工业微生物学（教材电子书）：第四章 微生物代谢的调节

第四章 微生物代谢的调节 微生物的新陈代谢错综复杂，参与代谢的物质又多种多样，即使同一种物质也会有不同的代谢途径，而且各种物质的代谢之间存在着复杂的相互联系和相互影响。在长期的进化过程中，微生物建立了一套严密、精确、灵敏的代谢调节体系，能严格地控制代谢活动，使之有序而高效地运行，并能灵活地适应外界环境，最经济地利用环境中的营养物。 微生物的代谢调节具有多系统、多层次的特点，目前，人们对此了解还十分有限。本章将主要讨论对酶的调节。微生物细胞内的遗传物质上储存着能催化所有生化反应所需的酶以及调节酶活性的信息。微生物可以按照适应环境的需要调节酶的表达（即酶蛋白的合成）及调节酶的活性（即酶的激活或抑制）。 了解微生物的代谢调节系统不仅有理论意义，更重要的是能有目的地改造微生物和为微生物提供最适合的环境条件，使微生物能最大限度地生产人类所需的代谢产品。从某种意义上讲，越是理想的高产菌株，背离它自然进化中发展起来的调控机制就越远。遗传育种工作就是为获得目标代谢产物合成不受或少受代谢调控的“不正常”的菌株。 4.1酶合成的调节 这是通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制。这类调节在基因转录水平上进行，对代谢活动的调节是间接的、也是缓慢的。它的优点是通过阻止酶的过量合成，能够节约生物合成的原料和能量。酶合成的调节主要有两种类型：酶的诱导和酶的阻遏。 4.1.1酶的诱导(Enzyme induction) 按照酶的合成与环境影响的不同关系，可以将酶分为两大类，一类称为组成酶(Structural enzymes)，它们的合成与环境无关，随菌体形成而合成，是细胞固有的酶，在菌体内的含量相对稳定。如糖酵解途径（EMP）有关的酶。另一类酶称为诱导酶(Inducible enzyme)，只有在环境中存在诱导剂（Inducer)时，它们才开始合成，一旦环境中没有了诱导剂，合成就终止。例如，在对数生长期的大肠杆菌（E.coli）培养基中加入乳糖，就会产生与乳糖代谢有关的(-半乳糖苷酶和半乳糖苷透过酶等。这时，细胞生长速度和总的蛋白质合成速度几乎没有改变，见图4.1.1。这种环境物质促使微生物细胞中合成酶蛋白的现象称为酶的诱导。
图4.1.1. 培养基中加入乳糖诱导(-半乳糖苷酶的合成 早期，诱导酶被称为“适应酶”。有人发现某些细菌只有生长在含淀粉的培养基中才会产生淀粉酶；而曲霉只有生长在含有蔗糖的培养基中才会产生蔗糖酶。Karstron(1931-1938)曾系统地研究了这种适应现象，见表4.1.1。表中显示，只有事先生长在含乳糖的培养基中的肠膜状明串珠菌才能发酵乳糖，只有事先生长在含阿拉伯糖的培养基中，该菌才能发酵阿拉伯糖。但是，无论事先是生长在含葡萄糖、阿拉伯糖、乳糖或是不含糖而含其它碳源的培养基中的肠膜状明串珠菌，一旦转移到葡萄糖培养基中时，都能立即发酵葡萄糖。跟据这一现象，Karstron认为该菌与阿拉伯糖或乳糖发酵有关的酶是适应酶，而发酵葡萄糖的酶是组成酶。 表 4.1.1肠膜状明串珠菌适应酶的生成 预培养基中 含糖的种类 能发酵   葡萄糖 乳糖 阿拉伯糖  葡萄糖 乳糖 阿拉伯糖 不含糖 + + + + - + - - - - + -   其后，人们发现适应现象不仅存在于微生物利用某些糖的酶系，微生物对蛋白质、氨基酸及芳香族化合物等的利用也存在这种适应现象。甚至细胞色素和细菌叶绿素也是由适应酶催化生成的。酵母菌在有氧的环境中会生成细胞色素，环境无氧时，细胞色素就消失，再回到有氧环境，又恢复生成细胞色素。紫色细菌的叶绿素在黑暗中消失，见光后又会恢复合成能力。因此，适应酶普遍存在于整个微生物世界中。 Monod 和Cohn（1952）在研究大肠杆菌(-半乳糖苷酶适应生成的问题时，发现酶底物（乳糖）的结构类似物，如甲基-(-D-硫代半乳糖苷，也可以象乳糖一样，诱导(-半乳糖苷酶的生成，相反，有些可以作为该酶底物的物质，如苯基-(-D-半乳糖苷，却不能诱导(-半乳糖苷酶的合成。因此，他们将适应酶改称为诱导酶，将诱导酶生成的物质称为诱导物。在大多数情况下，诱导酶的底物就是有效的诱导物。但然，诱导物不一定就是诱导酶的底物，有些非底物的诱导剂比底物具有更好的诱导效果，见表4.1.2。 表 4.1.2某些诱导酶的正常底物和非底物高效诱导物 酶 正常底物 非底物的高效诱导剂  (-半乳糖苷酶 青霉素酶 丁烯二酸顺反异构酶 脂肪族酰胺酶 甘露糖链霉素酶 乳糖 苄基青霉素 顺丁烯二酸 乙酰胺 甘露糖 异丙基-(-D-硫代半乳糖苷 2,6-二甲氧基苯基青霉素 丙二酸 N-甲基乙酰胺 (-甲基甘露糖苷   Monod 和Jacob（1961）提出了操纵子学说用于解释酶的诱导机制。操纵子（Operon)指一组功能上相关的基因，它们由启动基因(Promoter)、操纵基因(operator)和结构基因(Structural gene)三部分组成，见图4.1.2。启动基因是一种能被依赖于DNA的RNA聚合酶所识别的碱基序列，它既是RNA聚合酶的结合位点，又是转录的起始点。操纵基因是位于启动基因和结构基因之间的碱基序列，它能与阻遏物（Repressor)相结合，以此来决定结构基因的转录能否进行。结构基因是确定酶蛋白氨基酸序列的DNA模板，可根据它的碱基序列转录生成mRNA，然后再通过蛋白质翻译生成相应的酶。一个操纵子往往含有多个结构基因，如大肠杆菌的乳糖操纵子中就有三个紧邻的结构基因，分别是(-半乳糖苷酶（水解乳糖）、(-半乳糖苷透过酶（控制乳糖透过细胞膜进入细胞）和半乳糖苷转乙酰酶（催化从乙酰CoA转移乙酰基到半乳糖苷受体上）的遗传基因。在操纵子附近还有调节基因（Regulator gene)，它是编码调节蛋白（Regulatory protein)的基因。调节蛋白是一类变构蛋白，它有两个特殊的位点，其中的一个位点能与操纵基因结合，另一个能与效应物结合。在酶的诱导中，调节蛋白就是阻遏物。效应物就是诱导物。大肠杆菌乳糖操纵子的阻遏蛋白已被分离纯化，它的分子量约为 160,000，由四个相同的亚单元所组成。在没有诱导物存在时，阻遏物与操纵基因相结合，使得RNA聚合酶无法从起始点滑向结构基因，转录无法进行，结构基因处于休眠状态。当诱导物出现时，阻遏物与诱导物结合，随即发生变构效应。经变构后阻遏物无法再与操纵基因结合，操纵子的“开关”被打开，使结构基因的转录、翻译过程能够顺利进行。当诱导物耗尽后，阻遏物可再与操纵基因结合，操纵子的“开关”又被关上。这时，细胞内已转录生成的mRNA迅速被核酸内切酶降解，操纵子控制的有关酶蛋白在细胞内的含量急剧下降。如果调节基因发生突变，正常的阻遏物无法产生，那么，操纵子的“开关”始终开启着，原有的调节机制被解除，诱导酶就成了组成酶。
图4.1.2 酶诱导的操纵子模型 1. 没有诱导物存在时，结构基因的表达被阻断；2.在诱导物存在时，结构基因表达生成诱导酶 酶的诱导又可以分为两种情况。一种是同时诱导，即加入一种诱导剂后，微生物能同时或几乎同时合成几种酶，它主要存在于较短的代谢途径中，合成这些酶的基因由同一个操纵子所控制。例如将乳糖加入到E.coli培养基中，即可同时诱导(-半乳糖苷酶、(-半乳糖苷透过酶和半乳糖苷转乙酰酶的合成，这三种酶都由乳糖操纵子控制。另一种称为顺序诱导，第一种酶的底物会诱导第一种酶的合成，第一种酶的产物又可诱导第二种酶的合成，依此类推合成一系列的酶。例如：先合成能分解底物的酶，再依次合成分解中间代谢物的酶，以达到对较复杂代谢途径的分段调节。在E.coli中，最初的诱导物乳糖诱导了代谢乳糖酶系的合成，将乳糖转化成半乳糖，半乳糖在细胞内浓度升高，又触发与半乳糖代谢相关酶的诱导合成，见图4.1.3。 酶的类型 诱导物 酶 催化的反应 乳糖 (-半乳糖苷透过酶 乳糖 乳糖 (-半乳糖苷酶 诱导酶 半乳糖 + 葡萄糖 半乳糖苷激酶 半乳糖 转移酶 差向异构酶 葡萄糖-1-磷酸 葡萄糖-6-磷酸 组成酶 参与糖酵解的酶 丙酮酸 图4.1.3 有关分解乳糖酶的顺序诱导 由于存在酶的诱导机制，微生物只有在代谢活动需要时才合成有关的酶，从而避免了营养物和能量的浪费。 诱导酶与组成酶在本质上是相同的，两者的区别在于酶合成调节体系受控制的程度不同。在微生物育种中，常采取诱变等手段使诱导酶转化为组成酶，以利于大量积累所需的代谢产物。 4.1.2酶合成的阻遏(Enzyme repression) 在某代谢途径中，当末端产物过量时，微生物的调节体系就会阻止代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的合成，从而彻底地控制代谢，减少末端产物生成，这种现象称为酶合成的阻遏。合成可被阻遏的酶称为阻遏酶（repressible enzyme）。阻遏的生理学功能是节约生物体内有限的养分和能量。酶合成的阻遏主要有末端代谢产物阻遏和分解代谢产物阻遏两种类型。 4.1.2.1末端代谢产物阻遏（End-product repression ) 由于某代谢途径末端产物的过量积累而引起酶合成的（反馈）阻遏称为末端代谢产物阻遏。通常发生在合成代谢中，特别是在氨基酸、核苷酸和维生素的合成途径中十分常见。生物合成末端产物阻遏的特点是同时阻止合成途径中所有酶的合成。如：对数生长期的大肠杆菌的培养基中加入精氨酸，将阻遏精氨酸合成酶系（氨甲酰基转移酶、精氨酸琥珀酸合成酶和精氨酸琥珀酸裂合酶）的合成，而此时细胞生长速度和总蛋白质的合成速度几乎不变，见图4.1.4。若代谢途径是直线式的，末端产物阻遏情况较为简单，末端产物引起代谢途径中各种酶的合成终止。如图4.1.5所示，大肠杆菌的蛋氨酸是由高丝氨酸经胱硫醚和高半胱氨酸合成的，在仅含葡萄糖和无机盐的培养基中，大肠杆菌细胞含有将高丝氨酸转化为蛋氨酸的三种酶，但当培养基中加入蛋氨酸时，这三种酶消失。又如鼠伤寒沙门氏杆菌合成组氨酸需要十种酶，这十种酶的合成都同时受到组氨酸的阻遏。有时, 合成途径中各种酶受末端产物阻遏的程度会有所不同，如大肠杆菌的精氨酸生物合成酶系中每个酶受精氨酸阻遏的程度存在着差异。
图4.1.4 培养基中加入精氨酸阻遏精氨酸合成酶系的合成
图4.1.5 甲硫氨酸反馈阻遏大肠杆菌的蛋氨酸合成酶的合成 （R）：表示反馈阻遏 对于分支代谢途径来说，情况比较复杂。每种末端产物只专一地阻遏合成它自身那条分支途径的酶，而代谢途径分支点前的“公共酶”则受所有分支途径末端产物的共同阻遏。任何一种末端产物的单独存在，都不影响酶合成，只有当所有末端产物同时存在时，才能发挥阻遏作用的现象称为多价阻遏（Multivalent repression）。多价阻遏的典型例子是芳香族氨基酸、天冬氨酸族和丙酮氨酸族氨基酸生物合成中存在的反馈阻遏。 在一些氨基酸合成途径中，末端产物氨基酸必须和它的tRNA结合后，才能起到阻遏作用。有些末端代谢产物本身具有独立的阻遏作用，但若与某些物质结合形成复合物，则会增强阻遏作用。如杆菌肽和F铁离子形成复合物后，反馈阻遏作用增强。 末端代谢产物阻遏在微生物代谢调节中有着重要的作用，它保证了细胞内各种物质维持适当的浓度。当微生物已合成了足量的产物，或外界加入该物质后，就停止有关酶的合成。而缺乏该物质时，又开始合成有关的酶。 末端代谢产物阻遏的机制也可以用操纵子学说解释。如大肠杆菌色氨酸操纵子控制着5个结构基因，分别为“分支酸((邻氨基苯甲酸((磷酸核糖邻氨基苯甲酸((羧苯氨基脱氧核糖磷酸((吲哚甘油磷酸((色氨酸”途径中5种酶的基因。其调节基因远离操纵子，所表达的调节蛋白不能直接与操纵基因结合，结构基因的表达能顺利进行。这时的调节蛋白称为原阻遏物（prerepressor)。当代谢产生末端代谢产物色氨酸后，色氨酸作为效应物与原阻遏物结合，使后者发生变构效应，并能与操纵基因结合，从而阻止了结构基因的表达。其过程见图4.1.6。
图4.1.6 酶阻遏的色氨酸操纵子模型 1. 在没有效应物（色氨酸）存在时，结构基因表达色氨酸合成酶系（邻氨基苯甲酸合成酶Ⅰ和Ⅱ、吲哚甘油磷酸酯合成酶、色氨酸合成酶B和A）；2.色氨酸与原阻遏物结合构成阻遏物，色氨酸合成酶系的合成被阻断 4.1.2.2.分解代谢物阻遏（Catabolite repression） 当细胞内同时存在两种可利用底物（碳源或氮源）时，利用快的底物会阻遏与利用慢的底物有关的酶合成。现在知道，这种阻遏并不是由于快速利用底物直接作用的结果，而是由这种底物分解过程中产生的中间代谢物引起的，所以称为分解代谢物阻遏。 分解代谢物阻遏过去被称为葡萄糖效应。1942年Monod在研究大肠杆菌利用混合碳源生长时时，发现葡萄糖会抑制其它糖的利用。例如大肠杆菌在含乳糖和葡萄糖的培养基中，优先利用葡萄糖，并只有当葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，这就形成了在两个对数生长期中间的第二个生长停滞期，即出现了“二次生长现象”，见图4.1.7。用山梨醇或乙酸代替乳糖，也有类似结果，见图4.1.8。 Monod 提出的乳糖操纵子模型可以较好地解释分解代谢物的阻遏机制。如图4.1.9所示，乳糖操纵子的启动基因内，除RNA聚合酶结合位点外，还有一个称为CAP-cAMP复合物的结合位点。CAP是降解物基因活化蛋白（又称为cAMP受体蛋白，CRP），当CAP与cAMP结合后，就会被活化，复合物又会激活启动基因，并使RNA 聚合酶与启动基因结合。在只含有乳糖的培养环境中，乳糖操纵子的“开关”开启（见前述），三种与乳糖代谢有关的酶能被顺利合成，而当乳糖与葡萄糖同时存在时，因为分解葡萄糖的酶类属于组成酶，能迅速地将葡萄糖降解成某种中间产物（X），X既会阻止ATP环化形成cAMP，同时又会促进cAMP分解成AMP，从而降低了cAMP的浓度，继而阻遏了与乳糖降解有关的诱导酶合成。在如葡萄糖培养基中的大肠杆菌细胞内，cAMP浓度比生长在乳糖培养基中的低1000倍，只有当葡萄糖耗尽后，cAMP才能回升到正常浓度，操纵子重新开启，并开始利用乳糖作为碳源，形成菌体的二次生长。
图4.1.7 培养基中不同糖对大肠杆菌生长速度的影响 1.单独加入葡萄糖时，菌体生长几乎没有延迟期；单独加入乳糖时，菌体生长有明显的延迟期；2. 同时加入葡萄糖和乳糖时，菌体呈二次生长
图4.1.8 大肠杆菌在含葡萄糖和山梨醇培养基中的二次生长 葡萄糖50微克/毫升，山梨醇150微克/毫升；2.葡萄糖100微克/毫升，山梨醇100微克/毫升；3.葡萄糖150微克/毫升，山梨醇50微克/毫升 酶的诱导、分解代谢物阻遏和末端产物阻遏可以同时发生在同一微生物体内。这样，当某些底物存在时微生物内就会合成诱导酶，几种底物同时存在时，优先利用能被快速或容易代谢的底物；而与代谢较慢的底物有关酶的合成将被阻遏；当末端代谢产物能满足微生物生长需要时，与代谢有关酶的合成又被终止。 操纵子学说是从原核微生物代谢调节的研究中建立起来的，对于真核微生物，情况更复杂。酶合成的调节除可发生在上述的转录水平，也可能发生在翻译水平。蛋白质翻译水平上的调节是指改变某些氨基酰tRNA的浓度以调节蛋白质的合成速度，高浓度的氨基酰tRNA可阻止肽链的合成。
图 4.1.9 分解代谢物阻遏的乳糖操纵子模型（葡萄糖分解代谢物X阻止CAP-cAMP的形成，从而阻止了RNA聚合酶与启动基因上结合位点（RNApol.）的结合，即使有诱导物乳糖存在，与乳糖代谢有关的酶仍无法合成） 4.2 酶活性的调节 通过改变酶分子的活性来调节代谢速度的调节方式称为酶活性的调节。与酶合成调节方式相比，这种调节方式更直接，并且见效快。是发生在蛋白质水平上的调节。 某些酶的活性受到底物或产物或其结构类似物的影响，这些酶称为调节酶（Regulatory enzyme)。这种影响可以是激活、也可以是抑制酶的活性。我们把底物对酶的影响称为前馈，产物对酶的影响称为反馈。见图4.2.1。前馈作用一般是激活酶的活性。在分解代谢中，后面的反应可被较前面反应的中间产物所促进，如粪链球菌（Streptococcus feacalis)的乳酸脱氢酶活性可被1,6-二磷酸果糖所激活；又如在粗糙脉孢霉（Neurospora crassa)培养时，柠檬酸会促进异柠檬酸脱氢酶活性。 前馈± 反馈± (( E0 (((((( So (((( Si ……((((Sn En-1 图4.2.1 底物或产物对酶活性的调节（+ 表示激活，-表示抑制）
图4.2.2 变构酶受效应物的调节过程 1. 激活剂激活无活性的酶；2.抑制剂抑制有活性的酶 调节酶通常是变构酶，一般具有多个亚基，包括催化亚基和调节亚基。变构酶的激活和抑制过程见图4.2.2。激活过程的效应物称为激活剂（activator），而抑制过程的效应物称为抑制剂(inhibitor)。在微生物代谢调节中更常见的是反馈调节，尤其是末端产物对酶活的反馈抑制。抑制剂与调节亚基结合引起酶构象发生变化，使催化亚基的活性中心不再能与底物结合，酶的催化性能随之消失。调节酶的抑制剂通常是代谢终产物或其结构类似物，作用是抑制酶的活性。效应物的作用是可逆的，一旦效应物浓度降低，酶活性就会恢复。调节酶常常是催化分支代谢途径一系列反应中第一个反应的酶，这样就避免了不必要的能量浪费。 在微生物的代谢活动中，三磷酸腺苷(ATP)是为许多反应提供能量的高能磷酸化物。ATP释放出能量后转化为二磷酸腺苷（ADP）或单磷酸腺苷（AMP），也可以由AMP或ADP合成ATP。细胞中的ATP、ADP和AMP含量处于相对平衡的状态。有人用能荷（Energy charge）来表示细胞中的能量状态。能荷（EC）可用下式来表示：
系统中只有ATP时，EC值为1；只有AMP时，EC值等于零。大肠杆菌在生长期的EC值为0.8，稳定期时逐渐降低到0.5，当EC值小于0.5时，细胞将死亡。 酶活性将受到细胞能荷的调节。能荷不仅能调节分解代谢形成ATP的酶活性，也能调节合成代谢利用ATP的酶活性。如异柠檬酸脱氢酶和磷酸果糖激酶等会受到高能荷的抑制，而丙酮酸羧化酶、乙酰CoA羧化酶和天门冬氨酸激酶等会受到高能荷的激活。 巴斯德在研究酵母的酒精发酵时发现：厌氧条件下酵母菌进行酒精发酵，葡萄糖的消耗速度很快；而在有氧条件下，酵母菌进行呼吸作用，糖的消耗速度较低，酒精产量也降低。这种呼吸抑制发酵作用的的现象被后人称为巴斯德效应（Pasteur effect）。巴斯德效应的本质是能荷调节。糖酵解（EMP）和三羧酸循环（TCA）途径都能产生ATP。有氧条件下，TCA循环活泼，呼吸链的氧化磷酸化大量合成ATP，细胞能荷增加，异柠檬酸脱氢酶受到ATP抑制，导致柠檬酸的积累，柠檬酸和ATP都是磷酸果糖激酶活性的抑制剂，从而限制了葡萄糖的利用速度。在厌氧条件下，酵母菌无法通过呼吸链产生ATP，细胞能荷较低，ADP和AMP激活磷酸果糖激酶，使利用葡萄糖生产酒精的速度加快。图4.2.3说明了巴斯德效应的机理。
图4.2.3 巴斯德效应的本质 PFK：磷酸果糖激酶；ID：异柠檬酸脱氢酶；（E）：表示抑制 4.3 微生物代谢调节的模式 在微生物合成代谢过程中，反馈阻遏和反馈抑制往往共同对代谢起着调节作用，它们通过对酶的合成和酶的活性进行调节，使细胞内各种代谢物浓度保持在适当的水平。反馈阻遏是转录水平的调节，产生效应慢，反馈抑制是酶活性水平调节，产生效应快。此外，前者的作用往往会影响催化一系列反应的多个酶，而后者往往只对是一系列反应中的第一个酶起作用。下面将讨论它们对代谢调节的模式。 4.3.1直线式代谢途径的反馈控制 对于只有一个末端代谢产物的途径，即直线式代谢途径，当末端代谢产物达到一定浓度时，就会反馈控制该代谢途径。末端产物的反馈阻遏一般是阻止该途径中所有酶的合成，末端产物抑制一般是抑制该途径第一个酶的活性。如图4.3.1所示, 由A生成E，需要经过中间代谢产物B、C和D，当E达到一定浓度后，它或者反馈抑制催化A生成B反应的酶活性，或者反馈阻遏分别催化A到B、B到C、C到D和D到E反应的所有酶的合成。 在研究大肠杆菌的异亮氨酸合成途径时，首先发现了直线式代谢途径的反馈抑制。苏氨酸是合成异亮氨酸的前体，在培养基中给苏氨酸缺陷型大肠杆菌补充苏氨酸时，该菌株可以合成异亮氨酸，但若同时在培养基中添加异亮氨酸，就不能利用苏氨酸合成异亮氨酸了。这是因为异亮氨酸抑制了由苏氨酸转化为异亮氨酸途径的第一个酶，即L-苏氨酸脱氨酶，见图4.3.2。后来发现其它氨基酸和核苷酸的代谢途径中也有类似的现象。如图4.3.3所示的大肠杆菌中由氨甲酰磷酸和天门冬氨酸合成胞嘧啶核苷三磷酸（CTP）时需要七种酶，当CTP达到一定浓度后，便反馈抑制催化第一个反应的酶，即天门冬氨酸转氨甲酰酶。
图4.3.1 直线式末端产物反馈控制
图4.3.2 异亮氨酸合成途径中的直线式反馈抑制
图4.3.3 大肠杆菌CTP合成途径中的直线式反馈抑制 反馈阻遏还有另一种形式，即末端产物阻遏与中间产物诱导的混合形式。如图4.3.4所示，末端产物D的积累会阻遏该途径中第一个酶的合成。当末端产物D浓度下降时，第一个酶恢复合成，从而导致中间产物B在胞内累积。B浓度的增高，又诱导第二、三个酶的合成，使途径逐渐畅通。当D浓度上升到一定值时，第一个酶的合成受阻，B浓度下降，不再诱导第二、三个酶的合成，该途径逐渐阻塞。这种模式存在于粗糙链孢霉的亮氨酸合成途径中，产物亮氨酸会阻遏该合成体系的第一个酶——异丙基苹果酸合成酶的合成，同时抑制其活性。这个酶的产物异丙基苹果酸却能诱导反应序列中第二、三个酶的合成。
图4.3.4 末端产物阻遏和中间产物诱导的混合控制 4.3.2 分支代谢途径的反馈控制 由几种末端代谢产物共同对生物合成途径进行控制的体系较为复杂。即便是同一代谢途径，不同菌种也会有不同的控制模式。这些控制可以是反馈阻遏或反馈抑制单独作用的结果，也可以是两者共同作用的结果。 4.3.2.1协同或多价反馈控制（Concerted or multivalent feedback control) 分支代谢途径的几个末端产物同时过量时，该途径的第一个酶才会受到反馈阻遏或反馈抑制（见图4.3.5）。如多粘芽孢杆菌（Bacillus polymyxa)在合成天门冬氨酸族氨基酸时，天门冬氨酸激酶受赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制。如果仅是苏氨酸或赖氨酸过量，并不能引起抑制作用。
图 4.3.5 末端产物D和F协同反馈控制模式 4.3.2.2.合作反馈控制（Coopreative feedback control） 这类控制体系与协同反馈控制类似，但是该体系中的末端产物都有较弱的独立控制作用。当所有的末端产物同时过剩时，会导致增效的阻遏或抑制，即其阻遏或抑制的程度比这些末端产物各自独立过量时的总和还要大，因此，又称为增效反馈控制（Synergistic feedback control），见图4.3.6。当只有一个末端产物（图中的D）过量时，紧接着分支点（图中的B）后的反馈控制立即起作用，限制该末端产物的合成，代谢将转向细胞仍需要合成的其它产物继续进行（图中的F）。
图4.3.6 末端产物D和F合作反馈控制模式 4.3.2.3累积反馈控制（Cumulative feedback control） 每个分支途径的末端产物都独立于其它末端产物，以一定百分比控制该途径第一个共同的酶所催化的反应。当几个末端产物同时存在时，它们对酶反应的抑制是累积的，各末端产物之间既无协同效应，也无拮抗作用。如图4.3.7所示，D和F分别独立地抑制第一个酶活性的30%和40%，那么，当D和F均过量时，它们对第一个酶的总抑制是58%，即100%-（100%-30%）×（100%-40%）=58%。与合作反馈控制的情况相似，每个末端产物肯定会对紧接分支点B后的反应施加控制，以使共同的中间产物B不再用于已过量的产物合成。
图4.3.7 末端产物D和F的累积反馈控制模式 累积反馈抑制最早在大肠杆菌的谷氨酰胺合成酶调节中发现，见图4.3.8。该酶受8个最终产物的累积反馈抑制，只有当它们同时存在时，酶活性才会被完全抑制。如色氨酸单独存在时，可抑制酶活性的16%，CTP为14%，氨基甲酰磷酸为13%，AMP为41%，这4种产物同时过量时，酶活性被抑制63%。所剩的37%酶活性则受到其它四种产物——组氨酸、丙氨酸、葡萄糖磷酸和甘氨酸的累积抑制。
图4.3.8 谷氨酰胺合成酶的累积反馈抑制 4.3.2.4 顺序反馈控制（Sequential feedback control） 在顺序反馈控制体系中，直接对第一个共同的酶起控制作用的并不是末端产物，而是分支点上的中间产物。如图4.3.9所示，每个末端产物均对紧接分支点B后导向各自分支途径的酶进行控制，D抑制B向C反应，F抑制B向E反应，D、F单独或两者共同的抑制作用将导致B的积累，过量的B又会抑制A向B反应。顺序反馈控制存在于枯草芽孢杆菌芳香族氨基酸合成和球形红假单孢杆菌苏氨酸合成的代谢途径，分别见图4.3.10和图4.3.11。
图4.3.9 顺序反馈控制的模式
图4.3.10 枯草杆菌芳香族氨基酸合成途径中的顺序反馈抑制
图4.3.11 球形红假单胞菌苏氨酸合成途径中的顺序反馈抑制 4.3.2.5 同工酶控制（Isoenzyme control） 同工酶又称同功酶，是指催化相同的生化反应，但酶蛋白结构有差异，而且控制特征也不同的一组酶的通称。它们虽然在同一细胞个体或组织中，但在生理、免疫和理化性质上存在差异。如果代谢途径中某一反应受到一组同工酶的催化，那么不同的同工酶可能受各不相同的末端产物控制。如果紧接分支点后的酶受其对应的末端产物控制，那么，同工酶控制体系将更有效。如图4.3.12所示，从A到B反应由同工酶a和b催化，当末端产物F过量时，受F 控制的从A到B的同工酶b和从B到E的酶被抑制，而同工酶a不受影响，使A能顺利合成D，因此，F的过量不会干扰D的合成。同样道理，D的过量也不会干扰F的合成。
图4.3.12 末端代谢产物D和F的同工酶控制模式 通过同工酶进行反馈控制的实例很多，例如大肠杆菌有三个天门冬氨酸激酶和两个高丝氨酸脱氢酶参与催化赖氨酸和苏氨酸的合成。天冬氨酸激酶Ⅰ和高丝氨酸脱氢酶Ⅰ可被苏氨酸抑制和阻遏，高丝氨酸脱氢酶Ⅱ可被甲硫氨酸阻遏，天冬氨酸激酶Ⅲ可被赖氨酸抑制和阻遏，见图4.3.13。
图4.3.13 大肠杆菌合成苏氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸中的同工酶调节 E表示末端产物反馈抑制；R表示末端产物反馈阻遏 4.4 代谢的人工控制及其在发酵工业中的应用 工业发酵的目的就是大量地积累人们所需要的微生物代谢产物。在正常生理条件下, 微生物总是通过其代谢调节系统最经济地吸收利用营养物质用于合成细胞结构，进行生长和繁殖，它们通常不浪费原料和能量，也不积累中间代谢产物。人为地打破微生物的代谢控制体系，就有可能使代谢朝着人们希望的方向进行，这就是所谓代谢的人工控制。虽然微生物代谢调节的理论目前还有很大的局限性，但它已在微生物育种和发酵工艺的优化中发挥了重要的作用。随着代谢调节理论的不断充实和完善，代谢的人工控制将对发酵工业发挥更加重要的作用。目前，人工控制代谢主要是通过遗传学和生物化学方法来实现的。 4.4.1遗传学的方法 通过改变微生物遗传物质可以从根本上打破微生物原有的代谢控制机制，具体包括应用特定的营养缺陷型突变株和抗反馈调节的突变株的选育。 4.4.1.1 营养缺陷型突变株的应用 在一定的培养条件下，营养缺陷型突变株可以积累相当高浓度的中间代谢产物或末端代谢产物。对于直线式代谢途径，选育末端代谢产物营养缺陷型的突变株只能积累中间代谢产物，而末端代谢产物对菌体生长仍是必需的。所以，应在培养基中限量供给该物质使之足以维持该菌株生长，但又不致造成反馈调节（阻遏或抑制），这样才有利于该菌株积累中间代谢产物。如图4.4.1(1)所示，末端产物E对途径第一个酶有反馈阻遏或反馈抑制，而菌株失去了将C转化成D的能力，是E的营养缺陷型。假如在培养基中限量添加E，菌体得以生长，中间产物C能够大量积累。枯草芽孢杆菌的精氨酸缺陷型就是一个典型例子, 鸟氨酸积累量可达到25克/升。
图4.4.1 利用营养缺陷型大量积累特定代谢产物的途径 “┄”表示营养缺陷突变位置；“≠”表示反馈调节解除 各图成立的条件：1. 限量添加E；2.限量添加E；3.限量添加E和G；4.限量添加E和G；5.限量添加I 对于分支代谢途径而言，情况比较复杂。如图4.4.1（2）所示，分支途径因E和G对途径第一个酶有协同反馈控制，而突变株失去了将C转变成D的能力，产物E无法正常生成, 从而解除了E和G的协同反馈控制。若培养基中限量补充E，由于末端产物G对C到F反应的控制，就会造成中间产物C的积累；图4.4.1(3)与图4.4.1(2)的情况相似，但该突变株是E和G双重缺陷型，因而需限量添加E和G ；图4.4.1(4)是另一种营养缺陷型，突变株失去了从F转变成G的能力，在限量补充E和G的情况下，可以积累F；图4.4.1(5)中末端产物E和I对途径第一个酶有协同反馈控制作用，突变株失去了将C转变成F的能力，所以，它也是双重营养缺陷菌株。如果培养基中限量添加G和I，可以积累末端产物E。 在许多微生物中，可用天冬氨酸为原料，通过分支途径合成赖氨酸、苏氨酸和蛋氨酸。赖氨酸是重要的必需氨基酸，在食品、医药和畜牧业上需求量很大。但在代谢途径中，一方面由于赖氨酸和苏氨酸对天冬氨酸激酶有合作反馈抑制作用，另一方面，天冬氨酸除合成赖氨酸外，还作为合成苏氨酸和蛋氨酸的原料。因此，正常的细胞内难以积累较高浓度的赖氨酸。为了解除正常的调节以获得赖氨酸的高产菌株，有人选育谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）的高丝氨酸缺陷型作为赖氨酸的发酵菌种。该菌种由于不能合成高丝氨酸脱氢酶（HSDH），故不能合成高丝氨酸，也不能合成苏氨酸和蛋氨酸，在补充适量高丝氨酸（或苏氨酸和蛋氨酸）条件下，菌株能大量产生赖氨酸，见图4.4.2。
图4.4.2 谷氨酸棒杆菌的代谢调节与赖氨酸生产 E：表示反馈抑制；R：表示反馈阻遏 肌苷酸是重要的呈味核苷酸，它是嘌呤核苷酸生物合成途径中的一个中间代谢产物，见图4.4.3。选育在肌苷酸转化成腺苷酸或鸟苷酸的几步反应中的营养缺陷型菌株，才能积累肌苷酸。如腺苷酸琥珀酸合成酶缺失的腺嘌呤缺陷型在少量添加腺苷酸的培养基中能正常生长并积累肌苷酸。
图4.4.3 肌苷酸合成途径的代谢调节 (R)：表示反馈抑制；(1)：5-磷酸核糖焦磷酸激酶；(2)：5-磷酸核糖焦磷酸转胺酶；(12)：腺苷酸琥珀酸合成酶；(13)：腺苷酸琥珀酸分解酶；(14)：肌苷酸脱氢酶；(15)：黄苷酸转胺酶 次级代谢产物青霉素与初级代谢产物赖氨酸是同一分支代谢途径的两个产物，见图4.4.4。它们的共同前体是(-氨基已二酸。赖氨酸对合成(-氨基已二酸的酶有反馈阻遏或抑制作用，当赖氨酸达到一定浓度后，便阻止(-氨基已二酸的合成，也阻止了青霉素的合成。选育赖氨酸营养缺陷型，就可解除赖氨酸反馈调节，同时，也切断了通向赖氨酸的代谢支路，使大量生成的(-氨基已二酸用于青霉素的合成。
图4.4.4. 青霉菌（Penicillum chrysogonum）合成赖氨酸和青霉素中的反馈抑制 (E)：表示反馈抑制 4.4.1.2抗反馈控制突变株的应用 抗反馈控制突变株就是指对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性，或两者兼而有之的菌株。在这类菌株中，反馈调节已经解除，所以能大量积累末端代谢产物。抗反馈抑制突变株可以从结构类似物抗性突变株和营养缺陷型回复突变株中获得。 添加了结构类似物的培养基就象一个筛子，可以将解除了反馈控制的突变株筛选出来。这些与末端代谢产物结构类似的化合物会干扰正常菌体的代谢，甚至引起菌体死亡，所以又称为抗代谢物。这里以氨基酸代谢为例进行讨论。正常情况下，代谢末端产物氨基酸A是菌体蛋白的必需组成成分，它能反馈阻遏或抑制合成它的有关酶。它的结构类似物A’在空间结构上与之相似，也能象A一样与原阻遏物或调节酶的调节亚基结合，从而发生阻遏或抑制作用。但A’不能正常参与蛋白质的合成，或只能合成无活性的蛋白质。所以当结构类似物A’达到一定浓度后，一方面A’能起反馈控制作用，阻止A的正常合成，另一方面A’又无法代替A参与正常蛋白质的合成，从而造成正常的细胞因缺乏A而饥饿死亡。但如果突变株解除了反馈控制，即末端产物氨基酸A无法与原阻遏物或调节亚基结合，那么A’也就无法起反馈调节作用，A’的毒害作用就表现不出来。我们说该菌株对A’有抗性而得以生存下来。根据以上原理，只要选取结构类似物抗性突变株，就有可能得到解除了反馈调节的突变株。当然，结构类似物抗性菌株不一定都是解除反馈调节的菌株。 一般来说，A’与原阻遏物或调节亚基的亲和力没有A强，所以可以用加入A的方法消除A’的毒性。 许多氨基酸、嘌呤、嘧啶和维生素的结构类似物已用于氨基酸、核苷、核苷酸和维生素高产菌株的育种工作，见表4.4.1。如钝齿棒杆菌在含苏氨酸和异亮氨酸的结构类似物AHV（(-氨基-(-羟基戊酸）的培养基中培养时，由于AHV可以干扰该菌的高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸脱氢酶及二羧酸脱水酶，所以，抑制了该菌的正常生长。如果采用诱变获得的抗AHV突变株进行发酵，就能分泌较多的苏氨酸和异亮氨酸。这是因为该菌株的高丝氨酸脱氢酶或苏氨酸脱氢酶和二羧酸脱水酶的结构基因发生了突变，不再受苏氨酸或异亮氨酸的反馈抑制，促使了大量积累苏氨酸和异亮氨酸。如进一步选育出蛋氨酸缺陷型，蛋氨酸合成途径上的两个反馈阻遏也被解除, 则苏氨酸的产量将进一步提高。 表4.4.1 选育抗反馈突变菌株所使用的结构类似物 目标产物 苯丙氨酸 酪氨酸 酪氨酸 色氨酸 缬氨酸  结构类似物 对氟苯丙氨酸 对氟苯丙氨酸 D-酪氨酸 5-甲基色氨酸 (氨基丁酸  目标产物 异亮氨酸 亮氨酸 苏氨酸 蛋氨酸  结构类似物 缬氨酸 三氟亮氨酸 (氨基-(-羟基戊酸 乙硫氨酸  目标产物  蛋氨酸 组氨酸 腺嘌呤 尿嘧啶  结构类似物  (-甲基蛋氨酸 2-噻唑丙氨酸 2,6二氨基嘌呤 5-氟尿嘧啶   从营养缺陷型回复突变株也有可能获得解除反馈调节的菌株。调节酶的变构特性是由其结构基因决定的，如果调节酶的基因发生突变而失活，则有两种可能性：一是催化亚基和调节亚基的基因均发生突变；另一种可能仅仅是催化亚基发生突变。如果前者发生回复突变，则又有两种可能性，一是催化亚基和调节亚基恢复到第一次突变前的活性水平, 另一种可能是催化亚基得以恢复，而调节亚基丧失了调节的功能。由于调节酶失活与否可以直接表现为某种营养缺陷，因此，可以用营养缺陷型回复突变的方法，从营养缺陷型回复突变株中获得对途径调节酶解除了反馈调节的突变株。 4.4.1.3 选育组成型和超产突变株 如果调节基因发生突变，以致产生无效的阻遏物而不能与操纵基因结合，或操纵基因突变，从而造成结构基因不受控制地转录，酶的生成将不再需要诱导剂或不再被末端产物或分解代谢物阻遏，这样的突变称为组成型突变。少数情况下，组成型突变株可产生大量的、比亲本高得多的酶，这种突变称为超产突变。 在恒化培养器中以低浓度的底物诱导剂连续培养细菌，就可能选育出组成型突变的菌株。用这种方法已选出不需乳糖诱导就大量积累(-半乳糖苷酶的大肠杆菌。 采用在添加或不添加诱导剂的培养基中交替培养的方法，也可以从群体中筛选出抗反馈调节的菌株。例如，先用含葡萄糖的培养基培养诱变过的大肠杆菌群体，占少数的抗反馈调节菌株和占多数的原始菌株都能生长，再将混合培养物转移到含乳糖的培养基中，因为原始菌株需要时间诱导产生乳糖代谢的酶，而抗反馈调节的菌株就能迅速适应此培养基。将混合培养物及时转移回葡萄糖培养基中，解除反馈调节菌株就会逐渐占据优势。 如果某种化合物是诱导酶的良好底物，但不是好的诱导剂，那么，以这种物质作碳源，就可选出组成型突变株。例如利用乙酰-(-半乳糖苷可选出(-半乳糖苷酶的组成型突变株。 4.4.1.3 增加结构基因数目 增加发酵产品的结构基因数目当然可以提高发酵产物的产量。现代基因操作技术完全可以担此重任。如大肠杆菌引入一个携带(-半乳糖苷酶的质粒后，可以增加3倍的(-半乳糖苷酶产量。 携带细菌结构基因的转导噬菌体溶源化大肠杆菌后，该原噬菌体可被诱导复制，噬菌体复制结果是在每个细胞中增加许多基因数目，这些基因编码的酶就可大量合成。 4.4.2生物化学方法 4.4.2.1 添加前体绕过反馈控制点 不通过遗传学方法也能改变菌株的调节机制，采取添加前体绕过反馈调节点是一种有效的方法，能使某种代谢产物大量积累。如图4.4.5所示，在发酵培养基中添加C，可以大量积累D。其原因是D的前体C来自外源，并不会因为D的积累而有很大的波动。由于F对从C到E 的反应有反馈调节，所以，只有少部分的C 用于合成F，大部分外源的C用于合成D。
图4.4.5 添加前体绕过反馈调节点 4.4.2.2 添加诱导剂 诱导酶只有在诱导剂存在时才形成，因此，在培养基中加入诱导剂，可以大量合成这类酶。从提高诱导酶合成量来说，最好的诱导剂往往不是该酶的底物，如大肠杆菌(-半乳糖苷酶的最有效诱导剂是异丙酰-(-D-硫代半乳糖苷，它不被(-半乳糖苷酶分解。高浓度底物诱导剂的利用速率太快时，也会引起分解代谢物的阻遏，因此对于许多工业发酵生产胞外酶的过程来说，如果以高浓度底物为诱导剂，产量反而不高。用底物的衍生物做诱导剂，因为利用速度缓慢，可以消除分解代谢物的阻遏，显著提高酶的产量。例如利用蔗糖单棕榈酸酯代替蔗糖作诱导剂可以使双孢拟内孢霉的转化酶产量提高约80倍。 4.4.2.3发酵与分离过程耦合 反馈调节的启动因素就是超过菌体正常需求量的末端代谢产物，也就是说，只有末端代谢产物的浓度超过一定值后，菌体的反馈调节机制才会发挥作用。如果我们在发酵的同时就将末端代谢产物不断地移走，使发酵体系中末端代谢产物的浓度始终处于较低的水平，那么菌体内代谢途径将始终畅通无阻。 与发酵过程耦合的分离手段很多, 有膜分离、离子交换分离和萃取等，这些分离装置应该具有分离效率高、抗污染、易于重复使用等特点。 4.4.2.4 控制细胞膜的通透性 微生物细胞膜对细胞内外物质的运输具有高度的选择性。细胞内代谢产物常以较高浓度积累在细胞内，并反馈控制它的进一步合成。采用生理学方法，可以改变细胞膜通透性，使细胞内代谢产物迅速渗透到细胞外，消除反馈控制，有利于提高发酵产量。 生物素是脂肪酸生物合成中乙酰CoA羧化酶的辅基，该酶催化乙酰CoA的羧化生成丙二酸单酰CoA，进而合成细胞膜磷脂的主要成分脂肪酸。因此，只要控制生物素的含量就可以改变细胞膜的成分，进而改变膜的通透性，影响到代谢产物的分泌。 在谷氨酸发酵生产中，生物素的浓度对谷氨酸的积累有明显的影响，只有把生物素的浓度控制在亚适量情况下，才能大量分泌谷氨酸，若过量供给生物素，菌体内虽有大量谷氨酸积累，但不能分泌到体外。表4.4.2列出了培养基中生物素浓度不同时的发酵结果，可以看到当生物素含量为2.5mg/ml时，谷氨酸的产量最高，继续增加生物素，谷氨酸产量反而下降。 表 4.4.2 生物素对谷氨酸棒杆菌的谷氨酸产量的影响 生物素(mg/ml) 残糖(%) 谷氨酸(mg/ml) (-酮戊二酸(mg/ml) 乳酸(mg/ml)  0.0 0.5 1.0 2.5 5.0 10.0 25.0 50.0 8.5 2.5 0.5 0.4 0.1 0.2 0.1 0.1 1.0 17.0 25.0 30.8 10.8 6.7 7.5 5.1 微量 3.0 4.6 10.1 7.0 8.0 10.1 6.2 微量 7.6 7.4 6.9 13.7 20.5 23.1 30.0   当培养液中生物素含量较高时，添加适量的青霉素也有提高谷氨酸产量的效果。其原因是青霉素可抑制细菌细胞壁肽聚糖合成中转肽酶活性，结果引起其结构中肽桥间无法交联，造成细胞壁缺损，这有利于代谢产物渗漏到胞外。 甘油缺陷型菌株的细胞膜中磷脂比野生型菌株低，容易造成谷氨酸大量渗漏。应用甘油缺陷型菌株，就是在生物素或油酸过量情况下，也可以获得大量的谷氨酸。解烃棒杆菌利用石油为原料进行谷氨酸发酵，在限量供给甘油（200微克/升）和大量供给生物素（100微克/升）或油酸（100微克/升）的情况下，仍可获得72克/升的谷氨酸。 用外加阳离子表面活性剂（如聚氧化乙酰硬脂酰胺）改变细胞膜的通透性也可以使谷氨酸大量渗出。 在产氨短杆菌的核酸发酵中也有类似情况，但控制因素是Mn2+。若培养基中Mn2+的浓度高，菌体生长良好，呈正常的卵圆形，但很少生成肌苷酸。当限量供应Mn2+（不超过10微克/升）时，生长受抑制，菌体伸长，呈不规则形状，但大量产生肌苷酸。此时，菌体内脂肪酸（软脂酸和油酸）的含量显著下降，这说明Mn2+与生物素的作用相似，主要影响细胞膜磷脂的合成，改变细胞膜通透性，使核苷酸能不断渗到体外。 遗传学方法也能用于改变细胞膜的通透性。应用谷氨酸生产菌的油酸缺陷型菌株，在限量补充油酸的培养基中，因为油酸是细菌细胞膜磷脂中重要的脂肪酸，油酸缺陷型突变株不能合成油酸而使细胞膜缺损, 使细胞膜发生渗漏而提高谷氨酸的产量。 4.4.2.4控制发酵的培养基成分 次级代谢产物的生成大多与快速被利用碳源（主要是葡萄糖）的消耗密切相关。只有在葡萄糖几乎耗尽，生长停止时，才开始大量合成次级代谢产物。如果仅是由于氮或磷等耗尽而导致生长停止，而培养基中还有大量葡萄糖存在时，次级代谢产物不会大量地合成。显然，这是因为葡萄糖（或其它快速被利用碳源）的分解代谢物阻遏着次级代谢所需酶的合成。只有葡萄糖被消耗到一定浓度，使分解代谢物水平降低，才会解除这种阻遏。如果此时加入蛋白合成抑制剂氯霉素，则次级代谢将会受阻，这可以说明次级代谢有关的酶是新合成的，并非只是酶的激活。 在发酵工业中为了提高次级代谢产物的产量，常采用混合碳源培养基或在后期限量流加葡萄糖的方法。混合碳源由能被快速利用的葡萄糖和缓慢利用的乳糖或蔗糖等组成。例如：早期生产青霉素时常采用葡萄糖和乳糖为混合碳源，葡萄糖被快速利用以满足青霉菌生长的需要，当葡萄糖耗尽，才利用乳糖并开始合成青霉素。乳糖不是青霉素的直接前体，它所以有利于青霉素合成，是因为它利用缓慢，使分解代谢物处于较低水平，不致于阻遏青霉素合成。当生长停止后限量流加葡萄糖也是为了达到同样的目的。