设并得到了实验证实。根据信号肽理论, 核糖体在mRNA的引导下到达细胞膜的特定位置。对蛋白质释放到胞外起关键作用的是mRNA, 它的5’端有一个约75个碱基组成的延伸段, 该延伸段翻译得到的肽分子就称为信号肽, 当它在核糖体中形成后, 就能够辩识膜上的受体蛋白(大肠杆菌外膜上的受体蛋白有：脂蛋白，(受体蛋白及周质体蛋白等)，促使核糖体与受体蛋白结合并形成一个蛋白质释放的通道。信号肽的长度为16-25个氨基酸残基, 其中以疏水性氨基酸占多数以利于与膜的结合, 各种微生物来源的信号肽氨基酸序列变化很大，尚无一般规律可以遵循。 对于杆菌释放到胞外的蛋白质, 胞内首先合成的是带有一段信号肽的蛋白质前体, 在前体蛋白质的释放过程中或释放到胞外后, 信号肽脱落, 使蛋白质具有正确的构型和生物活性。已经在内质网膜上分离鉴别到了将信号肽从前体蛋白质切下的信号酶(Signalase)。通过对Bacillus licheniformis中青霉素酶生物合成和释放过程的深入研究, 充分证实了信号肽的存在是细菌所合成酶蛋白释放的普遍规律。图9.4.1显示了在信号肽引导下的蛋白质释放过程。 在真核微生物中所产生的酶蛋白释放过程要复杂得多。胞内合成的蛋白质首先释放到粗內质膜空间, 随后转移到光滑内质膜, 再进一步释放到液泡。酶蛋白在液泡中积累, 与高尔基体融合后通过高尔基室进入释放液泡。在释放液泡中酶蛋白缩合形成酶原, 在Ca2+存在下与原生质体膜融合。经过以上过程后, 酶蛋白就能够释放到细胞外。有些真核微生物没有高尔基体或粗糙内质网, 因此蛋白质的释放途径会有所不同。  图9.4.1 信号肽引导下酶蛋白释放示意图 a.信号肽合成; b. 信号肽与膜上的受体蛋白结合; c. 信号肽脱落, 部分翻译好的酶蛋白释放到胞外; d. 翻译好的酶蛋白继续释放到胞外 e. 酶蛋白的翻译结束, 酶蛋白全部释放到胞外 虽然对细菌酶蛋白的释放机理已经进行了许多研究, 但是细胞是否对释放过程进行调节和控制及怎样进行控制还知之甚少。从对B. licheniformis产生青霉素酶的研究中得知, 周质体蛋白酶的活性对调节青霉素酶的释放起着重要作用；Gram阳性菌所产的胞外酶在释放前会在胞内积累, 酶的释放是被动扩散过程, 因此无法予以控制；Gram阴性菌所产生的酶蛋白受到外膜的拦截而留在周质体中, 但是也有例外, Serratia mardescens产生的外脂肪酶(Exolipase)就能够释放到胞外。当存在某些胞外多糖时, 由于空间排斥作用或构型变化而使外脂肪酶从膜上的脱离过程得到强化, 因此能增加这种酶的产量。 对真菌产生的胞外酶释放过程的调控机理研究较少, 但是有人认为真菌细胞酶的释放是产酶的速率控制步骤, 因此如能采用诱变育种获得原生质膜及细胞壁结构发生了突变的菌株, 就能够大幅度提高酶的产量。这种假设已经得到了一些实验数据的支持, 例如镰胞菌Fusarium产生的杀真菌素(Kabicidin)抗性突变株，它的细胞壁表面结构与出发菌株比发生了很大变化, 从而大大提高了释放到胞外的碱性蛋白酶产量。在培养基中添加表面活性剂也会影响细胞壁的组成和结构, 因此若使用得当也能大幅度提高胞外酶产量, 一个典型例子是在黄胞原毛平革菌的培养液中若不加吐温-80, 深层培养时几乎检测不到木素过氧化物酶的活性, 添加了吐温-80后酶活可以达到400U/L以上。 9.5 应用基因重组技术获得酶制剂的生产菌种 基因重组技术在酶的生产中具有特别重要的意义。因为酶是蛋白质，因此只要找到负责该蛋白质编码的DNA片段，将其整合到适当的质粒中，再转入宿主细胞，就可以通过培养宿主细胞获得所需要的酶产品。许多重要的酶制剂生产菌都已经采用基因重组技术代替传统的诱变育种方法，例如：(-半乳糖苷酶、青霉素酰化酶、天冬氨酸转氨甲酰酶、氯霉素转乙酰酶及苯丙氨酸合成酶等的生产已经部分应用了基因工程菌。 基因工程还为改变酶蛋白的结构和功能开辟了广阔的应用前景。近年来蛋白质工程的研究进展已经积累了大量关于蛋白质结构和功能关系方面的知识，这样就有可能采用点突变等方法获得性质更稳定、反应速率更快、反应的专一性更好、并使底物和抑制物的亲和性得到改变的新型酶蛋白。 通过X-射线结晶谱、光谱及电子自旋共振谱的研究，可以获得酶蛋白的三维结构，然后通过研究酶-底物的相互作用或与类似蛋白质的比较，再在计算机上模拟选出蛋白质结构中的关键氨基酸，这样就可以根据需要改变基因编码获得新的酶蛋白。常规的诱变育种方法不可能做到使某一个特定的氨基酸编码发生突变，例如酪氨酸的基因编码是UAC，每次传代后其中一个字符发生突变的概率是10-8，两个字符突变的概率更小，只有10-16，而且单字符突变产生的氨基酸有：AAC（天冬酰氨）、GAC（天冬氨酸）、CAC（组氨酸）、UCC（丝氨酸）、UUC（苯丙氨酸）、UGC（胱氨酸）、UAA（终止符）、UAG（终止符）及UAU（酪氨酸）等九种可能性。因此传统的诱变育种不可能使突变按照主观意志得到所希望的点突变，只有用基因工程的方法才能将所需要的氨基酸精确地插入酶蛋白结构中的指定位置。 点突变的方法如图9.3.1所示。目的是将原蛋白质第73位上的缬氨酸（编码为GTA）用异亮氨酸（ATA）代替。第一步是将该蛋白质的基因克隆到单股的DNA载体M13；第二步是化学合成与该DNA基本上互补、但缬氨酸被异亮氨酸代替的基因片段（一般为18个氨基酸）；第三步加入DNA合成酶完成双股DNA的合成；第四步是进行质粒的扩增；最后一步是将质粒转入宿主细胞。该质粒所表达蛋白质产品的第73位氨基酸已经从原来的缬氨酸变成了异亮氨酸。  图9.5.1 基因点突变的步骤  图9.5.2 含葡萄糖异构酶(GI)基因的质粒构建 例9.5.1 生产葡萄糖异构酶的质粒构建和基因工程大肠杆菌 在野生型大肠杆菌中, 每个染色体只含有一个葡萄糖异构酶基因的拷贝, 因此葡萄糖异构酶的产量很低。构建含葡萄糖异构酶基因的质粒包括如下步骤: 大肠杆菌K37中提取DNA; 用嗜血流感病毒(Haemophilus influenzae)Hind III切割提取的DNA, 获得含葡萄糖异构酶(GI)基因的DNA片段; 将所得到的DNA片段重组到含四环素抗性标记的pM89质粒; 将构建的质粒转入葡萄糖异构酶缺陷型宿主细胞E. coli K12(JC1553); 培养基因工程大肠杆菌, 发现产酶水平比野生型菌株提高了5倍。 上述过程图解地示于图9.5.2 例9.5.2青霉素酰化酶的生产 青霉素酰化酶是一种重要的工业用酶, 催化青霉素G水解生成苯乙酸和6-氨基青酶烷酸的反应, 后者是生产半合成抗生素的原料。霉菌(如青霉, 曲霉及木霉族中的一些种)生产的青霉素酰化酶属于类型I酰化酶, 只能催化青霉素V的水解, 工业上用途不大; 细菌(如大肠杆菌, 假单胞菌及微球菌等)产生类型II酰化酶, 工业上用于青霉素G水解。下面以大肠杆菌生产青霉素酰化酶为例对该酶产生的调节机理及生产方法加以说明。 大肠杆菌生产青霉素酰化酶的能力受到葡萄糖的分解代谢阻遏和苯乙酸的诱导, 同时还受到高氧分压的阻遏。因此可以采用筛选分解代谢抗性突变株, 改变碳源及在培养方法上应用流加后连续培养的方法使培养基中的葡萄糖浓度保持在较低水平。接种后第8小时起流加经灭菌的0.1%苯乙酸氨溶液13个小时直到培养结束, 培养时保持pH7.0, 温度240C和适当的氧分压, 即可提高青霉素酰化酶的活性。 Mayer等人应用DNA重组技术，将含青霉素酰化酶的基因克隆到一个多拷贝质粒后转入大肠杆菌，大大增加了含青霉素酰化酶质粒的拷贝数，从而提高了青霉素酰化酶的生产水平。与野生型菌株相比，在不加诱导剂的条件下，基因工程菌5 K pHM6产青霉素酰化酶的比活提高了28倍,加诱导剂后比野生型菌株产酶水平也可以提高约6倍, 结果见表9.5.1。从表中也可以看到, 同为基因工程菌的产酶能力也会有较大的变化。 表9.5.1 基因工程大肠杆菌产青霉素酰化酶能力与野生菌的比较 大肠杆菌 青霉素酰化酶相对酶活   不加苯乙酸氨诱导 加苯乙酸氨诱导  野生型菌株 ATCC11105 1.0 6.0   基因工程菌 5 K pHM6 28.0 35.0   5 K pKM7  22.0   5 K pHM8  18.0   5 K pHM11  14.0