第六章 生产溶剂和有机酸的微生物 溶剂和有机酸都是微生物的初级代谢产物，与工业生产和人们日常生活有着十分密切的关系，也是发酵工业中历史最悠久、吨位最大、价格最低的产品。自五十年代以来，有机酸和溶剂发酵工业受到了来自石油化工的竞争，但是由于它们的原料是可再生的生物质资源(如淀粉、纤维素等)，与化学合成产物相比，发酵获得的产品更适用于食品、医药等工业部门，加上在微生物育种和生产工艺方面的进步，这些传统的发酵工业仍具有强大的生命力。 6.1简要的历史回顾 人类利用微生物生产饮料酒和食用醋的历史几乎与人类自身的历史同样古老，有记录的酿酒历史可以追溯到公元前2000年以前，我国在郑州附近商代遗址出土的窖藏酒说明我国的劳动人们早在商代就掌握了酿酒技术。蒸馏酒精大约出现在十二世纪并首次用于饮料之外的用途，先是作为溶剂，然后用于医药。无水酒精出现在1796年。到十九世纪末，酒精已经广泛用于化学工业。五十年代石油化工的发展虽然对酒精发酵工业造成了威胁，但是由于酒精发酵工业有丰富、廉价、而且可再生的原料来源，由于在发酵工艺及酒精蒸馏技术上的改进及发酵酒精在饮料酒生产中不可替代的地位，由于无水酒精作为提高汽油辛烷值的无公害添加剂用途的开发，酒精发酵工业不但没有被石油化工挤垮，反而逐渐收复了失地。以石油化工最发达的美国为例，在五、六十年代酒精发酵工业几乎被石油化工所取代，但是目前每年生产的二百万吨酒精中，发酵酒精的比例已经超过了90%。 二十世纪初，生物技术发展历史中具有里程碑意义的丙酮/丁醇发酵投入了工业化生产。这是人类第一次用人工筛选的微生物采用发酵法生产的化学品。早在1862年，法国微生物学家Pasteur就开始研究从乳酸和乳酸钙生产丁醇，随后，波兰人Prazmowski将用于该过程的厌氧微生物命名为Clostridium。直到1905年Schardinger才发现这种微生物除了能产生丁醇外还产生丙酮。1912年Weizmann分离得到了Clostridium acetobutylicum，证明该菌能将淀粉转化为丙酮、丁醇和乙醇并申请了英国专利。1914年爆发了第一次世界大战，出于战争对火药的需要，迫切需要大量的丙酮，于是Strange & Graham公司开始建厂，试图生产丙酮，但是没有获得成功。然后Weizmann接管了该工厂，并按他自己的方法成功地生产出了丙酮和丁醇。由于当时还没有发现丁醇的适当用途，产量是丙酮一倍的丁醇就成了问题。战后，DuPont公司发明了从丁醇生产乙酸丁酯的方法并大量用于汽车工业用油漆的生产，从此丙酮/丁醇发酵进入了黄金时期，到1940年，丙酮和丁醇的产量分别达到了4.5万吨和9万吨。以后，由于来自石油化工的竞争，各国的丙酮/丁醇发酵工业在五、六十年代纷纷停止了生产，目前只有在中国和南非还有少量生产厂。 乳酸是另一种历史悠久的微生物发酵产物，酸奶可能是人类的第一个发酵食品，而且一直沿用至今。1780年瑞士化学家Scheele从酸奶中分离出了乳酸，1847年Bloudeau证明了乳酸是乳酸杆菌发酵的最终产物。1881年，Avery首先在美国实现了乳酸发酵的工业化生产。乳酸对碳源的利用率高，葡萄糖对乳酸的理论转化率是100%，实际转化率也达到了90%以上，因此生产成本底廉。今天，乳酸不但在食品、制革和医药等工业部门广泛应用，而且由于乳酸的聚合物或共聚物是可以生物降解的高分子材料，已经在生物医药工程和包装材料领域中得到了应用，具有广阔的市场。有人预料，乳酸将成为产量最大的30种有机化学品之一。 柠檬酸原来是从柠檬中分离得到的，主要应用于食品工业和洗涤剂, 意大利人曾经控制了世界的柠檬酸生产。1883年，Wehmer发现一种青霉能够积累柠檬酸，但是他的工业化企图却以失败而告终。1917年，Currie发现了一株产柠檬酸的黑曲霉，并通过美国的Pfizer(辉瑞)公司于1923年采用浅盘发酵实现了工业化生产。柠檬酸液体深层发酵到五十年代初才获得成功，八十年代则开发成功了用正烷烃发酵生产柠檬酸的新工艺。柠檬酸不但是食品工业中最重要的酸味剂，而且是生产无磷洗涤剂的重要原料。目前从柠檬中提取柠檬酸已经完全被发酵工业所取代。葡萄糖酸发酵生产菌的发现和工业化发展历史几乎与柠檬酸平行；衣康酸发酵的工业化则要晚得多，在四十年代中期才出现浅盘发酵技术。一些本来采用发酵法生产的有机酸，如苹果酸、酒石酸、富马酸及琥珀酸等，现在已经改用酶法或者采用化学合成方法进行生产。 6.2溶剂发酵的微生物 6.2.1酒精发酵的微生物 酒精是产量最大的发酵工业产品，酒精发酵的主要原料是各种糖类物质。由于酒精的价格低廉, 因此微生物对原料的利用率、酒精产率及生产过程的能耗就成了酒精工业的关键因素, 这样用于酒精发酵的微生物应该符合如下要求：产物酒精相对于所利用底物的转化率高、发酵速度快、对酒精的耐受力强、能够在较高的温度及偏酸性的pH条件下发酵、对底物的适应范围广等。最重要的酒精发酵微生物可以分为以下三大类：代谢葡萄糖的酵母、代谢葡萄糖的细菌及代谢木糖的酵母。 6.2.1.1葡萄糖发酵生产酒精的酵母 葡萄糖的代谢途径为酵解或称为Embden-Meyerhof途径。属于厌氧(微耗氧)发酵，理论产率为每一分子葡萄糖产生各两分子的乙醇、CO2及ATP，或每克葡萄糖生产0.51克乙醇，实际产率一般能达到理论产率的90%以上。常用的酵母品种有：啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、葡萄汁酵母(S. uvarum 或称为S. carlsbergensis)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)及Kluyverromyces等。上述酵母均属兼性厌氧菌，在酵母生长期需要一定的氧气，在酒精发酵阶段则需要厌氧条件以提高酒精产率。 产物酒精会对酒精生产和酵母生长产生抑制作用，不同的酵母耐酒精能力也有很大的差别。对大多数酵母而言，当酒精浓度达到5%时就会停止生长，当酒精浓度从6%增加到12%时，酒精生产速率逐渐减为零。某些耐酒精酵母的酒精浓度能够达到18%, 发酵醪中高浓度酒精有利于降低酒精蒸馏时的能耗。 酒精发酵是一个放热过程, 普通啤酒酵母的最适发酵温度为300C, 因此在发酵罐中需要通冷却水以保持发酵温度在300C左右, 为此需消耗大量能量。一些研究者选育得到的高温酵母的最适发酵温度可以达到40-500C, 适合于气温较高地区的酒精发酵工业。 酵母一般只能利用葡萄糖作为碳源,不能直接利用淀粉。在利用淀粉为原料时,必须先将淀粉采用酶法或酸法水解为葡萄糖,增加了酒精生产时的原材料消耗和能耗。因此,选育能够直接代谢淀粉的酵母也将有利于降低酒精的生产成本。 6.2.1.2葡萄糖发酵生产酒精的细菌 许多细菌也能代谢葡萄糖生产酒精，同时还会产生其它醇、有机酸、酮等副产物及各种气体。能够从每摩尔葡萄糖发酵产生一摩尔以上酒精的细菌见表6.2.1，其中最有实际应用价值的是运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis。它的生长速率、底物消耗速率、产物生成速率都高于酵母发酵，而细胞产率则低于酵母，因此具有较高的乙醇产率。Z. mobilis与葡萄汁酵母间歇发酵的比较见表6.2.2,可以看到该细菌的发酵速率大于酵母, 而乙醇产率要比酵母高6%以上。在细菌发酵时，葡萄糖的代谢途径除Embden-Meyerhoff(EM)途径外，还有Entner-Doudorof(ED)途径。在ED途径中，葡萄糖磷酸化后被氧化为6-磷酸葡萄糖酸，随后脱水生成2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖（KDPG），再在KDPG-缩醛酶的作用下切断。总反应是一摩尔葡萄糖生成各二摩尔乙醇和CO2, 并产生一摩尔ATP。 表6.2.1 以乙醇为主要发酵产物的细菌 中温菌 Y 嗜温菌 Y  芽孢杆菌 Clostridium sphenoides 1.8 耐热厌氧菌 Thermoanaerobacter ethanolicus 1.9  运动发酵单胞菌 Zymomonas mobilis 1.9 芽孢杆菌 C. thermohydrosulfuricum 1.8  螺旋体菌 Spirochaeta aurantia 1.5 芽孢杆菌 C. thermocellum 1.0  解淀粉杆菌 Erwinia amylovora 1.2 杆菌 Bacillus stearothermophilus 1.0  明串珠菌 Leuconostoe mesenteroides 1.1 耐热厌氧菌 Thermoanaerobium brockit 0.95  注:Y的单位是mol乙醇/mol葡萄糖 表6.2.2 Z. mobilis和S. uvarum不通气间歇发酵结果的比较 （初始葡萄糖浓度为250g/L, 30oC, pH5.0） 动力学参数 Z. mobilis S. uvarum  比生长速率, 1/h 0.13 0.055  比葡萄糖消耗速率, qS(gg-1h-1) 5.5 2.1  比乙醇产生速率, qP(gg-1h-1) 2.5 0.87  细胞产率, YX/S(gg-1) 0.019 0.033  乙醇产率, YP/S(gg-1) 0.47 0.44  相对乙醇产率(%) 92.5 86  最大乙醇浓度(g/L) 102 108   图6.2.1 在产气气杆菌中戊糖和戊糖醇的代谢途径 6.2.2.3戊糖发酵生产酒精的微生物 在木质纤维素中，半纤维素的含量约占20-40%，半纤维素的水解产物是以木糖为主的戊糖，因此木糖发酵就成了综合利用可再生生物质资源的关键。自七十年代以来，利用微生物发酵从木糖生产酒精的研究工作从未间断并取得了很大的进展, 发现了许多能够发酵木糖生产酒精的微生物。它们中既有细菌也有酵母和霉菌。 图6.2.1说明了在产气气杆菌中戊糖和戊糖醇的三条不同的代谢途径：1）由异构酶催化的醛糖异构化反应将醛糖转化为酮糖,然后磷酸化；2）通过脱氢酶催化的氧化还原反应将戊糖醇转化为戊酮糖然后磷酸化；3）由磷酸激酶催化戊糖直接磷酸化。所得到的D-木酮糖-5-磷酸及D-核糖-5-磷酸必须经过D-景天庚糖-7-磷酸, 赤藓糖-4-磷酸和D-甘油醛-3-磷酸途径形成果糖-6-磷酸, 随后进入糖酵解途径。图6.2.2则显示了酵母中的戊糖和戊糖醇的代谢途径。虽然酵母中也存在木糖异构酶, 但是戊糖的代谢主要通过氧化-还原反应途径进行。  图6.2.2 酵母中戊糖和戊糖醇的代谢途径 发酵木糖生产酒精的细菌主要有：Aeromonas hydrophila, Bacillus polymyxa, Aerobacter indologens 等，但是它们在产生酒精的同时还会产生2，3-丁二醇和各种有机酸等发酵副产物, 从而影响酒精的得率。表6.2.3显示了这三种细菌发酵葡萄糖和木糖时的产物分布，从表中可以看到，产物的分布比较分散，乙醇的转化率比较低。 Bacillus macerans等也能够发酵木糖，主要产物是酒精、CO2、H2、乙酸和丙酮，但能够利用的木糖浓度只有约1%。厌氧嗜热菌Clostridium thermosaccharolyticum及混合培养的C. thermocellum和C. thermosaccharolyticum能够直接利用纤维素和半纤维素生产酒精、乳酸和乙酸，其中后者可以从一克纤维素生产0.57克酒精。 能够利用木糖生产酒精的酵母见表6.2.4。其中研究得最多的是属于管囊酵母(Pachysolen)、假丝酵母(Candida)和毕赤酵母(Pichia)属的一些种，它们发酵木糖生产酒精的一些典型数据见表6.2.5。可以看到，假丝酵母和毕赤酵母的发酵速率、酒精浓度和酒精产率都比管囊酵母要高得多, 是利用木糖生产酒精的较理想菌种, 目前国内外都已经有应用这两种酵母以亚硫酸纸浆废液中的木糖为碳源发酵生产酒精的工业化生产报道。与利用葡萄糖进行啤酒酵母酒精发酵相比, 木糖发酵生产酒精的过程发酵速率低、酵母对酒精的耐受力差, 而且发酵过程必须在微溶氧的条件下进行。 表6.2.3 三种细菌利用葡萄糖和木糖发酵时的产物分布（产物mol/100mol糖） 发酵产物 A． hydrophila  B．polymyxa  A．indologenes    葡萄糖 木糖 葡萄糖 木糖 葡萄糖 木糖  2，3-丁二醇 54．7 39．0 65．1 38．0 64．1 44．0  3-羟基丁酮 1．7 2．6 2．8 2．5 0．7 0．9  乙醇 52．0 48．9 66．2 63．0 66．6 55．9  乙酸 4．6 9．3 2．9 7．7 1．0 11．4  甲酸 -- -- -- -- 27．9 26．3  丁二酸 3．6 1．1 -- -- -- 5．5  乳酸 23．3 20．4 -- -- 3．0 5．2  CO2 166．2 134．7 199．6 161．0 153．0 114．1  H2 57．5 70．9 70．9 82．0 27．6 19．1  碳转化率（%） 98．2 96．6 101．6 92．9 97．0 98．5   表6.2.4 木糖发酵生产酒精的酵母及产酒精和木糖醇能力 酵母 酒精（g/L） 木糖醇(g/L)  酒香酵母, Brettanomyces naardenensis CBS6041  1.8   假丝酵母, Candida guilliermondii  2.5    C. shehatae CBS 5813  6.5    C. shehatae CSIR 57D1  20.6    C. shehatae Y12856  24.0  0.2   C. tenuis CSIR-Y565  11.0  5.1  Kluyveromyces sp. KY5199  4.4   K. cellobiovorus KY5199  27.0  22.0  管囊酵母, Pachysolen tannophilus CBS 6857  2.1    P. tannophilus Y 246050  16.0   毕赤酵母, Pichia stipitis CBS 5773  5.9    P. stipitis 5Y-7124  20.0    P. stipitis CSIR-Y633  22.0   裂殖酵母, Schizosaccharomyces ATCC 20130  5.0  1.4   表6.2.5 三种酵母木糖发酵生产酒精的典型数据 酵母 浓度（g/L）   乙醇产生速率  产率（g/g木糖）    S0 SR Pmax R1,gL-1h-1 R2,gg-1h-1 木糖醇 乙醇  管囊酵母,P. tannophilus Y 2460 50 0 16 0.16 0.076 0.14 0.32   150 5 24 0.13 0.058 0.24 0.25  毕赤酵母,P. stipitis Y 7124 50 0 20 0.28 0.170 0.00 0.41   150 7 39 0.38 0.230 0.01 0.42  假丝酵母,C. shehatae Y 12856 50 0 29 0.29 0.190 0.02 0.45   150 25 32 0.32 0.160 0.03 0.44  S0—初始木糖浓度；SR—残糖浓度；Pmax—最高酒精浓度；R1—体积速率；R2—以干酵母计速率 表6.2.6 利用木糖发酵生产酒精的霉菌 微生物 S0,g/L Pmax,g/L 产率,g/g R1,gL-1h-1 周期,h 糖利用率,%  念珠菌Monilia sp. 50 10.0 0.20 0.06 168   毛霉Mucor 105 50 8.0 0.16 0.08 96 54  镰刀菌Fusarium lycopersici 50 16.0 0.32 0.17 96 100  镰刀菌F. oxysporum 50 25.0 0.50 0.17 144 100  链孢霉Neurosporum crassa 20 6.8 0.34 0.05 144    表6.2.6列出了能利用木糖发酵生产酒精的霉菌。从表中可以看到，有些霉菌发酵木糖生产酒精的转化率虽然较高，但是发酵周期很长, 没有什么实际应用价值。 近年来，代谢工程在利用木糖发酵生产酒精微生物中的应用发展很快，目的是实现葡萄糖和木糖的同时代谢、提高木糖的发酵速率及酒精的转化率。 6.2.2 甘油发酵 甘油是一种用途广泛的多元醇, 是日用化学工业的重要原料，又是制造硝化甘油类炸药的原料。甘油可以从油脂水解获得，但是不能满足需要，特别是在两次世界大战期间，用微生物发酵方法生产甘油曾经盛极一时。我国近年来在甘油发酵的研究和工业化方面取得了重要的进展。  图6.2.3 酵母细胞中甘油的生物合成途径和亚硫酸氢钠的调节作用 甘油的生物合成途径见图6.2.3。在用酵母发酵生产乙醇的过程中，总是伴随着生成少量甘油。如果改变发酵条件，就能够增加甘油的积累。主要的方法有： 阻遏乙醇的生物合成。在乙醇合成途经中，乙醛是重要中间产物。如果在培养基中加入亚硫酸钠，将与乙醛形成络合物，使乙醛不能转化为乙醇。同时，在葡萄糖酵解途径中产生的NADH2也就不消耗在从乙醛还原生成乙醇的反应中，转而用于甘油醛磷酸脱氢酶催化的从二羟基丙酮磷酸还原为甘油磷酸，甘油磷酸经过脱磷酸反应就得到了甘油， 在发酵液中加入碱式盐（如K2HPO4），使两个乙醛分子发生歧化反应形成各一分子的乙酸和乙醇，也可以使NADH2转用于甘油合成，促使甘油积累。 酵母发酵生产甘油一般要在高糖浓度（葡萄糖浓度为20-30%）下进行，发酵液的渗透压很高，因此应该选育耐高渗透压的酵母，如：Saccharomyces rouxii, Torulopsis magnoliae及Pichia farinosa等。 以葡萄糖为碳源, 酵母细胞中甘油合成的总反应式是: C6H12O6 C3H8O3 + CO2 + C2H4O 以色列科学家筛选了耐盐的藻类，如Dunaliella salina，用于甘油生产。这种藻类生长于盐湖，能够合成甘油作为胞内溶质以抗衡环境种高盐浓度引起的高渗透压。当环境中的盐浓度突然降低时，胞内的甘油就会释放到胞外。因此若在高盐浓度环境下在光生物反应器中培养Dunaliella salina，培养结束后离心分离出藻类细胞，再放到低盐培养基中经短期培养后，就能获得相当高浓度的甘油。 6.2.3 其它溶剂发酵 在上一节中，我们已经简要介绍了丙酮/丁醇发酵在发酵工业历史中的重要地位。用于丙酮/丁醇发酵的微生物都属于梭状芽孢杆菌(Clostridium)，比较典型的有：C.acetobutylicum, C.toanum, C.sacchrobutylacetonicum-liquefaciens, C.celerifactor及C.madisonii等。它们的共同特点是都属于厌氧菌，都能够形成真正的孢子，而且具有很强的生命力。最适温度和pH分别为26-320C及pH5.4-6.0。当以葡萄糖为碳源时，首先经EMP途径形成乙酰辅酶A，一部分脱羧生成丙酮，另一部分则还原形成丁醇。事实上，除了丙酮/丁醇外，还会产生其它有机酸和醇类。梭状芽孢杆菌发酵时还会产生CO2及H2等气体产物。三种梭状芽孢杆菌发酵产物的分布见表6.2.7。 从表中数据可以看到，丙酮丁醇梭状芽孢杆菌是最好的丙酮/丁醇生产菌种。在丙酮/丁醇发酵过程中，产物（特别是丁醇）对微生物的生长存在着严重的抑制作用，以至于发酵液最终的总溶剂浓度只有约20g/L。产物中丙酮/丁醇的比例受到发酵温度、发酵速率及氮源的影响，当发酵温度为320C、高稀释率及硫酸胺为氮源时有利于提高丁醇的产率。 表6.2.7 三种梭状芽孢杆菌的发酵产物分布 产物 产物产率，mmol产物/mmol葡萄糖     C.butylicum C.acetobutylicum C.butylicum  丁酸 76 4 17  乙酸 42 14 17  乙醇  7   丁醇  56 59  丙酮  22   异丙醇   12  3-羟基丙酮  6   二氧化碳 188 221 204  氢气 235 135 78  总碳利用率，% 96 100 96   用发酵法生产2，3-丁二醇在四十年代末受到了人们的重视，因为该产物经脱水反应就能够生产合成橡胶的原料1，3-丁二烯，但是由于石油化工提供了更经济的原料路线，发酵法生产2，3-丁二醇的过程始终没有实现工业化。近年来，由于可以利用木糖生产2，3-丁二醇并进一步用于生产甲乙酮作为提高汽油辛烷值的添加剂，对发酵法生产2，3-丁二醇的兴趣又在逐渐增加。 能够产生2，3-丁二醇的微生物很多，主要的有产气菌、塞氏菌及杆菌等, 如：Aerobacter, Aerobacillus, Aeromonas, Serratia及Bacillus，其中最重要的生产菌是：Aerobacter aerogenes, Aeromonas hydrophilia, B. polymyxa, B. subtilis和S. marcenscens。这些细菌中既有好氧的也有厌氧的，但是在微生物内合成2，3-丁二醇的途径都是通过乙酰辅酶A经2-羟基丁酮还原得到。好氧菌能够利用的碳源很广，不但能利用葡萄糖，而且能够利用木糖和甘露醇等。厌氧菌则只能利用葡萄糖。适宜的发酵温度和pH分别为300C及pH6.0。 表6.2.8及表6.2.9分别列出了用两种典型细菌发酵生产2，3-丁二醇的发酵产物分布。从表6.2.8可以看到B. polymyxa具有较强的同化葡萄糖和木糖的能力及较高的2，3-丁二醇产率。表6.2.9列出了同样属于S. marcenscens的四个不同菌株的产物分布, 可以看到不同菌株间存在很大的差异。从两个表中的数据比较得知，好氧和厌氧发酵的产物分布是不同的，主要原因是电子供体和受体不一样。另外从表中的产物分布也可以看到，发酵液中出2,3-丁二醇外还有很多副产物, 产物的分离将很困难。 表6.2.8 B. polymyxa,NRC25利用四种不同碳源好氧发酵的产物分布 葡萄糖, g 木糖, g 丙酮酸, g 甘露糖, g  发酵消耗原料量  5.21  4.20  1.28  2.04  发酵产物  2，3-丁二醇  1.70  0.96  ___  0.14  2-羟基丁酮  0.07  0.06  0.26  0.01  乙醇  0.88  0.81  ___  0.52  乙酸  0.05  0.13  0.46  0.13  CO2  2.54  1.99  0.61  0.73  H2  0.04  0.05  0.02  0.04  碳收率，% 101.6  92.9  93.0 106.8   表6.2.9 S. marcescens不同菌株厌氧发酵葡萄糖的产物分布 发酵产物 每消耗100mmol葡萄糖生成的产物mmol数   菌株1 菌株2 菌株3 菌株4  2，3-丁二醇  57.90  55.20  51.45  42.45  2-羟基丁酮  0.25  0.50  0.81  1.14  甘油  6.14  4.18  4.54  5.63  乙醇  40.85  41.30  42.24  25.90  乳酸  15.70  26.50  33.09  54.15  甲酸  48.50  44.00  39.80  27.60  琥珀酸  2.98  3.34  3.41  18.80  CO2  103.8  102.5  106.1  78.2  H2  0.0  0.0  0.52  0.27   6.3 柠檬酸发酵的微生物 能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉及葡萄孢霉中的一些菌株都能够利用淀粉质原料大量积累柠檬酸；节杆菌、放线菌及假丝酵母则能够利用正烷烃为碳源生产柠檬酸。真正用于工业生产的是利用淀粉的黑曲霉及利用正烷烃的假丝酵母。 6.3.1利用淀粉作为碳源发酵生产柠檬酸的黑曲霉 柠檬酸是三羧酸循环中的一种有机酸，以葡萄糖为碳源利用黑曲霉发酵生产柠檬酸的代谢途径已经很清楚，图6.3.1显示了代谢途径和调节机理。该代谢途径中第一个调节酶是磷酸果糖激酶（PFK），在极大多数真核生物细胞中，PFK受到柠檬酸的反馈抑制，细胞中柠檬酸的生理浓度只有约0.25mmol/L，但是在黑曲霉中，由于高强度通氧并在低镁离子浓度的条件下培养，PFK对柠檬酸不敏感。镁离子浓度还会影响细胞表面的生物化学和改变细胞壁磷酯的含量（见表6.3.1）。氧是柠檬酸发酵的理论底物之一，总反应式可写为： 葡萄糖 + 3/2 O2 = 柠檬酸 + 2 H2O 同时，在NADH重新氧化过程中还需要氧气作为底物，因此柠檬酸发酵需要高通氧强度。在黑曲霉中不但有标准的呼吸链，而且存在对水杨基氧肟酸（SHAM）敏感的呼吸支链。研究证明，只有在高氧强度下才能维持SHAM敏感的呼吸支链活性，该支链的功能是在细胞质中氧化NADH但不形成ATP。从图6.3.1可以看到，ATP是PFK的抑制剂，因此保持该支链活性对于降低ATP浓度、促进柠檬酸生产都是必须的。高浓度的胞内铵离子对解除柠檬酸的反馈调节也很重要，而且与镁离子的影响密切相关，已经发现在镁离子缺乏及供应充分的培养基中，铵离子的对PFK的影响存在很大差别，这可能与吐根碱和亚胺环己酮能够阻断镁离子的抑制功能有关。镁离子和铵离子对柠檬酸发酵的影响见表6.3.2。  图6.3.1 以葡萄糖为原料发酵生产柠檬酸的代谢途径和调节机理 + ——激活；- ——抑制 柠檬酸合成的第二个调节酶是丙酮酸激酶（PK），PK的调节机制尚不清楚，它对胞内代谢产物都不敏感，只有1，6-二磷酸果糖对它有激活作用，铵离子和钾离子也有激活作用，至今还没有发现对该酶有负调节作用的因素。在A. nigar中存在丙酮酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶对丙酮酸的竞争, 由于后者是结构酶，在生长开始时就已形成，因此在竞争中处于优势, 但对它的调节作用不明显。在A. nigar中也存在CO2的固定作用，由PEP羧激酶催化。 表6.3.1 镁离子对黑曲霉细胞壁组成的影响 细胞壁组成 不加镁离子 MgCl2.2H2O 0.1mg/L  (-葡聚糖 66．4 59．0  (-葡聚糖 7．0 18．2  几丁质 20．0 6．8  蛋白质 2．4 3．9  半乳甘露聚糖 半乳糖胺 3．7 12．8  脂类物质 0．5 0．5   表6.3.2 镁离子和铵离子对柠檬酸发酵的影响 因素 镁缺乏 镁充分  NH4+ 15mM 3mM  柠檬酸 4mM 1mM  PFK酶活（任意单位） 1.1 1.0   柠檬酸的合成发生在TCA循环中，由柠檬酸合成酶催化。对柠檬酸能在A. nigar中积累的机理曾提出过一些不同的看法。有人认为是A. nigar中缺少乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶，但以后有人从A. nigar中分离得到了这两种酶，而且进一步确定了乌头酸水合酶存在于线粒体中，它催化的反应存在着柠檬酸：异柠檬酸：顺式乌头酸 = 90：7：3的平衡关系；同时还发现在A. nigar中对辅酶NAD+专一性的异柠檬酸脱氢酶活力很低，却有三种依赖于辅酶NADP+的异柠檬酸脱氢酶，其中的两种与存在于线粒体的酶及TCA循环有关，它们受到生理浓度柠檬酸的抑制。这一现象可以解释为什么在A. nigar中异柠檬酸不会进一步分解及柠檬酸的积累机制。在A. nigar中还发现了高浓度葡萄糖和铵离子对(-酮戊二酸脱氢酶的阻遏作用，该酶催化TCA循环中唯一的不可逆反应。TCA循环中的二羧酸部分只有琥珀酸脱氢酶受到低浓度草酰乙酸的强烈抑制，从而防止了柠檬酸分解为草酰乙酸的反应，促进了柠檬酸积累。其它酶似乎不受代谢调节，只是受到底物和产物的控制。 总之，在A. nigar发酵生产柠檬酸的过程中，应该保持高底物浓度、高铵离子浓度、高通氧强度及低镁离子浓度、低磷酸盐浓度，发酵的温度应在28-350C的范围内，pH调节到2.2-2.6之间。在上述条件下，从葡萄糖生产柠檬酸的转化率可以达到理论转化率的90%以上。在柠檬酸发酵中，国外一般采用糖蜜或淀粉水解的葡萄糖作为原料。我国的微生物工作者根据中国的国情及A. nigar能够产生淀粉酶的特点，成功地选育了能够直接利用淀粉质粗原料(如薯干粉及玉米粉等)发酵生产柠檬酸的高产菌种，并用于大规模工业化生产，降低了生产成本, 取得了良好的效果。 6.3.2 利用烷烃生产柠檬酸的假丝酵母 1963年，Yamada等人发现棒状杆菌(Corynebacteria)能够利用正烷烃为碳源生产谷氨酸，几乎同时，日本的发酵工业界也开始了从正烷烃为碳源生产柠檬酸的研究和开发，并发现假丝酵母是符合要求的微生物。在假丝酵母中，正烷烃首先被氧化为脂肪酸，随后脂肪酸进一步经(-氧化生成乙酰辅酶A进入TCA循环，为了补充草酰乙酸，还存在一个额外的乙醛酸循环。 假丝酵母利用正烷烃生产柠檬酸过程的代谢调节机理至今仍不清楚，但发酵过程具有以下一些特点：1）发酵分为两个阶段，第一阶段只生长酵母，只有当培养基中的氮源消耗完以后才开始积累柠檬酸；2）发酵液的pH值应保持在pH5以上；3）高铁离子浓度会增加乌头酸水合酶的活性，引起柠檬酸产量减少；4）产物中异柠檬酸的比例很高，甚至达到50%，通过各种诱变育种及添加乌头酸水合酶抑制剂（如氮氟乙酸、2，4-二硝基苯酚及某些醇类）可以降低异柠檬酸的比例，但仍高于黑曲霉葡萄糖发酵生产柠檬酸的过程。 七十年代初，假丝酵母利用正烷烃生产柠檬酸过程首先在日本实现了工业化生产，并将该技术输出到美国和欧洲。但是由于七十年代中期出现了石油危机及过程本身存在的缺点，该过程很快就停止了工业化生产。 6.4 乳酸发酵的微生物 以葡萄糖为原料进行乳酸发酵的代谢途径有三条：属于同型发酵(Homofermentation)的糖酵解途径、属于异型发酵(Heterofermentation)的分叉代谢途径和6-磷酸葡萄糖酸途径。具体的代谢途径见图6.4.1。大多数同型乳酸发酵的微生物都不具有脱羧酶，因此不会发生丙酮酸脱羧生成乙醛的反应。从图中可以看到，微生物经同型代谢途径生产乳酸时，乳酸是唯一产物，理论产率是一分子葡萄糖生产二分子乳酸，或转化率为100%。当然微生物的生长和维持能要消耗糖，一些副产物，如乙酸、甲酸、乙醇及CO2的形成需要从糖转化得到, 因此实际产率不可能达到100%。一般而言，如果乳酸的产率达到理论产率的80%以上就可以认为是同型发酵。在异型发酵中，副产物乙酸的产量要高得多，几乎与乳酸等摩尔，但也有例外，如：用米根霉(Rhizopus oryzae)生产L-乳酸属于异型发酵，但是乳酸的转化率能达到75%以上。  图6.4.1葡萄糖发酵生产乳酸的三种代谢途径 乳酸分子中有一个不对称碳原子，微生物细胞中可能含有D-或L-乳酸脱氢酶或两者都有，因此乳酸发酵的产物有右旋型L(+)-、左旋型D(-)-及消旋型DL-乳酸三类。除了在植物乳杆菌中发现同时存在D（-）和L（+）乳酸脱氢酶外，其它乳酸发酵微生物中其实都只有一种D（-）或L（-）乳酸脱氢酶，只是由于许多微生物中存在乳酸消旋酶将产生的L-或D-乳酸消旋型成了DL-乳酸。人类和动物体内只有L-乳酸脱氢酶，因此只能代谢L-乳酸。如果在食物中摄入过多的D-或DL-乳酸，就会造成体内D-乳酸的结累，引起高血酸或高尿酸症。为此，世界卫生组织（WHO）规定D-乳酸的摄入量应该低于100mg/(kg体重。日), 也有一些国家规定在婴儿食品中不能添加D-或DL-乳酸, 只能加L-乳酸。 一些主要的产乳酸细菌及其能够利用的糖类、产物分布、发酵温度及产乳酸类型列于表6、4、1，最重要生产DL-和L-乳酸的工业用发酵菌种分别是德氏乳酸杆菌和米根霉。乳酸杆菌发酵通常在厌氧条件下进行，乳酸杆菌一般不能在合成培养基中生长，培养介质中应含有碳源、氮源（部分应以氨基酸形式提供）、维生素（如叶酸、VB6、VB12等）、生物素和矿物盐。由于产生少量乳酸后就会使培养液的pH降低从而会抑制细胞生长（德氏乳酸杆菌的最适pH5.5-6.0, pH小于5.0时就受到抑制，小于pH4.0时会停止生长），因此培养基中必须连续添加CaCO3、NH3或其它碱性物质中和乳酸。 许多根霉(Rhizopus)都能够产生L-乳酸,如：R. nigricans, R. jarnaicus, R. shanghaiensis及R. elegans等，其中最重要的工业发酵用菌种属于米根霉(R. oryzae)属。米根霉的特点是：菌丝呈白色、匍匐状爬行；它有发达的假根，指状或根状分枝，呈褐色；孢囊梗直立或稍弯曲，2-4株呈束，很少单生；菌丝上形成厚垣孢子。米根霉的生长需要氧气，其发酵产物除L-乳酸外，还有乙醇、富马酸、琥珀酸、苹果酸及乙酸等，因此属于异型发酵，但是又不同于一般的异型发酵，在米根霉中乳酸和乙醇都是通过EMP途径，而且主要产物是L-乳酸。在氧供应充分时米根酶发酵生产乳酸和乙醇的计量关系式为： 2C6H12O6 = 3C3H6O3 + C2H5OH + CO2 根据该反应式，L-乳酸的理论产率应该是75%（重量）。在实际发酵过程中，米根霉产乳酸的产率会发生变化，经常有L-乳酸对葡萄糖的转化率超过75%的报道，说明实际发酵机理要比上式要复杂得多。米根霉本身具有较强的产淀粉酶能力，因此可以直接利用淀粉生产L-乳酸。 由于乳酸是一种较强的有机酸, 因此在培养基中一般需要加入碳酸钙中和所产生的乳酸。在工业发酵中, 固体碳酸钙的灭菌和添加都将发生困难。另外, 所生成的乳酸钙在水中的溶解度有限(室温是的溶解度约为7%), 限制了发酵液中乳酸浓度的提高。近年来对乳酸发酵和产物分离的耦合过程进行了许多研究, 所采用的分离方法有离子交换、电渗析及溶剂萃取等。 表6.4.1 一些主要的产乳酸细菌 细菌名称  碳源 温度,oC 主要产物 构型   乳 酸 杆 菌 L.delbruckii 葡萄糖、半乳糖等 50—53 乳酸 DL-   L.bulgaricus 葡萄糖,菊糖等 45—55 乳酸 DL-   L.thermophilus 葡萄糖等 50—60 乳酸 DL-   L.leichmannii 葡萄糖等 28—32 乳酸:乙酸=1:1 D-   L.casei 乳糖 28—32 乳酸 L-   L.fermenti 葡萄糖等 35—40 乳:乙:CO2=1:1:1 DL-  链 球 菌 S.thermophilus 葡萄糖、乳糖等 45—55 乳酸 DL-   S.lactis 葡萄糖、乳糖等 28—32 乳酸 L   S.faecalis 葡萄糖、乳糖等 28—32 乳酸 L  足球菌,Pediococcus  葡萄糖、麦芽糖 25—32 乳酸 DL-,L-  明串珠菌,Leuconostoc  葡萄糖、蔗糖等 21—25 乳酸 D-  双歧杆菌, Bifidobacterium  葡萄糖等 35—40 乳酸:乙酸=2:3 L   6.5 其它有机酸发酵 6.5.1 葡萄糖酸发酵 葡萄糖酸及其盐类广泛用于补钙剂、防垢剂及清洗剂等领域，可以用电化学氧化和发酵法生产。葡萄糖酸发酵实际上是一个产生葡萄糖氧化酶并利用该酶将葡萄糖氧化为(-葡萄糖酸内酯然后水解得到葡萄糖酸的过程。有趣的是，在四十年代初，还有不少人将葡萄糖氧化酶误认为是一种新发现的抗生素，并将其命名为青霉素B。事实上，是在葡萄糖存在时，葡萄糖氧化酶在将葡萄糖氧化为葡萄糖酸的同时产生了等摩尔的过氧化氢具有杀菌作用。从葡萄糖经葡萄糖酸内酯水解生成葡萄糖酸的生物合成途径见图6.5.2，由图可见，葡萄糖在FAD存在下被葡萄糖氧化酶催化生成葡萄糖酸内酯的同时，形成了等摩尔的过氧化氢。 许多细菌和霉菌都能够合成葡萄糖氧化酶，但是在细菌（如Acetobacter、Gluconobacter及Pseudomonas等）培养时，葡萄糖氧化酶存在于细胞内，所得到的葡萄糖酸还会进一步氧化形成各种氧代葡萄糖酸，再经磷酸化后回到碳水化合物的分解代谢途径，因此不能结累葡萄糖酸，只有经过诱变育种切断其后续代谢途径，才能获得较高的葡萄糖酸产量。而在霉菌（如Aspergillus niger几Penicillia notatum），因为葡萄糖氧化酶能够施放到发酵液中，所生成的葡萄糖酸不会继续反应，从而能在发酵液中结累。  图6.5.1葡萄糖酸生物合成途径 在用黑曲霉发酵生产葡萄糖酸的过程中，提高葡萄糖酸产量的要点是：1）高葡萄糖浓度（110-250g/L），葡萄糖一方面是细胞生长的碳源和能源，另一方面又是生产葡萄糖酸的底物，同时对产酶还有诱导作用；2）低氮源浓度，一般只才产孢子培养基中加入适量氮源，在孢子发芽及葡萄糖酸转化培养基中咳基本不加；3）低磷源浓度，特别法庭是在转化阶段，要控制磷源的浓度；4）足够的痕量元素，特别是镁离子，对酶的活力有很大影响；5）培养基的pH应控制在4.5-6.0的范围内，低于pH2.0时葡萄糖氧化酶就会失活，发酵的产物就会转化为柠檬酸；6）葡萄糖酸发酵的通氧强度要高，可以将罐压提高到0.4mPa，因为每生成一摩尔葡萄糖酸要消耗等摩尔的氧气，氧也是产酶的诱导剂。  图6.5.2 从葡萄糖发酵生产衣康酸的EMP途径  图6.5.3 三羧酸循环外的衣康酸生物合成途径 6.5.2衣康酸发酵 衣康酸(Itaconic acid)是一种不饱和的二元酸，分子式为CH2=C(COOH)-CH2-COOH，主要用于塑料工业和涂料工业,衣康酸和丙烯酰胺的共聚物具有良好的染色性能,因此广泛用于地毯制造。早在1929年就发现一种曲霉能够产生衣康酸，该曲霉命名为A.itaconicus，以后陆续发现了另一些能产生衣康酸的曲霉，如：A.terreus。个别酵母或细菌也具有产生衣康酸的能力，如：红酵母Rhodotorula及黑粉菌Ustilago zeae。在微生物中，一般认为衣康酸的代谢途径有两条,一条是通过Embden-Meyerhof-Parnas途径进行，见图6.5.2;另一条是从异柠檬酸出发,经过反式乌头酸脱羧得到,见图6.5.3。衣康酸对葡萄糖的重量产率在40-65%的范围内。 在衣康酸发酵时，培养液中铁、锌、钙、镁等金属离子对衣康酸的产量有教大影响，发酵液的pH保持在2.1左右时衣康酸的产率最高，发酵温度则应控制在370C。 6.5.3 其它有机酸发酵 其它用发酵法生产的有机酸列于表6.5.1。表中还列出了发酵的菌种、底物、发酵条件及转化率等数据。除表中所列的有机酸外，近年来对利用烃类发酵生产二元酸的过程也已经取得了进展，国内外都有工业化的报道。二元酸在香料工业、高分子材料等领域都有应用前景。 表6.5.1 微生物发酵生产的其它有机酸 有机酸 微生物 工业化 底物名称 过程特点 产率,% 用途  富马酸 根霉族 是 葡萄糖 3天,330C 65 高分子材料   假丝酵母 是 正烷烃 7天,300C 84   丙酸 丙酸菌 是 乳糖,葡萄 糖,淀粉 8-12天, 300C 60 香料、杀霉菌剂  苹果酸 假丝酵母 无 正烷烃 24小时 72 食品工业  ((酮戊二酸 假丝酵母 无 正烷烃 40小时 67   5-酮葡萄糖酸 气杆菌 是 葡萄糖 5-6天 85 L-酒石酸  2-酮葡萄糖酸 赛氏菌 是 葡萄糖 16小时 95-100 生产异Vc