2.5非细胞型微生物 2.5.1 病毒（Virus） 十九世纪末，已经分离得到了许多引起传染病的细菌，但对一些传染病如口蹄疫、烟草花叶病等却一直无法获得其病原细菌。1892年俄国学者伊万诺夫斯基（Ивановский）首次发现烟草花叶病的感染因子可以通过细菌滤器。1898年荷兰生物学家贝哲林克（M.W.Beijerinck）进一步肯定了伊万诺夫斯基的结果，并将这类感染因子称为病毒（Virus）。1935年，美国生物化学家斯坦莱(W.M.Stanley)从烟草花叶病灶中分离获得病毒结晶，后来又证明了结晶中只含有蛋白质和核酸两种成分。只有核酸具有感染疾病和复制的能力。 病毒是没有细胞结构，但具有遗传、变异等生命特征的一类微生物。其主要特征是： 个体极，能通过细菌滤器，需借助电子显微镜观察； 专性寄生，没有独立的代谢功能，只能在特定的宿主细胞内繁殖； 没有细胞结构，大多数病毒只是蛋白质和核酸组成的大分子，且只含单种核酸（DNA或RNA）； 繁殖方式是依靠宿主的代谢体系进行“复制”； 它对一般的抗生素不敏感，但对干扰素敏感。 总之，病毒是一类超显微、没有细胞结构、专性寄生的大分子微生物。它们在体外具有生物大分子的特征，只有在宿主体内才表现出生命特征。 病毒分布很广，几乎所有生物都可感染相应的病毒。通常可根据宿主将病毒分为三大类：动物病毒、植物病毒和细菌病毒（或称噬菌体）。已经鉴别的病毒数量正在急剧增加。从理论上分析，在自然界存在的病毒总数应大大高于一切细胞生物的总数。据文献报道统计，已经发现的人类病毒有300多种（1984年），脊椎动物病毒有931种（1981年），昆虫病毒有1671种（1990年），植物病毒有600余种（1983年），真菌病毒有近100种（1982年），至今已做过电镜观察的噬菌体至少有2850种或株（1987年）。 病毒寄生在活细胞内。因此，如果它的宿主是人或对人类有益的动植物和微生物，就会给人类带来巨大的损害；反之，如它的寄生的对象是对人类有害的动、植物和微生物，则会对人类有益。如今，病毒已成为分子生物学的主要研究对象和利用的重要工具之一。 2.5.1.1病毒的形态及构造 1) 病毒的大小和形态 绝大多数病毒是能通过细菌滤器的微小颗粒，因此必须借助于电子显微镜才能观察其具体形态和大小。测定病毒大小的单位是纳米（nm，10-9m)，多数病毒粒子的直径在100nm以下，见表2.5.1。图2.5.1 较形象地表示了病毒的大小和形态。 动物病毒多为球、卵或砖形。最大的是痘病毒(Poxvirus)，尺寸为200～350×200～250 nm，大小近似于最小的原核微生物——枝原体。用姬母萨、荧光染料或镀银等染色方法处理后，可以在光学显微镜下观察。最小的是口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)，直径仅10～22nm。相当于最大的蛋白质分子（血红素蛋白质）。 植物病毒多为杆、丝状，也有球状。较短的杆状病毒如苜蓿花叶病毒(Alfalfa mosaic virus)，长约58nm，较长的杆状病毒如甜菜黄叶病毒(Beet yellow mosaic virus)，长约1,250nm。 烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus)长300nm，直径15nm。 细菌病毒或称噬菌体（Phage），大多为蝌蚪状，也有微球形或丝状。从形态和核酸结构上可将噬菌体分为6个群，见表2.5.2。 表中所列的T-系噬菌体是研究得最广泛而又较深入的细菌病毒。按照发现的先后次序编号T1—T7。后来发现T偶数的噬菌体结构和化学组成相同，故统称为偶数噬菌体。它们的形态都为蝌蚪状。 表2.5.1 病毒的大小 类别 病毒 长× 宽或直径 （纳米 ）  动物病毒 痘病毒 家蚕细胞核型多角体病毒 疱疹病毒 大蚊红色病毒 新城疫病毒 腺病毒 流感病毒 鸡瘟病毒 家蚕细胞质型多角体病毒 多瘤病毒 脊髓灰质炎病毒 口蹄疫病毒 200～350×200～250 250～400×40～70 100～150 130 115 70～90 80～85 70～80 60 43 27～30 22  植物病毒 马铃薯Y病毒 马铃薯X病毒 烟草花叶病毒 黄瓜绿斑花叶病毒 萝卜花叶病毒 苜蓿花叶病毒 马铃薯黄矮病毒 番茄丛矮病毒 芜菁黄花叶病毒 烟草环斑病毒 黄瓜花叶病毒 750×12 520×10 300×15 280×16 120×25 58×18 110 30 26 26 22  噬菌体 大肠杆菌噬菌体T2、T4、T6 大肠杆菌噬菌体T1 大肠杆菌噬菌体T3 大肠杆菌噬菌体T5 大肠杆菌噬菌体T7 大肠杆菌噬菌体fd 大肠杆菌噬菌体f2 痢疾杆菌噬菌体 灰色放线菌噬菌体 分枝杆菌噬菌体 大肠杆菌噬菌体ΦX174 大肠杆菌噬菌体M13 头部90×60 尾部100×20 160×10 10×10 170×10 10×10 700×5 25 头部65～70 尾部150×- 150×15 80～90×35 160～190×20 直径20～30 长600～800    图2.5.1 病毒与细菌大小比较示意图 表2.5.2 六群噬菌体的形态及其核酸特征 群 核酸结构 描述 例子     大肠杆菌噬菌体 其它噬菌体  1 双链DNA 蝌蚪形收缩性长尾噬菌体：具六角头部及可收缩的尾部 T2、T4、T6 极毛杆菌属：12S,PB-1 芽胞杆菌属：SP50 粘球菌属：MX-1 沙门氏菌属：66t  2 双链DNA 蝌蚪形非收缩性长尾噬菌体：具六角头部及长的无尾鞘的不能收缩的尾部 T1 T5——多阶段感染 λ—温和噬菌体 极毛杆菌属：PB-2 棒状杆菌属：B 链霉菌属：K1  3 双链DNA 蝌蚪形非收缩性短尾噬菌体：具六角形头部和短而不能收缩的尾部 T3、 T7 极毛杆菌属：12B 土壤杆菌属：PR-1,001 芽孢杆菌属：GA/1 沙门氏菌属：P22  4 单链DNA 六角形大顶壳粒噬菌体：有六角形头部，六个顶角各有一个较大的壳粒，无尾部 ΦX174(环状DNA) S13 沙门氏菌属：ΦR  5 单链RNA 六角形小顶壳粒噬菌体：有六角形头部 F2 Qβ MS2 极毛杆菌属：7S,PP7 柄细菌属：  6 单链DNA 丝状噬菌体：无头部、 蜿蜒如丝， Fd F1 M13 极毛杆菌属   2) 化学组成 大多数病毒化学组成为核酸和蛋白质，少数较大的病毒还含有脂类和多糖等。脂类中磷脂占50～60%,其余则为胆固醇。多糖常以糖脂、糖蛋白形式存在。 （1）核酸 每种病毒只含单一类型的核酸（DNA或RNA）。动物病毒有的是DNA型，有的是RNA 型；植物病毒绝大多数属RNA型，少数为DNA型；噬菌体多数为DNA型，少数为RNA型。核酸有双链的和单链的。 含DNA 双链(double stranded) … 牛痘病毒 动物病毒 单链(single stranded) … 小鼠细小病毒 含RNA 双链 …呼肠弧病毒 单链 …脊髓灰质炎病毒 植物病毒 含RNA 双链 …水稻矮缩病毒 （大多含RNA） 单链 …烟草花叶病毒 含DNA 双链 …花椰菜花叶病毒 含DNA 双链 …大肠杆菌T系噬菌体 细菌病毒 单链 …大肠杆菌(X174，M13 含RNA 单链 …大肠杆菌f2噬菌体（5群） 大多数DNA病毒含开放式双链DNA，有的病毒则含开放或闭合单链DNA，还有些含闭合双链DNA或其中一链中断的开放式双链DNA；绝大多数RNA病毒含开放式单链 RNA。不同的病毒不仅核酸类型不同，而且含量也有较大的差异，如流感病毒的核酸仅占1%，烟草花叶病毒的核酸则占5%，而另一些病毒，如大肠杆菌T系偶数噬菌体的核酸含量高达50%以上。每个病毒的核酸含量与其结构的复杂性和功能有关。一个复杂的病毒往往需要更多的核酸（即更多的基因）。除极个别外，每个病毒粒子只含有一分子的核酸。对某种病毒来说，核酸的长度是一定的，由100(250,000个核苷酸组成。最小的病毒少于10个基因，最大的病毒有几百个基因。  图2.5.2两类病毒粒子的结构模式图 1.裸露病毒粒子；2.有被膜的病毒粒子 衣壳粒的排列组合方式不同，使病毒粒子表现出不同的构型和形状 （2）蛋白质 蛋白质是病毒的主要成分，它主要用于构成病毒的外壳，以保护病毒的核酸。病毒蛋白质外壳决定病毒感染的特异性，与易感细胞表面存在的受体有特异亲和力，能促进病毒粒子的吸附。病毒的蛋白质还决定其抗原性，会刺激机体产生相应的抗体。比较简单的植物病毒大都只含有一种蛋白质，其它病毒均含一种以上的蛋白质。一些病毒除含有结构蛋白质外，还含有少量的酶，如噬菌体的溶菌酶、核酸合成酶等。 3) 病毒的结构 许多病毒具有相同的结构形式。病毒的最小形态单位（蛋白组成的亚单位）——衣壳粒（Capsomere）。它由一种或几种多肽链折叠而成的蛋白质亚单位。衣壳粒以对称的方式，有规律地排列，构成病毒的蛋白质外壳，称衣壳（Capsid）。衣壳中包含病毒的核酸，即核髓。核髓和衣壳合称核衣壳，有的病毒的核衣壳裸露，有的病毒的核衣壳外还有被膜（Envelope）包围。完整的、具感染性的病毒颗粒称病毒粒子（Virion），见图2.5.2。 （1）二十面体病毒粒子衣壳粒沿着三根互相垂直的轴对称排列，形成二十面体。每个面是等边三角形，有三十条边和十二个顶角，见图2.5.3。腺病毒(Adenovirus)的衣壳是个典型的二十面体。共由252个球形的衣壳粒排列成一个有二十个面的对称体，其中240个衣壳粒是空心的。每个衣壳粒由多肽构成六边形，各个衣壳粒与六个衣壳粒相邻。位于二十面体顶角的十二个衣壳粒是由多肽构成的空心的五边形，各自与五个衣壳粒相邻。图2.5.4为腺病毒的电镜图片；脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)、多瘤病毒(Polyomavirus)和疱疹病毒粒子(Herpesvirus)分别由36、42（或72）和162个衣壳粒对称排列构成各自的二十面体。噬菌体(X174只有12个衣壳粒，也属于此类型。  图2.5.3 二十面体病毒粒子结构示意图 二十面体的几何对称轴。a. 五重对称轴；b.三重对称轴；c.双重对称轴； 2.腺病毒粒子，示252个衣壳粒中，有12个衣壳粒（五邻体X）位于顶角上，被五个相邻的衣壳粒围绕着，形成五角形聚集，另有240个衣壳粒（六邻体Y），位于边上或表面上，有六个相邻的衣壳粒围绕着，形成六角形聚集；3.疱疹病毒；4.多瘤病毒  图2.5.4 腺病毒的电子显微镜图片（X174,000） （2）螺旋体病毒粒子 这些病毒呈杆状或丝状。它们的衣壳似中空柱，衣壳粒与核酸呈螺旋对称排列。电子显微镜下可见其螺旋结构，内含核酸。如烟草花叶病毒的衣壳粒螺旋排列呈杆状，RNA位于衣壳内螺旋状沟中。病毒粒子全长300nm，直径15nm，由2,130个衣壳粒组成130个螺旋。每一圈螺旋有161/3个衣壳粒，每49个衣壳粒组成三圈螺旋，螺距2.3nm。RNA螺旋的直径为8nm，整个结构中心是一个直径为4nm的开放孔洞，见图2.5.5。每个衣壳粒的分子量为17,400 Da，RNA的分子量为2.06×106Da。整个病毒粒子的分子量用物理化学方法测得39(40×106 Da。已知RNA占5(6%，所以蛋白质衣壳的分子量为37(38×106 Da, 2,130个衣壳粒中的每一个的分子量为17,300±800 Da。 用碱或去垢剂可使烟草花叶病毒粒子降解成蛋白质和核酸两部分。在适宜的温度和离子强度下，这些因降解而产生的衣壳粒又可自发地重新组装成棒状的衣壳，与完整的病毒粒子衣壳无法区别，但由于不含核酸，因此无感染能力。如果衣壳粒重新装配时有核酸存在，则能引起烟草花叶病。  (a) (b) 图2.5.5烟草花叶病毒 病毒粒子电镜图片（X40,000）；(b)病毒RNA和衣壳粒排列模式图  (a) (b) 图2.5.6 大肠杆菌噬菌体T4 (a) 电镜图片（X220,000）；(b)模式图 (3) 有被膜的病毒粒子 有的病毒的核衣壳外有一层松散的被膜。被膜主要由蛋白质（常为糖蛋白）和脂类组成。核衣壳有的是二十面体，有的为螺旋体。如单纯疱疹病毒就是有被膜的二十面体。粘病毒也有被膜，螺旋状核衣壳盘绕在被膜内。 (4) 其它 大肠杆菌偶数噬菌体呈蝌蚪状，具有直径40(100nm的二十面体头部，在头部蛋白质外壳内，一条长约50nm的DNA分子折叠盘绕其中，还有一个长约100nm的螺旋对称尾部。尾部由不同于头部的蛋白质组成，外面包围着可收缩的尾鞘，中间为一空髓，即尾髓。有的噬菌体的尾部还有颈部、尾丝、基片和刺突，见图2.5.6。T1噬菌体的尾部不能收缩，T3噬菌体的尾部较短，噬菌体ΦΧ174只有头部，没有尾部。 痘病毒类是体积最大、结构最复杂的脊柱动物病毒。多数呈砖形，有的卵圆或扁平柱状。在电子显微镜下，没有明显的衣壳，但在病毒的核髓外有较复杂的脂蛋白外膜包围，最外层是双层的被膜。 弹状病毒（Rhabdovirus）因病毒粒子外形如子弹而得名，其被膜表面呈现横的条纹，核衣壳为螺旋对称。如狂犬病毒（Rabies virus）的核酸为单链RNA，衣壳粒以螺旋对称排列围绕着核酸，外包脂蛋白被膜，膜上有血红蛋白凝集性质的刺突。 4)包含体（Inclusion Body） 包含体是宿主细胞受病毒感染后形成的一种光学显微镜下可见的小体。其形态呈圆形、卵圆形或不定形，在细胞内包含体的大小和数量不等。包含体是病毒引起的宿主细胞病变，大多数是病毒粒子聚集体，少数是病毒蛋白和与病毒感染有关的蛋白质。一般包含体中含有一个或数个病毒粒子，也有的包含体并不含病毒粒子。包含体在细胞中的位置与病毒的类型有关，有的在细胞质（如狂犬病毒），有的在核内（如疱疹病毒），有的则在细胞质和核内都存在（如麻疹病毒）。包含体的大小、形状、组成及在胞内的位置可作为快速鉴定病毒的依据。 1903年，Negri在检查狂犬病病毒（Rabies）感染过的神经细胞时，发现了细胞内的包含体。现将狂犬病包含体称为内基氏小体（ Negri Body），是狂犬病的诊断依据。此外，还有一些特殊名称的包含体，如天花病毒的包含体称为顾氏小体（Guarnieri Body），烟草花叶病毒的包含体称为X小体（X Body）等。 昆虫病毒的包含体常为多角体，离体几年后仍具感染力，可用作为杀虫剂。依形成位置分核型多角体病毒（NPV），质型多角体病毒（CPV）。除病毒外，衣原体和某些理化因素也可使细胞形成包含体。 在基因工程中，有些外源基因在宿主菌体内的表达产物也会在细胞内形成一种具膜样结构的聚集体，也称为包含体。它们是没有活性的蛋白质颗粒，在一级结构上它的氨基酸顺序是正确的，但其高级结构却是紊乱的。在相差显微镜下，可观察到它们在细胞内是深色的点，因此又称为光折射体。包含体的直径约0.5(1微米，较坚硬，不溶于水。包含体的这一特点可以避免外源基因表达的蛋白质产物被胞内蛋白酶降解并便于提取纯化。通过变性剂溶解包含体和再复性处理，可以获得有活性的蛋白质产物。  图2.5.7 利用双层琼脂法形成噬菌斑的过程 5) 噬菌斑（Plaque ） 噬菌斑是指：在含宿主细菌的固体培养基上，噬菌体使菌体裂解而形成的空斑, 见图2.5.7。噬菌斑的形态多数会形成晕圈，有的是多重同心圆，见图2.5.8。这些特征相对稳定，可作鉴定噬菌体的依据之一。一个噬菌斑中可含有约107个噬菌体，因此噬菌斑是噬菌体的“菌落”。图2.5.9是大肠杆菌噬菌体λ在大肠杆菌菌苔上形成的噬菌斑。 效价（滴度Title）是微生物或其产物、抗原与抗体等活性高低的标志。噬菌体效价指噬菌体的浓度，即每毫升样品含噬菌体的个数。通常是在含敏感菌的平板上形成噬菌斑进行噬菌体的计数，以每毫升中含有的噬菌斑形成单位 (plaque forming unit/ml 或pfu/ml)表示其效价。例如，若每块平皿加1(l稀释106倍的样品，可形成10个噬菌斑，则噬菌体效价为1010pfu/ml。  图2.5.8 噬菌斑的形态 1.透明；2.浑浊；3.浑浊的中心部位透明；4.有一道菌生成的环；5.在中心部位有菌的生长带；6.有一道菌生成的环，并在中心部位有菌的生长带；7.在中心部位有针孔状菌落  (a) (b) 图2.5.9 大肠杆菌噬菌体λ在大肠杆菌菌苔上形成的噬菌斑 (a)大肠杆菌形成的菌苔；(b) 噬菌体λ造成的大小不等的噬菌斑 图2.5.10大肠杆菌T系噬菌体繁殖过程 1.吸附；2.侵入；3.增殖；4.成熟；5.释放 2.5.1.2病毒（噬菌体）的生长繁殖 病毒是专性寄生的。病毒的繁殖方式不是二分分裂，而是感染寄主细胞后，“接管”寄主细胞的生物合成机构，进行病毒的复制。 病毒复制研究得较清楚的是大肠杆菌T系噬菌体。其繁殖过程包括：吸附（Absorption)，侵入(Penetration)、增殖（复制,Replication）、成熟（Maturity,装配Assembly）和释放(Release)，见图2.5.10。 1）吸附 吸附是病毒感染寄主的第一步。病毒对宿主的吸附具有高度的特异性，如北京棒杆菌的噬菌体只会侵染北京棒杆菌。噬菌体吸附位点是细菌表面的特定受体，这些受体是细胞表面的化学组分，例如：大肠杆菌T3、T4和T7噬菌体的受体为脂多糖，大肠杆菌T2和T6噬菌体的受体为脂蛋白，流感病毒的受体为糖蛋白，小儿麻痹症病毒的受体为脂蛋白。有的受体在鞭毛、线毛上，如M13吸附位点就在大肠杆菌的性线毛上。当噬菌体吸附位点与细菌表面的受体特异性吸附后，不仅病毒粒子与细胞表面形成牢固的化学结合，而且病毒粒子本身在结构上也发生巨大改变，成为不可逆的结合。大肠杆菌T系噬菌体的吸附是尾丝首先触及细胞表面，然后用尾钉（刺突）固定。 吸附是病毒感染宿主的必经阶段，宿主细胞表面若没有或除去特定受体后就不能进行吸附。生产上经常调换发酵菌种的目的就是为了防止噬菌体污染。敏感细菌发生突变，可成为某噬菌体的抗性菌株，生产上常利用这类抗噬菌体菌株。噬菌体也会发生突变，又能在抗性菌株上吸附。 2）侵入 病毒的侵入方式取决于宿主细胞的性质，主要的有： 动物病毒往往通过细胞吞噬或胞饮而进入细胞。病毒进入细胞后，核酸再与蛋白外壳分离。 植物病毒通过表面伤口、昆虫口器进入植物体，没有特殊的侵入机制。 噬菌体的侵入最复杂。大肠杆菌T系噬菌体以其尾部吸附到敏感菌的表面后，将尾丝展开，通过尾部的刺突固着在细胞上；然后用尾部释放的酶水解细胞壁的肽聚糖，使菌壁产生一小孔；接着，尾鞘收缩，将尾髓压入细胞。尾髓为一空管，通过尾髓，头部的DNA注入细菌细胞内。此过程中，噬菌体的蛋白质外壳始终留在胞外。如果大量噬菌体侵入同一细胞，将使细胞壁产生许多小孔，在尚未进行噬菌体增殖时就可能引起细胞立即裂解，这种现象称为自外裂解（Lysis from without）。有的没有尾鞘或不能收缩的噬菌体，也能将DNA注入细胞。这说明尾鞘并不是噬菌体侵入所必需的，但它可以加快噬菌体的侵入速度。例如，大肠杆菌T2噬菌体的核酸侵入速度比丝状噬菌体M13要快100倍。部分线性噬菌体，如噬菌体fd则全部进入宿主细胞。 3）增殖（复制） 病毒侵入胞内后，宿主细胞的代谢将发生变化，它的生物合成将受到病毒核酸的遗传信息控制。病毒先利用宿主的RNA聚合酶等进行转录，生成噬菌体的mRNA。再由宿主的蛋白质合成体系进行翻译，合成复制噬菌体DNA所需的酶类，例如，T偶数噬菌体要合成十几种酶。然后开始复制噬菌体的核酸，指导合成病毒的外壳蛋白和溶菌酶等。 4）成熟（装配） 当所有噬菌体的成分合成完毕后，就开始装配，形成大量的子代噬菌体。在大肠杆菌T4噬菌体中，成熟步骤约需30种不同蛋白质参与，而且至少要动用47种基因功能。 5）释放 已知成熟的噬菌体除M13等少数噬菌体外，均藉细胞裂解而释放。细胞裂解可导致肉眼可见的培养物溶解，如产生噬菌斑或使液体培养物由混浊变清。但是也有例外，如线性噬菌体fd成熟后并不破坏细胞壁，而是从宿主细胞中钻出来，细菌细胞仍可继续生长。  图2.5.11具被膜病毒粒子的释放过程 动物病毒如脊髓灰质炎病毒是通过宿主细胞局部破裂而释放的，有被膜的病毒粒子藉“出芽”方式释放，见图2.5.11。在“出芽”过程中，病毒核衣壳从宿主细胞的质膜获得被膜，相当多的病毒则仍留在细胞内，通过细胞之间接触而传播。有的植物病毒很少释放到胞外，而是通过胞间连丝或融合细胞在细胞间扩散。不管何种方式释放出来的病毒粒子均可再实行感染。 大肠杆菌T4噬菌体繁殖过程的核酸和蛋白质合成的时间进程见图2.5.12。DNA侵入后，所合成的早期和中期mRNA用于编码核酸酶和DNA聚合酶等与DNA复制有关的蛋白质。后期合成的mRNA用来编码病毒粒子的结构蛋白和T4溶菌酶等。  图2.5.12大肠杆菌T4噬菌体繁殖的时间进程 大肠杆菌T系噬菌体的这种生长（繁殖）方式称为一步生长。它与细胞型生物完全不同，而且繁殖速度也要快百倍以上。平均每个被侵染的宿主细胞释放出来的新噬菌体粒子数量可通过一步生长曲线（One -step growth curve）试验来测定，具体方法如下： 将高浓度的敏感宿主菌培养物与适量的噬菌体悬液相混一段时间，以离心法或加入抗病毒血清除去过量的游离噬菌体，把经过上述处理的菌悬液进行高倍稀释，以免发生第二次吸附感染，使每个菌体只含一个噬菌体。培养中隔一定时间取样，接种到敏感菌培养物中培养。通过噬菌斑测定，可获得每个噬菌体感染细菌后释放的新噬菌体粒子数目。以培养时间为横坐标，以噬菌斑数为纵坐标作图，绘成的曲线就是噬菌体的一步生长曲线，见图2.5.13。  图2.5.13 T2噬菌体的一步生长曲线 在噬菌体侵染开始的几分钟，没有完整的噬菌体粒子，这段时间称为潜伏期（Latent phase）。潜伏期又分两段：（1）隐晦期（eclipse phase），在潜伏期的前期人为地（如用氯仿）裂解宿主细胞，裂解液没有侵染性；(2)胞内累积期（intracellular accumulation phase），又称潜伏后期。在隐晦期后，如人为地裂解宿主细胞，其裂解液有侵染性。这是噬菌体开始装配的时期，在电子显微镜下可观察到初步装配好的噬菌体粒子。 紧接着潜伏期后，宿主细胞迅速裂解，溶液中噬菌体粒子急剧增加的一段时间称为裂解期（rise phase）。因为噬菌体或其它病毒粒子没有个体生长，并且宿主细胞的裂解是突发的，所以从理论上分析，裂解期是瞬间的。但因为细菌群体中个别细胞的裂解不可能是同步的，事实上裂解期还是较长的。 在受感染的宿主细胞全部裂解、溶液中噬菌体数量达到最高点后的时期称为平稳期（plateau）。 每个敏感细胞受噬菌体侵染后能装配、释放出噬菌体的平均数量，称为裂解量（burst size）。裂解量的数值相对稳定，如：T4为100，(X174为1000，f2为10,000，谷氨酸生产菌的噬菌体为50～150等。 2.5.1.3 噬菌体的生活史 感染宿主细胞后，立即引起细胞裂解的噬菌体称为烈性噬菌体（Virulent Phage）。烈性噬菌体能在短时间内连续完成繁殖的五个阶段（吸附、侵入、复制、装配和释放）。如大肠杆菌T4、T7和(X174噬菌体。烈性噬菌体的生活史就是侵染宿主，裂解细胞后又侵染邻近宿主细胞的过程。 感染细胞后，并不马上引起细胞裂解，而是以“原噬菌体（Prophage，亦称前噬菌体）”方式整合在宿主的DNA中，随寄主繁殖而延续传代的噬菌体称为温和性噬菌体（Temperate Phage）或溶源性噬菌体（Lysogenic Phage），见图2.5.13。带有原噬菌体的细菌称为“溶源性细菌”（Lysogenic Bacteria）。在溶源性细菌内，没有形态可见的病毒粒子。原噬菌体是附着于细菌遗传物质上的噬菌体组成成分。少数情况下，温和性噬菌体也会引起宿主细胞裂解。在动植物中，整合到细胞染色体中的病毒DNA则称为前病毒。 溶源性是细菌的遗传特性。即每个溶源性细菌的子细胞一般也是溶源性的。原噬菌体不同于营养期的噬菌体。它没有感染性，对宿主一般无不良影响。但是，它也赋予溶原性细菌以下一些特征： （1）具有产生噬菌体的潜在能力。溶源性细菌培养时，大多数原噬菌体不进行营养繁殖，但少数会自发脱离染色体，导致细菌裂解。但裂解发生的频率较低，不易察觉。 在某些物理化学因素（紫外线，X射线，氮芥等）刺激下，原噬菌体会脱离染色体，开始复制，从而导致溶源性细菌裂解，产生大量的噬菌体。 （2）具有抗同源噬菌体感染的“免疫性”。即溶源性细菌对其本身产生的噬菌体或外来的同源噬菌体不敏感，这些噬菌体虽然可以进入溶源性细菌，但不能增殖，也不能导致溶源性细菌裂解。例如含有λ原噬菌体的溶源性细菌，对λ噬菌体的毒性有“免疫性”。 （3）溶源性细菌的复愈。溶源性细菌有时会丢失原噬菌体，又成为非溶源性细菌，此过程称为溶源性细菌非溶源化。此时，溶源性细菌并没有发生裂解。 （4）获得新的生理特性。如白喉杆菌只有感染了特定的原噬菌体后，才会产生白喉毒素，引起被感染机体发病。 上述某些特性往往会给发酵生产带来潜在的危险，造成经济损失。因为在溶源性细菌培养物中，虽有少量游离的噬菌体存在，但并不引起同源菌株细胞裂解，故不易被人察觉。 一旦溶源性细菌发生自发裂解或诱发裂解，将会危害发酵菌株。因此必需采取有效的手段检测出溶源性细菌。 溶源性细菌的检测往往用敏感的、非溶源性的菌株作为指示菌，这些菌株可以从自然界或菌种库中获得。将待测菌样在合适的培养基中培养，并在生长的对数期进行紫外线照射，诱导原噬菌体复制。经进一步培养后，将培养物过滤，去除活菌体，将滤液与指示菌混合后倒平皿，观察是否有噬菌斑出现。也可将滤液加到指示菌的液体培养物中，观察是否能使菌液变清。如果有噬菌斑出现或使菌液变清，则说明被测菌株是溶源性细菌。 溶源性菌株的命名是在菌株名称后加括号，内写携带原噬菌体的名称，如E.coli B(()。 温和性噬菌体存在状态有三种形式： 游离态 游离于细胞之外，具感染性的完整病毒粒子。 整合态 温和性噬菌体都具有双链DNA。进入菌体后，在染色体DNA的一定位置插入，作为细菌DNA的一部分，随细胞分裂而复制，即为整合。有的噬菌体DNA不整合，而是附着在细胞膜某个位点，象细菌质粒一样，随细菌分裂而繁殖。 营养态 原噬菌体自发或经理化因素诱导，脱离细菌染色体，进入营养期。此时，它在宿主细胞内指导特定的病毒核酸和蛋白质的合成。  图2.5.14 温和性噬菌体的生活史 2.5.1.4 噬菌体的分离 噬菌体广泛分布于自然界，凡有细菌的地方几乎都有噬菌体。在被噬菌体污染的发酵液中，可以分离到发酵菌的噬菌体；在土壤中可以分离到许多土壤微生物的噬菌体；在人的粪便和阴沟水中可以分离到寄生在人体肠道中细菌的噬菌体。噬菌体具有非常专一的寄生性，只能在特定的寄主细胞中增殖，所以，它的培养不能采用一般的培养基，必需以特定的、处于繁殖阶段活细胞为培养基。噬菌体的分离与细菌分离相似，一般采用琼脂平板稀释法，但有它的一些特殊性。 1）分离样品的制备 分离源为液体时，可用一次离心分离。在10,000rpm转速下离心10分钟，取上清液，去除沉淀的杂菌；对于土壤等固体样品，可先取1-2克固体悬浮在5-10ml培养基中，然后离心取上清液；若以溶源性细菌培养液为样品，可用紫外线或丝裂霉素C等处理并培养，再经离心分离；如果要从设备和容器表面分离噬菌体，可用灭菌棉签用力搽拭容器表面，然后将棉签浸入2-3ml培养液中充分洗脱，以此液体为分离样品；由空气中分离噬菌体时，可用真空泵抽引，将空气抽入培养基，以此培养基为分离对象。而在噬菌体密度高的空气区域内，只要将长了菌的平皿打开，在空气中暴露30-60分钟即可。 对噬菌体含量较少的样品可先进行扩增。将样品接入敏感的宿主菌液中培养一段时间，使噬菌体增殖。为避免杂菌繁殖，可加入过滤样品或采用抗药性宿主菌，在加抗生素的条件下培养。若可能有两种以上的噬菌体存在，应缩短培养时间，以免增殖快的噬菌体在数量上压倒增殖速度慢的噬菌体。采用多级膜过滤器也可达到浓缩目的。 2）宿主细胞培养 宿主细胞培养一般采用含蛋白胨、酵母膏等半合成培养基，并在其中补充20%麦芽糖、10-3M的Ca2+和10-2M的Mg2+等，以便有利于噬菌体吸附。 3）分离方法 在琼脂培养基中加入宿主菌液铺成平板，然后用接种环、毛细管或微量吸管取样品在平板上点12-25个样品点，培养后检查点样部位有无噬菌斑出现。也可采用双层琼脂法，将宿主菌与培养基混合倒平板作为底层，将稀释的噬菌体样品与培养基混合铺成上层，培养后检测有无噬菌斑出现。 4）保藏 将噬菌斑中的噬菌体液加到敏感菌液培养，直到发生溶菌，使培养液变清。将培养液离心后的上清液再加到新鲜的敏感菌液中进一步培养，以获取高效价的噬菌体液，也可在长满噬菌斑的平板上加入2-3ml培养液，振荡一段时间，使噬菌体游离出来。 噬菌体离心获得的上清液或过滤液可在4℃下保藏。若要长期保藏，可加入甘油、血清、脱脂奶粉等保护剂后，以冷冻状态保存。最简便的方法是用灭菌滤纸片或琼脂片浸透噬菌体液进行保藏。温和噬菌体多以溶源性细菌形式保藏。 2.5.1.5 噬菌体的防治 污染现象 利用微生物进行发酵的工业常会遭到噬菌体的危害。如抗生素、味精、有机溶剂和酿酒发酵经常会遭受噬菌体污染。各种发酵系统在污染噬菌体后，往往出现一些明显的异常现象，如：碳源和氮源的消耗减慢，发酵周期延长，pH值异常变化，泡沫骤增，发酵液色泽和稠度改变，出现异常臭味，菌体裂解和减少，引起光密度降低和产物锐减等。污染严重时，无法继续发酵，应将整罐发酵液报废（即倒罐）。 污染原因 噬菌体污染的原因之一是发酵菌种本身。几乎所有的菌都可能是溶源性的，都有产生噬菌体的可能。而且一种菌产生两种以上噬菌体的情况也很多，最多的甚至可产生8种噬菌体。另外，也有可能发酵菌种不纯或混有噬菌体，因此，保藏的菌株和新分离的菌株在用于工业生产前应做产生噬菌体的试验，以确保发酵生产不被噬菌体污染。 好氧发酵的空气过滤系统失效或发酵环境中存在大量的噬菌体等原因也很容易加剧噬菌体污染。 防治措施 （1）杜绝噬菌体的各种来源。应定期监测发酵罐、管道及周围环境中噬菌体的数量变化。在干燥环境中噬菌体比较稳定，能长时间以活性状态漂浮在空气中，这是发酵生产易受噬菌体污染的一个重要原因。噬菌体易受热（60-70℃时加热 5-10分钟）变性，对氧化物敏感，可被酸、碱致死。能使蛋白质变性的化学药品，如0.5%甲醛、1%新洁而灭、0.5%苯酚或漂白粉等都可杀灭噬菌体。应采取相应的措施消除设备中的缺陷和不合理部分，避免罐和管道内的死角。空气过滤系统应严格灭菌，并确保干燥。对可能沾污噬菌体的地面可洒放漂白粉或石灰等。车间的排气系统应有分离装置，要合理设计排水沟道。 （2）控制活菌体的排放。活菌体是噬菌体生长繁殖的首要条件，控制其排放能消除环境中出现特定的噬菌体。生产中的摇瓶液、取样液、废弃菌液或发酵液等均应灭菌后经管道排放；发酵罐的排气和可能发生发酵逃液的地方应接入装有杀菌药物的容器；已经被噬菌体污染的发酵液应在80℃处理2~5分钟后，再送往提取工段或向阴沟排放。放罐后应对空罐和管道进行严格灭菌，提取后留有菌体的废弃液应经密闭下水道向远离发酵车间和空压机房的地方排放。 （3）使用抗噬菌体菌株和定期轮换生产用菌。选育和使用抗噬菌体的生产菌株是一种较经济有效的手段。定期轮换生产菌种，可以防止某种噬菌体污染扩大，并能使生产不会应噬菌体污染而中断。 （4）噬菌体污染后的补救措施。 针对噬菌体对其宿主范围要求严格的特点，可以准备发酵特征基本相近而又不相互抑菌的不同菌株，一旦发生噬菌体污染后，可以大量接入另一菌种的种子液或发酵液，继续进行发酵，以达到减少损失、避免倒罐的目的。当早期发现噬菌体侵染且残糖较高时，可以先将温度升至85-95℃，维持10-15分钟，这样既能够尽量减少培养基中营养成分被破坏，又可以杀灭噬菌体。然后再补充一些促进细胞生长的玉米浆等，重新接入大量种子，就可以继续进行发酵。低剂量的氯霉素和四环素等抗生素能阻止噬菌体的发展，但对菌体没有明显的抑制作用，发酵液中适当加入抗生素可以起到防治噬菌体的作用。 2.5.1.6干扰素（Interferon） 干扰素是一类能抑制病毒在细胞内增殖的蛋白质，分子量在30,000左右。由一些动物细胞在病毒及某些细菌或它们的产物及多聚核苷酸类物质诱导下产生。 干扰素的名称是1957年由Isaacs和Lindemann 提出的，用于描述绒毛膜尿囊膜受热失活的流感病毒的刺激后所产生的一种物质。他们发现用含干扰素的液体处理绒毛膜尿囊膜后，病毒不再复制。近年来发现干扰素不仅能抗病毒，而且还通过改变细胞表面来影响动物细胞，修饰其免疫特性，抑制细胞分裂。所以干扰素具有抗肿瘤细胞的作用。1980年后干扰素开始临床用于人类癌症治疗，如骨瘤，乳癌等。 干扰素是动物或动物细胞培养物对病毒感染反应而产生的低分子量糖蛋白，在内毒素、某些细菌和其它非病毒物质刺激下产生。某些合成化合物也能诱导人体产生干扰素，如一种双链RNA和聚肌胞（poly[I]:poly[C]）等。现在，干扰素除从血液中提取外，还可通过哺乳动物细胞培养和基因工程生产。 干扰素是病毒感染时，由被感染细胞产生、并与其它细胞作用以改变其代谢和免疫性质的一种蛋白质，使这些邻近细胞不仅能免受入侵的原病毒感染，而且能抵抗其它与病毒无关的DNA或RNA的侵入。 哺乳动物细胞具有编码干扰素的基因，感染细胞产生的干扰素与周围细胞接触，可以阻止病毒蛋白的翻译。干扰素的作用机理是：诱导两个起初无活性的酶，蛋白激酶（protein kinase，PK)和寡腺苷酸合成酶（oligoadenylate synthetase，OS)的合成。这两种酶可以被病毒感染产生的双链RNA激活。PK催化蛋白合成的启动子蛋白的磷酸化，使其失活。OS催化2’,5’-寡腺苷酸合成，后者是病毒mRNA的核酸酶激活剂。干扰素诱导的抗病毒活性具种属特异性，抗性只在产干扰素的细胞类才具有。这样，只有人产生的干扰素才能保护人类。干扰素抗病毒具广谱性，而保护作用具种属特异性。 2.5.2 类病毒（Viroid） 类病毒是寄生于高等生物细胞的一类最小的病原体。既类似于病毒，又不属于病毒。类病毒属于严格专性细胞内寄生。只有在宿主细胞内才表现其生命特征，才能自我复制。它的化学组成和结构比病毒更简单，没有蛋白质外壳，仅是游离的RNA分子，分子量约100,000Da，只有最小病毒的十分之一。类病毒的发现被认为是生命科学中的一个重大事件。目前，只在植物中发现存在类病毒。 1922年在美国发现马铃薯纺锤形块茎病（potato spindle tuber disease），它可使土豆减产20～70%。1971年，从马铃薯纺锤形块茎病中分离纯化得到马铃薯纺锤形块茎病类病毒（potato spindle tuber viroid,PSTV)。经感染性试验、RNA酶水解和紫外光谱等分析证明它是一个没有衣壳包裹的RNA分子。经电子显微镜观察，发现它是一条50～70 nm长的棒状RNA分子，是由359个核苷酸组成的闭合环状RNA分子，其间有70%的碱基以氢键方式结合，共形成122个碱基对，整个棒状结构中有27个内环，最大的内环含有12个核苷酸，最大的螺旋分段含有8个碱基对，见图2.5.15。 自发现PSTD后，人们陆续发现了番茄簇顶病、柑橘裂皮病、菊花矮化病、菊花褪绿斑驳病、黄瓜白果病、椰子死亡病和酒花矮化病等18种植物疾病的类病毒。 类病毒是如何“接管”宿主代谢机构进行复制，并引起植物疾病的机制还不清楚。但类病毒明显不同于病毒，两者的比较列于表2.5. 3。  图2.5.15 马铃薯纺锤形块茎病类病毒（PSTV)结构的模式图 表2.5.3 病毒与类病毒特点的比较 比较内容 大小 成分 核酸分子量 耐热性 传播特性  病毒 大 核酸、蛋白质等 106～108D 50～60℃失活 一般不通过种子传播  类病毒 小 裸露RNA ～105D 至90℃仍活 通过种子传播   2.5.3 拟病毒(Virusoids) 拟病毒又称类类病毒 (Viroid-like)，它是包裹在植物病毒粒子内的类病毒。它与普通的类病毒的差异是它的侵染对象不是高等植物或动物，而是植物病毒。 1981年，Randles等人在绒毛烟（Nicotiana velutina）上分离到一种直径为30nm的二十面体病毒，称为二十面体的绒毛烟斑驳病毒（velvet tobacco mottle virus,VTMoV）。他们发现该病毒的基因组中，除一种大分子的线状SSRNA（RNA-1）外，还有类似于类病毒的环状单链RNA（RNA-2）及其线状形式（RNA-3）。进一步研究表明，单独接种RNA-1和RNA-2，都不能引起感染和复制。只有将两者合在一起才可以感染和复制。这种环状单链RNA（RNA-2）是一种类似于类病毒的新型分子。 以后发现还有其它的拟病毒，如苜蓿暂时性条斑病毒(lucerne transient sreak virus,LTSV)、莨 斑驳病毒（solanum nodiflorum mottle virus,SNMV）和地下三叶草斑驳病毒（subterranean clover mottle virus,SCMoV）中的拟病毒等。 对拟病毒的研究将有助于进一步探索病毒的本质和生命起源等重大的生物学理论问题。 2.5.4 朊病毒 (Virino) 朊病毒又称蛋白质侵染因子(Protein Infection 或缩写成Prion)或普利昂。它是一类能侵染动物并在宿主细胞内复制的小分子、无免疫性的疏水性蛋白质。朊病毒在电子显微镜下呈杆状颗粒，直径25nm，长100-200nm，杆状颗粒不单独存在，总呈丛状排列，每丛大小和形状不一，多的可含100个丛。 羊瘙痒病是绵羊和山羊的一种中枢神经系统退化性紊乱疾病。具脱毛、皮肤瘙痒、失去平衡和后肢麻痹等症状。1982年，美国科学家S .B.Prusiner发现羊瘙痒病的病原体是一种蛋白质，并称之为朊病毒。1997年震撼整个世界的“疯牛病”危机就是朊病毒作祟。最为可怕的是变异的朊病毒蛋白不会引起生物体内的免疫反应，故在发病前无任何异常症状，很难早期诊断。朊病毒的发现在生物学界引起震惊，因为它的出现与公认的中心法则关于遗传信息流向的说法相抵触，因此有可能为分子生物学的发展带来革命性的影响。 蛋白酶（胰蛋白酶、蛋白酶K）、氨基酸修饰剂（碳酸二乙酯）和蛋白变性剂（尿素、苯酚、SDS、KSCN）对朊病毒有明显的影响，而核酸酶对它没有作用。对侵染仓鼠脑的朊病毒进行提纯后发现，朊病毒蛋白的纯度越高，其侵染性越强。朊病毒的分子量为27,000-30,000Da，至今尚未发现它含有核酸。