第十二章 微生物与环境保护 我们只有一个地球。现在，保护地球的环境已经成了人类的共识，也是我国可持续发展战略的重要组成部分。随着人口增加及人类生产和生活活动的增加，人类物质和精神文明的水平得到了很大的提高。但是人们在对环境质量的要求越来越高的同时，对环境的威胁和破坏也越来越严重。在工业化发展的初期，人们一方面对环境问题还缺乏认识，另一方面出于对发展经济的良好愿望，往往会忽略工业化对环境的破坏作用；当工业化发展到一定程度时，人们已经开始认识到了保护环境的重要性，又会发现环境保护的复杂性和困难性。环境保护是需要全社会共同努力并持之以恒的一项伟大事业。微生物在环境中扮演着十分重要的角色，一直默默地为保护环境作出了重要的贡献，随着人们对微生物和环境关系研究的不断深入，微生物在环境保护中必将发挥更大的作用。 在自然生态环境（土壤、水和空气）中，存在着大量的、形形色色的微生物，它们具有将有机物经氧化、还原、转化、分解等途径最终转化为无机物的巨大能力，在自然界的碳、氮、氧、硫、磷等元素的物质循环中起着不可替代的重要作用。人们在实践中发现可以采用各种方法强化微生物的这些功能，在人工创造的环境中，使微生物在最有利的条件下分解人类生活和生产活动中排放的污染环境的废弃物。用微生物处理废弃物已经成了保护环境最有效的方法之一。 12. 1 环境中微生物的相互作用 在自然环境中，许多不同的微生物共同生活，相互之间存在着复杂的关系。微生物用于处理环境中的污染物时，往往也是通过多种微生物、甚至原生动物的共同作用完成的。因此研究不同微生物之间的相互作用具有非常重要的意义。在自然或人工生态系统中，由于环境因素的影响，如营养物种类、pH及温度等，微生物群中往往又是由几种微生物占据着统治或优势地位，这样会对微生物群的生物多样性造成一定的限制。因此为了减少分析讨论的复杂性，而又能反映出微生物相互作用的特点，我们将把讨论的重点放在只有二、三种微生物组成的简单系统。 微生物之间的相互作用可以根据一种微生物是否因为另一种微生物的存在而受益、受害或不受影响进行分类，表12.1.1列出了各种相互作用的类型。 表12.1.1 微生物间相互作用的分类 相互作用分类 特点 相会作用对微生物的影响    微生物 A 微生物B  种间共处(neutralism) 微生物间没有相互作用 0 0  共栖现象(commensalism) 一种受益而其它种不受影响 0 +  互惠共生(mutualism) 每一种都因其它种的存在而受益 + +  竞争作用(competition) 微生物间为营养或空间而竞争 - -  偏害共生(amensalism) 一种微生物改变了环境并不利于另外物种生长 0或+ -  寄生现象(parasatism) 一种微生物寄生在另一种上 + -  捕食现象(predation) 一种微生物捕食其它微生物 + -  0——不受影响；+——有利于生长；-——不利于生长 如果不同的微生物之间存在种间共处，就说明这些微生物所利用的营养物质不同，它们释放到环境中的代谢产物不会影响其他微生物的生长。这种情况在自然界几乎不存在，只在实验室中观察到了几个特殊例子。例如，专性无机化能营养菌Thiobacillus neapolitanus 和专性异养菌Spirillum G7能够在交替供应还原态硫化物和醋酸的培养基中共存，它们的生长不会因对方存在而受到影响。 共栖现象可以分为两种情况：属于第一种情况时，一种微生物的代谢产物是另一种微生物生长所必需的营养物质，而后者对其本身的生长则没有明显的影响；另一类是一种微生物除去了环境中的有害物质，使得其它微生物能够生长。共栖生长的共同特点是一种微生物受益而其它微生物不受影响。表12.1.2列出了这两种共栖现象的例子。 表12.1.2 共栖现象的典型例子 A）、一种微生物为另一微生物提供生长所需的物质 化合物 产生该化合物的微生物 受益微生物  烟酸 酵母Saccharomyces cerevisiae 变形杆菌Proteus vulgaris  硫化氢 脱硫弧菌Desulfovibrio 硫细菌Sulphur bacteria  甲烷 厌氧甲烷菌Anaerobic methane bacteria 甲烷氧化菌Methane oxidizing bacteria  硝酸盐 硝化杆菌Nitrobacter 反硝化杆菌Denitrifying bacteria  果糖 醋杆菌Acetobacter suboxydans 酵母Saccharomyces carlsbergensis  B)、一种微生物除去了有害于另一种微生物生长的化合物 化合物 微生物间的相互关系  氧 好氧微生物消耗氧气以利于厌氧微生物生长  硫化氢 有毒的硫化氢被光自养型硫细菌消耗以利于其它微生物生长  食品防腐剂 一种微生物将苯甲酸等防腐剂降解，使其它微生物能够生长  含汞杀菌剂 脱硫菌将硫酸盐或硫化物还原为硫化氢并与含汞杀虫剂结合，这样其它微生物才能生长   互惠共生的微生物之间存在着密切的相互依赖关系，如果不加入特殊的生长因子，每种微生物在单独培养时都无法生存，但当它们混合培养时，由于能互相提供对方生长所需的生长因子，就能够生长。生长因子的交换对双方都有利。互惠共生的一个典型例子是乳杆菌(Lactobacillus)和链球菌Streptococcus)之间的关系，乳杆菌的生长需要苯丙氨酸，但能够产生叶酸，而链球菌则正好相反，需要叶酸而产生苯丙氨酸。两者混合培养时正好满足了对方的生长需求。另外一个生态系统中的例子是藻类和细菌之间的关系，通过光合作用，藻类利用二氧化碳合成碳水化合物，并产生氧气；而细菌则利用藻类产生的碳水化合物和氧气，释放出二氧化碳。这是自然界中碳循环的重要组成部分。 如果互惠共生是微生物生长的必要条件，则称为共生现象（Symbiosis）。白蚁能够消化纤维素，但白蚁自身不会产生纤维素酶，而是通过寄生在原生动物上的细菌所分泌的纤维素酶将纤维素水解，然后才能被利用。在牛胃中也存在着类似的关系，瘤胃微生物能够帮助消化植物性饲料。 竞争作用是指许多微生物为了生存而对环境中那些有限的、共同需要的营养要素，如营养物质、光、水及生存空间等，进行竞争的现象。在微生物系统中，微生物之间的竞争一般不是因为一种微生物产生了对其它微生物有害或有利的化合物，而是由于微生物的密度和传代速度的快慢引起的。这种竞争往往非常激烈，只有当环境中有限的营养资源消耗完时竞争才会结束。竞争也是微生物产生突变的重要原因，通过突变使微生物具有更强的利用营养物质的能力或获得抗生素抗性，这些突变株就会比原菌株具有更强的竞争力。即使在工业微生物纯种培养中，也会产生自然突变，产生能够更好地适应培养环境的突变株，它们在与原菌株的竞争中逐渐占据优势。 偏害共生关系中，一种微生物在代谢过程产生的有机或无机产物会抑制其它微生物的生长。微生物所合成的某些次级代谢产物，如抗生素，就起着这样的作用。 在寄生关系中，一种较小的有机体寄生在一个较大的宿主细胞上，通过消耗宿主细胞来满足寄生菌的营养需求。寄生者不一定杀死宿主细胞，这一点是与捕食关系相区别的关键。噬菌体系统就是典型的寄生关系，噬菌体本身不会利用环境中的营养物质，完全通过获取宿主细胞中的遗传物质进行复制和合成，因此噬菌体是发酵工业的大敌。 在捕食关系中存在着捕食者(Predator)和牺牲品(Prey)之间的关系。捕食者通过掠夺牺牲品使自己大量繁殖，但是当繁殖到一定程度时，就会出现牺牲品数量大量减少、满足不了捕食者需要的情况，捕食者本身开始死亡。捕食者的数目减少又会使牺牲品恢复增长，捕食者由于有了充分的食物也会随之增长，开始新一轮的循环。捕食关系已经在微生物和动物界中得到证明，并在活性污泥法处理废水时起着重要作用。下面将从数学角度举例说明这种关系。 例12.1.1在微生物群中捕食者-牺牲品关系的Lotka-Volterra公式 设在系统中捕食者和牺牲品的数量分别为n2 和n1，牺牲品的生长速率可以用一级反应动力学描述，而捕食者的生长速率则与n2 和n1的乘积成正比，求捕食者和牺牲品的关系式。 解：系统中捕食者和牺牲品的物料平衡公式可以分别表示为：  (12-1)  (12-2) 式中，a是n1的生长速率常数；(是牺牲品被捕食者捕食的有效消失速率常数；(是捕食者的生长速率常数；b是捕食者的死亡速率常数。上述两个常微分方程的解是：   (12-3) 为了了解式（12-1）和（12-2）所描述的动态行为，需要研究n1(t)与n2(t)之间的关系。将式（12-1）和式（12-2）相除，得到：  (12-4) 上式两边乘以后重排，  (12-5) 这样将式（12-5）积分，可以得到：  (12-6)  (12-7) 积分常数C可以根据n1(t)与n2(t)的初始条件确定。式（12-6）或式（12-7）属于超越方程，只能应用数值方法求解，根据n1(t)与n2(t)的范围，该方程有零个、一个或两个解，图12.1.1显示了方程的解。这是一条封闭曲线，曲线内面积的大小取决于n1(t)与n2(t)的初值。如果将封闭曲线n1(t)与n2(t)用瞬时值描述，就会发现两个组分的振荡现象。 图12.1.1 n1(t)与n2(t)的相平面图。稳定的稳态解 位于封闭曲线中的焦点。 将式（12.1.1）在该系统一个周期内从t = 0 到t = T积分，得到：  (12-8)  (12-9) 注意到经过一个周期后，n1(T) = n1(0)，式（12-9）可以重写为：  (12-10) 由于n2的稳态解等于a/(，因此  (12-11) 上式指出，虽然n2的值在一个循环中始终在变化，每个循环中的平均值始终等于其稳态浓度a/(。积分式（12-2）可以得到关于n1的类似结果。 研究微生物群之间的相互作用不但对生态系统的研究非常重要，在环境保护领域也有重要的应用，例如：利用微生物之间的互惠共生系统可以将环境中的有害化合物降解得更彻底；利用降解有害化合物菌群的生长优势，废水不经过灭菌就可以进行生化处理，并能获得更好的处理效果；利用捕食者和牺牲品的关系可以减少活性污泥的量等。 12. 2 环境保护中常见的微生物群 微生物本身需要不断地繁殖并维持其正常活动，因而需要从环境中获得能源、碳源和其它无机元素。自养型微生物从二氧化碳中获得碳源，在自然界的碳循环中扮演着重要角色，但显然与有机废弃物处理的宗旨不符，因此不能用于环境工程。异养型微生物能够从有机物中获得能源和碳源，与此同时，有机物本身被最终降解为CO2，从而达到废弃物处理之目的，因此是废弃物处理过程中分布最为广泛的微生物群；无机化能异养型微生物从无机化合物获得能源，在有些应用领域非常重要，如生物脱硫、脱氮等。 微生物在环境保护中的应用已经从自然生态系统发展到活性污泥方法处理废水，并进一步扩大到固体废弃物和废气的处理及生物修复领域。参与废弃物生物降解的微生物种类和数量十分庞大，但是根据处理的方法，还是可以将它们分为好氧和厌氧微生物两大类。在好氧活性污泥方法中，一些原生动物也起着很重要的作用。 12.2.1好氧微生物群 在废弃物的好氧生物降解系统中，起主要作用的是细菌、真菌、藻类和原生动物，还可能存在一些后生动物。影响微生物群组成的主要因素是废弃物的种类和处理条件，例如，处理城市污水和化工厂污水的微生物群会有显著的差别；废弃物处理的环境条件，如：温度、pH等也会对微生物的种类和分布产生影响。另外，反应器形式对微生物群的构成也有影响，如用普通的曝气池和形成生物膜的反应器处理同样的废水，由于氧传递的差别会形成不同的微生物群。 好氧的有机化能异养型微生物 属于这一类的细菌主要包括：无色杆菌属、产碱杆菌属、芽孢杆菌属、假单孢菌属、黄杆菌属及微球菌属等。下面将分别进行简要的讨论。 1）无色杆菌属(Achromobacter) 有时也将其分类为不动杆菌属。该属细菌的菌落在24小时后为2-3毫米，通常菌落光滑，有时极粘而附着于培养基上。表面扩散试验表明它们具有抽搐运动的能力。除极少见的情况外，一般不还原硝酸盐。可能产酸或不产酸，在产酸菌株中存在非特异性的醛糖脱氢酶。有些菌株能够液化明胶，有些会产生脲酶。它们不能使苯丙氨酸脱氨，也不能使鸟氨酸、赖氨酸及精氨酸脱羧。能够在以铵盐为氮源和以乙酸盐、丁酸盐或丙酮酸盐为碳源的简单培养基中生长。无色杆菌广泛存在于土壤和水体中，常可以从健康或生病的动物和人体分离得到，但是其致病力尚未确定。典型菌株为从原油污染的海滨分离得到的Achromobacter sp.ATCC21910，具有将原油分散并降解的能力。 2）产碱杆菌属(Alcaligenes) 产碱杆菌都属于Gram阴性菌，好氧生长，最适生长温度范围是15-30oC，最适pH为 8-10。产碱杆菌在自然界分布很广，在土壤、人畜的肠道、牛奶及污水中都能够找到它们的踪迹。它们不能分解糖类，能随粪便而使食物受到污染，乳品和肉类食品受到产碱杆菌污染时会产生粘性而变质。该属细菌的典型菌株是粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)，细胞成杆状，细胞尺寸为0.5(1.0(1.0(2.0(m，单细胞，成对或成链状生长，通常没有荚膜，能够借助于周身鞭毛而运动。 3）芽孢杆菌属(Bacillus) 芽孢杆菌大部分属Gram阳性，只有少数为阴性菌，好氧或兼性厌氧，最适生长温度范围很广，为-5-75oC。它们的外形多数呈杆状，少数呈丝状，尺寸范围为0.3×2.2-1.2×7.0(m，大部分具有夹膜、无运动功能，只有少数生长鞭毛、能够运动。芽孢杆菌会形成耐热的内生孢子，孢子囊的尺寸与营养细胞类似。芽孢杆菌属于化能营养型，能产生多种胞外水解酶，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，具有很强的分解有机物能力。它们在自然界的分布很广，主要生活在土壤中，但是在水体及空气中也可以分离得到。芽孢杆菌基本上是非病原菌，对人畜无害。酶制剂工业中具有重要地位的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是这一属的典型代表。 4）假单孢菌属(Pseudomonas) 假单孢菌是Gram阴性菌，极大部分属专性好氧、化能营养型，个别种能利用氢气或一氧化碳为能源自养生长。它们的生长温度范围为5-45oC，最适生长温度在30oC左右，最适pH为7.0—8.5。假单孢菌一般是直的或弯曲的杆状细菌，细胞尺寸为0.5×1.0-0.4×1.5(m，部分具有单生或丛生鞭毛的假单孢菌能够运动，无鞭毛的则不能运动。假单孢菌在培养时会产生荧光物质及各种颜色的色素。大部分菌种能够将葡萄糖氧化成葡萄糖酸和((酮葡萄糖酸，但是不能氧化乳糖。有些种可以分解脂肪。许多假单孢菌都具有降解芳香属化合物的能力，因此是污水处理中的主要细菌种类。在缺少氮源的条件下，胞内会积累聚((羟基丁酸（PHB），这是一种新型的可生物降解高分子材料。假单孢菌的例子是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。 5）黄杆菌属(Flavobacterium) 黄杆菌是Gram阴性菌，属化能异养型，发酵作用不明显，在含碳水化合物培养液中培养时不产酸也不产气。好氧或兼性厌氧生长。最适生长温度在30oC以下，最适pH为7.0—8.5。大部分黄杆菌有鞭毛、能够运动，多数具有荚膜，不形成芽孢。菌体呈直杆状，尺寸范围为0.5×1.0-0.8×3.0(m。黄杆菌通常生活在土壤、淡水及海水中，有很强的蛋白质分解能力。当环境中存在含氮化合物时，它们不能代谢碳水化合物生成有机酸。在固体培养基上生长时会产生黄色、红色、或褐色等不溶于水的色素。水生黄杆菌(Flavobacterium aquatile)及贪食黄杆菌(Flavobacterium devorans)等是其中的代表性菌种。 6）动胶杆菌属(Zoogloea) 动胶杆菌是在活性污泥及生物膜中形成絮体结构的一类细菌的通称。它们的功能是形成菌胶团或活性污泥絮状体，对曝气池中活性污泥的稳定起着重要作用。动胶杆菌分为生枝动胶杆菌(Flavobacterium ramigira)和悬丝动胶杆菌(Flavobacterium filipendula)两个种。 12.2.1.2原生动物 原生动物是单细胞的微小动物，由原生质和一个或多个细胞核组成。原生动物虽然是单细胞，但从生理上看是一个独立的生物体，即使在群体中也各自独立生活。它们与多细胞动物一样，也具有代谢、运动、繁殖、感应外界刺激和适应环境等生理和生化功能。 原生动物的尺寸比微生物大得多，一般为30×300(m。大多数原生动物的细胞膜结实而有弹性，因此能够保持它们特殊的体形，但也有一些种属的外壁只是一层很薄的原生质膜，这类原生动物就很难保持其体形。 原生动物的原生质分为两层：外层均匀而且透明，无内含物，称为外质；内层呈流体状，含有各种内含物，不太透明，称为内质。 原生动物含有一个或多个细胞核，细胞核的形状各式各样，核的大小也会有很大的差别。有些原生动物的两个核一个大，另一个小，大核负责细胞的运动、代谢等，小核则与细胞的生殖功能有关。 原生动物极大多数都只能生长在有氧的环境中，但对氧的要求不高，即使水中氧的饱和度只有10%也能生存。少数原生动物甚至能在无氧的环境中生存。 原生动物是从微生物进化而来的，其细胞已经分化出执行各种生命活动和生理功能的细胞器，如：运动胞器、营养胞器、排泄胞器、感应胞器。它们的生殖分为无性生殖和有性生殖两类。无性生殖即细胞的分裂，细胞核和原生质一分为二，细胞个体数呈几何级数增加。无性生殖一般发生在营养、温度、氧等供应充分、环境条件良好的场合。有性生殖并不是原生动物专门的繁殖方式，而是出于细胞核更新的需要。有性生殖往往发生在环境条件较差、细胞经过长期的无性繁殖后种群已经衰老的情况。种群通过有性生殖可以增强生命力。原生动物在一定的条件下会分泌胶质、进而形成膜将自身包裹起来，成为胞囊。胞囊的作用是当外界环境因素不利时保护原生动物，属于休眠胞囊。只要环境条件好转，原生动物就会脱囊而出，恢复其生命力。 在废物处理系统中，常见的原生动物有：内足亚门(Sarcodina Schmada)、纤毛门(Ciliophora Doflein)和鞭毛亚门(Mastigophora Dieseng)的一些种。 鞭毛类的原生动物能够通过体表首先将有机物吸附到表面并进而吸收到体内进行代谢。变形虫的伪足能够包裹有机物碎屑，再从体内分泌出消化酶系将其水解后吸收利用。这些摄食方式决定了它们只能生活在高有机物浓度的环境中及污水处理反应器的启动阶段。该阶段首先出现的是异养型游离细菌，然后将大量出现原生动物，常见的有滴虫类、波豆虫类及变形虫类等。随着启动过程的进展，细菌数目大大增加，污水中就会出现能够大量吞噬细菌的原生动物，如游动纤毛虫、肾型虫、豆型虫、漫游虫及变形虫等。当污水中的有机污染物逐渐被微生物消耗和分解后，微生物形成了活性污泥或生物膜，游离的细菌数减少，使纤毛虫等原生动物的食料受到限制而无法生存，游动型纤毛虫就会被固体附着型纤毛虫所代替，同时还会产生以有机物碎屑和生物尸体为食的匍匐型纤毛虫，如楯纤虫。种虫类原生动物的出现标志着污水已经得到很好的净化，有机污染物和游离菌的含量已经很低，活性污泥絮体已经形成而且大量增殖。 随着废水中有机污染物的浓度继续降低，污水中会出现轮虫、线虫及寡毛类动物。轮虫既能够以细菌和原生动物为食，也能吞噬小块的活性污泥，因此即使在游离细菌和游动型纤毛虫被大量吞噬并完全消失的情况下也能继续生存，成为具有生长优势的原生动物种。轮虫的出现标志着活性污泥方法污水处理系统中已经形成了一个比较稳定的生态系统。线虫及寡毛类动物能够大量吞噬污泥絮体，常出现在曝气池中积累了大量活性污泥的时候，有利于降低活性污泥量，减少污泥后处理的工作量。这一阶段中又会出现真菌以消耗掉捕食轮虫和线虫。 在污水生物处理的起动期，原生动物种群的演变规律是：游动型 匍匐型 附着型的变化及从鞭毛虫 纤毛虫 根足虫 鞭毛虫的演变过程，充分体现了生态系统中适者生存的普遍规律。在稳定期则存在捕食者和牺牲品之间的关系。正是由于微生物和原生动物之间复杂的相互作用，提高了污水处理的效率、降低了活性污泥量，使好氧的活性污泥方法在城市污水和工业污水处理过程中得到了广泛的应用。 12.2.1.3与污泥膨胀有关的微生物 在污水的好氧处理过程中，有机污染物一部分被彻底氧化为二氧化碳和水，另一部分则被转化为微生物菌体或原生动物体。由于菌体与原生动物体也是有机物，因此离开污水生化处理装置的出水质量与出水中污泥的分离程度存在着密切的关系。如果污泥发生膨胀，就会危及污泥的分离，使出水中的有机物含量增加，从而大大降低污水处理的效果。造成污泥发生膨胀的微生物主要有：球衣菌、贝日阿托氏菌和芽孢杆菌等细菌。 1）球衣菌属(Sphaerotilus) 在活性污泥中若存在球衣菌属细菌，将会引起污泥的丝状菌性膨胀。球衣菌属Gram阴性菌，呈杆状或圆柱状，尺寸为0.7×2.4-3.0×10.0(m，有一束亚端生的鞭毛，化学异养型，严格好氧，通过呼吸代谢，从不发酵。球衣菌的最适pH和温度分别为5.8-8.1和15-40oC。该属细菌具有衣鞘，内中包括多个细胞并形成丝状体，菌体几乎无色。生长旺盛的球衣菌其衣鞘紧贴在细胞表面，许多这种有外鞘裹着的长链牢固地粘在一起形成长穗状物，再附着于淹没在水中的固体表面。虽然球衣菌严格好氧，但对溶氧的适应性却很强，对其它环境条件和有机物种类的适应能力也非常强。如果废水处理时溶氧浓度很低并小于某些细菌的临界值时，这些细菌就会死亡，而球衣菌则能够忍受这样的低氧环境，得以存活下来。当环境条件好转时又会大量繁殖。若经常发生这样的环境变化，会引起球衣菌的异常增殖，成为活性污泥中的主导菌种。当球衣菌老化时，衣鞘内的细胞链会出现松动或缺位现象。如果活性污泥中球衣菌的比例很高，就会发生污泥膨胀而且不易沉淀，从而影响出水的质量。 2）贝日阿托氏菌(Beggiatoa) 贝日阿托氏菌属于硫细菌，Gram阴性，细胞成链，形成无色的丝状体，能够以滑动方式运动。该科菌属于混合营养或有机化能营养型，呼吸代谢，好氧或微好氧，以分子氧作为最终的电子受体，细胞内可能积累聚(-羟基丁酸或异染粒。当废水中含有较高浓度的硫化物时，会促使贝日阿托氏菌的大量繁殖，引起污泥膨胀。典型的菌种如白色贝日阿托氏菌(B. alba)及巨大贝日阿托氏菌(B. gigantea)。 3）芽孢杆菌属(Bacillus) 如果将枯草芽孢杆菌进行纯种培养，也能够引起污泥膨胀，性状与丝状菌引起的污泥膨胀十分类似。许多种芽孢杆菌能够形成夹膜，而夹膜是粘性物质的重要来源，这些粘性物质在活性污泥中的大量积累是非丝状菌型污泥膨胀的重要原因。此外，环境条件不利时芽孢杆菌可以生成内生孢子，孢子含有一个中心细胞，并被一个有肽烯糖构成的外膜和一层胞外壳所包裹。内生孢子对环境的适应能力和抗性较强，当废水中含有有毒物质时会使有些微生物停止生长并失去活性。环境一旦恢复，芽孢杆菌就会快速恢复和增殖。 以上性质使得芽孢杆菌可能成为活性污泥中的优势菌，从而引起非丝状菌型污泥膨胀。 12.2.2厌氧微生物群 对于含高浓度有机污染物的废水，如来自发酵工业、食品工业等的废水，直接进行好氧生化处理会大大增加曝气池的负荷，降低处理效率及出水质量，因此需要先经过厌氧消化使BOD降低后再进入曝气池。曝气池产生的大量剩余污泥，处理起来十分困难，也需要通过厌氧消化以减少污泥量。农作物秸杆及家畜饲养业产生的有机固体废物，可以在厌氧沼气池中通过厌氧微生物的作用产生甲烷，一方面可以充分利用资源，另一方面又减少了固体废弃物的量。因此厌氧微生物群在环境保护中与好氧微生物群一样具有重要的地位。 厌氧微生物群包含专性厌氧和兼性厌氧两大类，它们在自然界的分布非常广泛。如河流湖泊的底部淤泥及土壤中都存在着大量的厌氧微生物群。在有机污染物的厌氧处理过程中，各种厌氧微生物在有机物降解过程中发挥着不同的作用。有机物的厌氧消化过程及每一步骤中起作用的主要微生物群如图12.2.1所示。 有机污染物（碳水化合物、脂肪及蛋白质等） 水解和发酵细菌 脂肪酸 产氢、产乙酸细菌 乙酸 H2 + CO2 同型产乙酸细菌 乙酸脱羧反应 产甲烷细菌 还原性甲烷形成 CH4 + CO2 图12.2.1 厌氧消化过程及其微生物 厌氧消化过程一般可以分为四个步骤。第一步是有机物的水解和发酵，首先在发酵细菌分泌的胞外酶的作用下，将有机物水解为各自的单体，如单糖、脂肪酸及氨基酸，这些单体化合物能被发酵细菌摄入胞内并通过发酵作用将它们分解为低级脂肪酸、醇等，并释放出CO2、H2、NH3及H2S等气体；第二步是在产氢产乙酸细菌的作用下将各种有机酸和醇进一步分解为乙酸、甲酸、甲醇、H2和CO2等；第三步是产甲烷阶段，在产甲烷细菌的作用下，乙酸及甲酸等通过裂解及还原反应被转化为甲烷（约占甲烷总量的70%），H2和CO2则在合成酶的作用下也被合成为甲烷（约占30%）；最后一步是在同型产乙酸菌的作用下将H2和CO2重新合成为乙酸，这一步在厌氧消化中的作用不是很大。 参与上述每一步骤中的厌氧微生物群是不同的，下面将对每一步起作用的主要微生物进行讨论。 12.2.2.1水解发酵细菌 要将复杂的大分子有机污染物，如碳水化合物、脂肪和蛋白质等降解的第一步是要将它们水解为能够被微生物利用的小分子单体，因此在厌氧处理系统中必须存在能够产生水解酶的微生物群。如果有机污染物主要以大分子的形式存在，水解作用往往是整个消化过程的速率限制步骤，也是影响污染物降解效果的关键。 碳水化合物的代表是淀粉和纤维素。淀粉的水解比较容易，许多厌氧细菌都能够分泌淀粉酶，如：丁酸羧菌(Clostridium bifermentus)、乳杆菌(Lactobacillus)、枯草芽孢杆菌、腊状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等, 它们都能产生水解((1，4和((1, 6糖苷键的淀粉酶, 因此能将淀粉、糖原及其它多糖降解成单糖, 以便于这些细菌本身及其它微生物利用。在厌氧消化液中, 产淀粉酶的细菌浓度约为4(104个/mL。 纤维素的水解要比淀粉困难得多。纤维素是由葡萄糖经(-1, 4糖苷键连接而成的大分子, 纤维素的水解是外切纤维素酶、内切纤维素酶和(-葡萄糖苷酶共同作用的结果。在厌氧消化液中，纤维分解菌的浓度约为4(105个/mL。有人在处理猪粪的消化液中分离得到了11种中温纤维素分解菌，除一种外，其余都是Gram阴性菌。热纤梭菌(Clostridium thermocellum)是一种高温菌，能够将纤维素直接转化为乙醇和乙酸。半纤维素酶在厌氧消化的初期起着重要作用。同样，在处理猪粪的消化液中分离得到了4种产半纤维素酶的菌种，其中一种经鉴定为瘤胃拟杆菌(Bacteroides ruminicola)。 在厌氧消化器中，脂肪的水解尚未得到普遍证实，其原因可能是在细菌的混合培养时脂肪酶的活力会受到蛋白酶的抑制，但也有实验证明乳品加工工业废物中的脂肪可以被脂肪酶水解为脂肪酸和甘油。许多微生物产生的脂肪酶只能作用于甘油酯的1和3位的酯键，只有少数作用于甘油酯的所有3个酯键。消化液中分解脂肪菌的浓度约为104~105个/mL，主要是梭菌和微球菌。 蛋白质分解菌能够产生蛋白酶。若废物中的蛋白质浓度较高，蛋白质分解菌的重要性就增加了。厌氧消化系统中能产蛋白酶的菌种很多，主要的有：双酶梭菌(Clostridium bifermentans)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、产气甲膜梭菌(Clostridium perfringens)、芒氏梭菌(Clostridium mangenotii)、象牙海岸梭菌(Clostridium litusburense)、厌氧消化球菌(Peptococcus anaerobius)及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等。此外八叠球菌属(Sarcina)、拟杆菌属(Bacteriodes)及丙酸杆菌属(Proprionibacterium)的某些种也能生产蛋白酶。有些能产生蛋白酶的菌还同时具有水解多糖的能力。不同来源的蛋白酶有不同的最适pH，对底物的专一性也有很大差别，例如由溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)产生的蛋白酶只能作用于蛋白质的羧基端，而链球菌(Streptococci)的蛋白酶则具有水解多种蛋白质的能力。在厌氧消化系统中产蛋白酶细菌的密度约为104~105个/mL。 在厌氧消化系统中微生物的产酶能力受到底物和产物浓度的影响，可能存在底物或产物的抑制和阻遏，蛋白酶则会引起酶蛋白本身的水解。 蛋白质的水解产物氨基酸能够被微生物摄入体内进行发酵，主要代谢途经是脱氢反应和还原脱氨反应。脱氢反应可以将有机物氧化分解，产生的氢将被甲烷菌利用合成甲醇。氯仿会抑制甲烷菌的活性，从而抑制氨基酸的脱氢降解并改变所产生的挥发性有机酸组成。甘氨酸也是一种氢受体，因此如果在厌氧消化系统中加入甘氨酸，就能够减轻氯仿对氨基酸降解的抑制作用。通过还原脱氨反应，精氨酸将被分解为NH3和CO2，鸟氨酸被转化为乙酸、丙酸、丁酸和戊酸，赖氨酸则分解为乙酸和丁酸等。参与氨基酸厌氧代谢的微生物主要有：梭菌、链球菌及支原体(Mycoplasmas)等。 多糖的水解产物是单糖，能够被许多微生物所利用，特别是葡萄糖，几乎能作为所有微生物的碳源，厌氧发酵的主要产物是乙酸、乳酸及氢等，但是巨球型菌(Megasphaera)、丙酸梭菌(Clostridium propionicum)、戊糖丙酸杆菌(Propionibacterium pentosaceum)及谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)的发酵产物是丙酸和丁二酸。乳酸菌发酵的主要产物是乳酸。同型乳酸发酵菌(Homofermentative bacteria)能将一分子葡萄糖转化为两分子乳酸，而异型乳酸发酵菌(Heterofermentative bacteria)的发酵产物除乳酸外还有乙酸及乙醇等。能利用葡萄糖的微生物一般都能以乳酸作为碳源并将乳酸进一步分解为乙酸等产物；反之则不一定，如有一株巨球型菌就不能代谢乳酸。有些乳酸发酵菌还能利用柠檬酸作为碳源，发酵产物是3-羟基丙酮和丁二酮，如乳脂链球菌(Streptococcus cremoris)，这类细菌在厌氧处理含柠檬酸的废水（如柠檬酸发酵工业和乳制品工业等）时起着重要的作用。 12.2.2.2产氢、产乙酸细菌 乙酸是废水厌氧消化的主要代谢中间产物。乙酸一部分来自于发酵过程，另一部分则来自于产氢、产乙酸细菌对脂肪酸的降解。脂肪酶将脂肪水解后得到的脂肪酸能被产氢、产乙酸细菌利用，其中碳链数是偶数的脂肪酸被降解为乙酸和氢气，而奇数碳链的脂肪酸则被分解为乙酸、丙酸和氢气。这类细菌一般要与利用氢的产甲烷菌或脱硫弧菌共栖生存，在厌氧消化污泥中，只能与氢利用细菌共栖才能生存的细菌浓度高达4.5(106个/ml。 由于产甲烷菌通常只能利用乙酸，只有极少数才能够利用丙酸，而在发酵和奇数碳链脂肪酸的降解过程中都会产生丙酸和丁酸等，这些有机酸如不能被降解，将使厌氧消化液的pH降低，产生酸败。因此在厌氧消化的微生物群中还应该包含能将丙酸和丁酸等降解为乙酸和氢的微生物，人们将它们称为OHPA菌。沃氏互营单胞菌(Syntrophobacter wolinii)就能将丙酸分解为乙酸和氢。 由OHPA菌代谢产生的乙酸和氢约占产甲烷菌底物的一半左右，因此OHPA菌在厌氧消化系统中起着重要的作用。但是OHPA菌对pH非常敏感，必须保证厌氧消化液的pH在中性范围内，否则就会造成酸败；同时它们的倍增周期需要2~6天，生长速率比甲烷菌要慢得多，这样在连续厌氧消化操作中如何保证这类细菌不发生酸败、不流失就成了关键问题。 发酵细菌和OHPA菌的生长和代谢需要消耗大量的ATP。与好氧过程可以通过呼吸链产生大量的ATP不同，厌氧过程只能在生物脱氢过程中获得ATP，产ATP的效率要比好氧呼吸作用低得多。因此消耗大量的ATP就意味着需要降解更多的有机物、发生更多的脱氢反应。脱氢反应的进行则依赖于细菌内的氢受体NAD+，但是NAD+的数量也是有限的，因而又依赖于还原态NADH2的重新氧化。NADH2的氧化有两条途径：一是在氢酶的作用下NADH2直接脱氢形成H2逸出系统，这一途径在厌氧消化系统中并不常见；二是以部分代谢中间产物作为氢受体，在NADH2氧化的同时使中间代谢产物本身转化为还原态发酵产物。由于这些发酵产物基本上都是有机酸，因此又会对pH的控制和微生物生长产生不利影响。解决这些问题的关键是系统中必须存在产甲烷菌，通过产甲烷菌的代谢，就能将从底物上脱除下来的氢用于甲烷的合成而逸出系统，这样就可以保持系统中pH值的稳定。 12.2.2.3产甲烷细菌 产甲烷细菌在厌氧消化系统中虽然处于食物链的末端，但对有机污染物的降解和系统的正常运行起着决定性作用。正是由于产甲烷细菌在厌氧消化系统中的重要地位，对它们的研究也最为深入。 产甲烷细菌的形态和分类 迄今为止，已经分离鉴别的产甲烷细菌有70种左右，有人根据它们的形态和代谢特征划分为3目、7科、19属，见表12.2.1。此外，还有一些不属于这三个目的产甲烷细菌。产甲烷杆菌的细胞呈细长弯曲的杆状、链状或丝状，两端钝圆，细胞尺寸为0.4~0.8(3~15(m；甲烷短杆菌的细胞呈短杆或球杆状，两端锥形，细胞大小为0.7(0.8~1.7(m；甲烷球菌的细胞为不规则球形，直径在1.0~2.0(m之间；甲烷螺菌细胞呈对称弯杆状，常结合在一起成为长度达几十到几百微米的波浪丝状；甲烷八叠球菌的菌体呈球状，而且常常有很多菌体不规则地聚集在一起，形成直径可达几百微米的球体；甲烷丝菌细胞呈杆状，两端扁平，能形成很长的丝状体。 表 12.2.1 产甲烷细菌的分类 甲烷杆菌目 Methanobacteriales 甲烷杆菌科 Methanobacteriaceae 甲烷杆菌属 Methanobacterium    甲烷短杆菌属 Methanobrevibacter    甲烷球状菌属 Methanosohaera   高温甲烷杆菌科 Methanothermaceae 高温甲烷菌属 Methanothermus  甲烷球菌目 Methanococcales 甲烷球菌科 Methanococcaceae 甲烷球菌属 Methanococcus   甲烷微菌目 Methanomicrobiales  甲烷微菌科 Methanomicrobiaceae 甲烷微菌属 Methanomicrobium    甲烷螺菌属 Methanospirillum    产甲烷菌属 Methanogenium    甲烷叶状菌属 Methanolacinia    甲烷袋形菌属 Methanoculleus    甲烷八叠球菌科 Methanosarcinaceae 甲烷八叠球菌属 Methanosarcina    甲烷叶菌属 Methanolobus    甲烷丝菌属 Methanothrix    甲烷拟球菌属 Methanococcoides    甲烷毛状菌属 Methanosaeta    甲烷嗜盐菌属 Methanohalophilus   甲烷片菌科 Methanoplanaeae 甲烷片菌属 Methanoplanus    甲烷盐菌属 Methanohalobium   甲烷微粒菌科 Methanocorpusculaceae 甲烷微粒菌属 Methanocorpusculum   产甲烷菌的生理特征 从产甲烷菌的营养需求看，它们能利用的碳源和能源非常有限。常见的底物有：H2/CO2、甲酸、甲醇、甲胺和乙酸等。它们中的有些种能利用CO作为碳源，但生长很差；有些种则能利用异丙醇和CO2；也有一些种能以甲硫醇或二甲基硫化物为底物合成甲烷。 多数产甲烷菌能利用氢，但也有例外, 例如嗜乙酸型的索氏甲烷丝菌、甲烷八叠球菌TM-1菌株和嗜乙酸甲烷八叠球菌等都不能利用氢。另外专性甲基营养型的蒂氏甲烷叶状菌、嗜甲基甲烷拟球菌和甲烷嗜盐菌等只能利用甲醇、甲胺和二甲基硫化物等含甲基的底物，也不能利用氢。若系统中硫酸盐的浓度过高，即使本来能利用氢的产甲烷菌也会丧失其消耗氢的能力。 产甲烷菌都能利用氨作为氮源，但利用有机氮源的能力很弱。因此即使系统中存在氨基酸和肽等，细菌的生长仍离不开氨。 低浓度的硫酸盐具有刺激某些产甲烷菌生长的作用，但它们不能利用硫酸盐作为硫源，大多数产甲烷菌只能利用硫化物，少数能够利用半胱氨酸和蛋氨酸等含硫氨基酸中的硫作为硫源。 金属离子Ni、Co和Fe对产甲烷菌的生长和代谢具有重要意义。Ni离子是氢酶和辅酶F420的重要成分，Co离子在咕啉合成中是必须的，Fe离子的需求量也很大。 许多产甲烷菌的生长还需要生物素。 甲烷菌中与产甲烷有关的特殊辅酶 甲烷的产生需要一些特殊的辅酶参与酶催化反应，这些辅酶是：辅酶F420、辅酶M、甲烷蝶呤(Methanopterin, MPF)及二氧化碳还原因子（CDR）。 辅酶F420是一种低分子量的荧光物质，当它被氧化时，在紫外线的激发下会产生荧光，在420nm处有最大吸收峰；被还原后就失去了产生荧光的能力。产甲烷菌在420nm紫外线的激发下产生蓝绿色荧光就是因为细胞内含有辅酶F420和甲烷蝶呤及其衍生物的缘故。辅酶F420的功能与铁氧还蛋白类似。 辅酶M是已知所有辅酶中分子量最小、高渗透性和高含硫量的一类辅酶，对酸和热较为稳定。它的辅酶M的作用是参与甲基转移反应，辅酶M的分子结构有以下几种： HS—CH2—CH2—SO3( ( O3S—CH2—CH2—S—S—CH2—SO3( CH3—S—CH2—CH2—SO3( HO CH2—S—CH2—CH2—SO3( 图12.2.2 Jones等人提出的嗜热自养甲烷杆菌中CO2还原为CH4的途经 HCO—MFR脱氢酶；（3）环化水解酶；（4）5, 10—(=CH—) H4MPT 脱氢酶；（5）CH2= H4MPT还原酶；（7）CH3—S—CoM还原酶 甲烷蝶呤的功能与叶酸类似，参与C1化合物的还原反应。这是一种会发出蓝色荧光的化合物，有多种衍生物，如：H4MPT、HCO-H4MPT、5,10-(=CH-)-H4MPT、CH2= H4MPT、 和CH3—H4MPT等。 二氧化碳还原因子CDR又称为甲烷呋喃（Methanofuran, MFR），它参与产甲烷和产乙酸的反应，起着甲基载体的作用。 产甲烷的代谢途径 在产甲烷细菌中已经比较清楚的代谢途径是由H2和CO2合成甲烷的途径、甲醇转化为甲烷的途径和乙酸分解途径。由H2和CO2合成甲烷的途径是由Jones等人根据他们对嗜热自养甲烷杆菌的研究提出来的，如图12.2.2所示。CO2在HCO-MFR脱氢酶催化下获得两个电子首先与MFR反应形成甲酰基甲烷呋喃(HCO-MFR)，随后甲酰基转移到四氢甲烷蝶呤，形成HCO-H4MPT。第三步是水解反应，产物是5,10-(=CH-)-H4MPT，进一步在脱氢酶的催化下生成CH2= H4MPT、在还原酶的作用下得到CH3-H4MPT。在辅酶M的参与下，甲基被转移到辅酶M，形成CH3-S-CoM，最后还原酶将甲基还原得到甲烷，辅酶M也得到再生。总反应式是： 4H2 + HCO3( + H+ CH4 + 3H2O 从甲醇转化为甲烷的总反应是： 4CH3OH 3CH4 + CO2 + 2H2O 在巴氏甲烷八叠球菌中从甲醇转化为CH3-S-CoM的过程如图12.2.3所示。甲烷在MT1酶的催化下形成CH3-[Co]-MT1，再在MT2酶催化下将甲基转移到辅酶M ，与图12.2.2类似，CH3-S-CoM进一步在还原酶的催化下释放出甲烷。当系统中存在氧化剂时，酶联的咕啉中的钴离子被氧化为两价，形成没有活性的[CoII]-MT1，在还原态辅酶F的作用下将其重新还原为 [CoI]-MT1。如果系统中存在CO，也可以直接将[CoII]-MT1还原，CO则被氧化为CO2。甲胺转化为甲烷的过程与甲醇类似。 图12.2.3 巴氏甲烷八叠球菌中甲醇转化为CH3—S—CoM的代谢途径 （I）表示碳循环，甲醇在5-羟苯并咪唑钴胺甲基转移酶（MT1）催化下形成Co-甲基钴胺，然后在HS-CoM甲基转移酶（MT2）的催化下完成甲基 转移；（II）表示MT1酶的失活和活化，存在氧化剂时引起酶联的咕啉向[Co II]转化并导致酶的失活，而在还原剂的存在下又使酶活化；（III）显示存在CO时MT1酶的化学活化。 采用放射性同位素示踪方法的许多研究工作已经证明了乙酸中的甲基可以直接还原为甲烷，反应式为： 14CH3COOH 14CH4 + CO2 这是在甲烷菌中乙酸转化为甲烷的主要途经。在甲烷菌中也存在着乙酸先氧化生成CO2和H2，然后再通过如图11.2.2所示的途经还原成甲醇。两步反应式分别如下： CH3COOH + 2H2O CO2 + H2 CO2 +4 H2 CH4 + 2H2O 在甲烷菌中，由甲酸转化成甲烷的代谢机制至今还无定论，有待于进一步的研究。 厌氧消化系统中微生物群的动态平衡 在厌氧消化系统中存在着复杂的微生物群，每种微生物都具有其特殊的底物要求和代谢途经，承担有机物降解过程中的某一特定步骤。微生物群中，微生物的种类和数量与污染物种类、工艺条件（如温度、pH、无机物组成及污染物添加速率等）的变化有很大的关系。在厌氧消化系统开工阶段，微生物群会随着营养成分的变化而改变其组成。例如在研究猪粪厌氧消化系统开工阶段时，Hobson和Shaw发现，在第一周细菌总数达到5(106~5(107个/ml，其中淀粉分解菌数大于4(104个/ml；第三周开始出现产甲烷细菌，数量有103个/ml；第四至五周内纤维分解菌增加到104~105个/ml，蛋白质分解菌也达到4(104个/ml；第六周的产甲烷细菌数量上升到106个/ml，各类细菌的数量基本上趋向稳定。 通过研究各种细菌在厌氧消化系统中的作用及相互关系，就有可能对操作条件予以优化和控制，使系统中的微生物群能够更好地发挥各自的作用，最大限度地降解有机污染物。例如，提高有机物的容积负荷率将促进水解及发酵细菌的生长，使有机酸的产量增加，有机酸浓度的提高则会刺激产甲烷菌的生长和活性，使系统的沼气产量增加。 我国在厌氧消化系统方面进行了打量的研究，特别是在农村沼气的研究和推广应用中取得了很大的成绩。表12.2.2列出了利用农牧业肥料生产沼气的产气数据。 表12.2.2农村常见原谅的产沼气数据 原料 含水量（%） 发酵时间（天） 产气量（升/公斤干物质） 气体中CH4%  猪粪 95 94 440-500 65  牛粪 75 94 190-210 66  青草 76 92 290-320 68  稻草 17 92 150-200 65  麦秆 82 41 51-60 61   12.3利用微生物降解有毒、难分解的污染物 随着工农业生产发展和人们生活水平提高，排放到环境中的污染物不仅数量大大增加，而且其成分也越来越复杂，其中的某些污染物对微生物有毒、有些则很难降解。因此通常所用的处理以生活污水为主的活性污泥法就很难用于这类污染物的处理，需要采用一些特殊的方法或筛选具有特殊降解功能的微生物才能满足环境保护的要求。 12.3.1降解有害有毒污染物的微生物混合培养 自然界中各种微生物间存在复杂的相互依赖关系，我们就可以利用这些关系用于处理有害有毒污染物。在处理有害有毒污染物的微生物混合培养中，主要是利用互惠共生或共栖现象。另外，许多微生物并不是天生就具有降解有害有毒污染物的能力，而是通过驯化而逐渐“学会”的，即催化有毒化合物的酶系是可以诱导的，各种微生物相互之间的密切关系也是在驯化过程中慢慢形成的。 有些微生物群会形成以特殊营养物为纽带的相互联系。例如，诺卡氏菌能够单独氧化环己烷，但必须有假单孢菌为其提供生长因子，特别是生物素，若环己烷是唯一的碳源，这两种细菌必须混合进行培养；在55~65oC的条件下从土壤中分离得到的嗜热微生物群能在含十六烷的最低培养基中生长，但如挑单菌落进行培养则不能生长，说明这种嗜热微生物需要其伴生菌为其提供生长因子。因此嗜热微生物群也必须共同培养才能降解特定的底物十六烷。 有些微生物群则通过消耗抑制性产物而相互联系。这种关系的一个典型例子是：甲烷菌产生的甲烷对假单胞菌的生长有抑制作用，而生丝微菌属(Hyphomicrobium)则可以利用甲烷，从而消除了对假单胞菌生长的抑制。因此这三类微生物的共存有利于假单胞菌的生长，并进而促进其对有害有毒污染物的降解。 在含地衣二酚的培养基中进行驯化富集时，会形成假单胞菌、亚麻短杆菌(Brevibacterium linens)和角质菌(Curtobacterium)共存的三元群落，但是，只有当假单胞菌存在时，后两类细菌才能在含地衣二酚的培养基中生长，这说明假单胞菌为它们提供了基本的生长条件。 有些有毒化合物的降解不是群落中某种微生物的作用，而是依赖于群落中各微生物的协同作用，直至完全矿化。这说明单独一种微生物并不具备有毒化合物彻底降解的全部酶系，而是借助于各种微生物的接力作用，共同完成降解任务。这样的例子很多，如将能够降解苯乙烯的微生物群落混合培养，能够检测到苯乙醇和苯乙酸等中间产物；又如在一个降解氯代苯甲酸的厌氧微生物群中，第一类微生物将氯代苯甲酸降解为苯甲酸，第二类则进一步将苯甲酸降解为乙酸、CO2和H2，最后由产甲烷螺菌转化为甲烷。 在降解有毒化合物时，如果有毒化合物本身不能作为微生物的碳源及能源，有时还需要加入碳源（如葡萄糖）才能使它们生长，但微生物所产生的酶系却能代谢有毒化合物。 12.4降解有害有毒污染物的特殊微生物 有害有毒污染物的种类很多，能将它们降解的微生物也就千差万别。本节将就几种典型的并具有实际应用价值的微生物及它们降解的污染物作一简单介绍，它们是：代谢含硫化合物的硫细菌、代谢含氯有机化合物的微生物、降解木质素和多环芳烃的微生物。 12.4.1硫细菌 地球上某些元素通过循环而达到动态平衡，典型的有碳、氮和硫的循环，生命活动既是这些元素循环的动力又是受益者。有机物中通常都含有这三种元素，而且硝酸盐和硫酸盐能代替氧作为电子受体，因此三类循环又是密切相关的。在自然界的硫循环如图12.4.1所示。从图中可以看到，微生物在硫循环中起着决定性的作用。这些能够代谢含硫化合物的微生物在环境保护中也起着重要的作用，它们能通过生物氧化作用将有害有毒的含硫化合物转化为元素硫或硫酸盐，这样就可以进行直接利用（如元素硫）或进入自然界的硫循环。人们已经对硫细菌在煤脱硫、湿法冶金、烟道气脱硫及有机硫化物降解中的应用进行了广泛深入的研究，显示了良好的应用前景。 能够代谢含硫化合物的微生物主要有无色硫细菌和光养型硫细菌两大类，下面将分别予以讨论。 12.4.1.1无色硫细菌(Colorless Sulfur Bacteria) 无色硫细菌属于Gram阴性菌，是硫化物氧化菌，因此在自然界中常分布在发生硫酸盐氧化反应及地理上分布有硫化物的区域。大多数无色硫细菌是好氧菌，常生活在好氧—厌氧的界面、有低浓度氧和硫化物共存的条件下，如果界面能受到光照，则可能存在光养性的无色硫细菌。无色硫细菌能够在广泛的温度、pH、好氧或厌氧环境中生长，根据它们对营养要求的不同可以分为专性无机化能自养型、兼性无机化能营养型、无机化能异氧型及脱氮硫细菌等类型。代表性的无色硫细菌见表12.4.1。 有机硫化物 同化硫酸盐还原 矿化过程 异化硫酸盐还原 SO42( O2或N O3( 参与 S2( 的生物氧化 O2或N O3( 参 自发氧化 与的生物氧化 异化硫还原 O2或N O3( 参 与的生物氧化 S 光养型细菌 光养型细菌 的厌氧氧化 的厌氧氧化 图12.4.1自然界中的硫循环 表12.4.1代表性的无色硫细菌 代谢类型 微生物属 代表性种 呼吸类型 特殊营养要求  专性无机化能自养型 硫杆菌属 Thiobacillus T. neapolitanus O2 /    T. ferrooxidans O2 嗜酸性    T. denitrificans O2/NO3( /   硫微螺菌属 Thiomicrospira T. denitrificans O2/NO3( 微需氧  兼性无机化能营养型 硫杆菌属 Thiobacillus T. intermedius O2 /    T. acidophilus O2 嗜酸性    T. versutus O2/NO3( 脱氮异养型   贝氏硫菌属 Beggiatoa Beggiatoa O2 微需氧   硫化球菌属 Sulsphaera S. acidocaldarius O2 嗜酸性、嗜热   硫球菌属 Thiosphaera T. pantotropha O2/NO3( /  无机化能异养型 硫杆菌属 Thiobacillus T. perometabolis O2 /  异养型（能养化硫化物、但不提供能源） 贝氏硫菌属 Beggiatoa Beggiatoa O2/So /   专性无机化能自养型(Obligate Chemolithoautotrophs) 这类硫细菌能自养生长，利用无机硫化物作为能源，通过Calvin循环固定二氧化碳作为碳源生长，在这些微生物中不存在柠檬酸循环。这类细菌的大多数能利用少量的外源性有机碳作为碳源但是不能用作能源。虽然是自养型生长，但它们也显示了一定的灵活性和适应性。如T. neapolitanus的碳和氮代谢会适应环境的变化，通过Calvin循环能对二氧化碳浓度变化进行调节，氮代谢途径中存在酶的诱导和阻遏调节，而且在细胞内能够储存糖原以便在厌氧条件下通过混合乳酸发酵产生能量为细胞生长提供能源。 兼性无机化能营养型 这类细菌既能自养型生长、也能利用各种有机化合物异养型生长，而且事实上许多细菌能同时通过自养和异养两条不同代谢途径利用两类不同的碳源呈混养型生长，在恒化器培养中可以看到具有双底物限制的特点。但在间歇培养时，若存在有机底物，Calvin循环的酶系受到抑制，呈现二次生长现象。 研究得最多的代表菌株是T. versutus。该菌株的特点是具有很强的适应性，能利用多种有机物作为碳源，能够在有机化合物的混合物或有机化合物与还原性硫化物的混合物中生长，而且能根据需要自动调节代谢途径以便最好地利用限制性底物。例如，当它在醋酸或葡萄糖与硫代硫酸盐的混合培养基中生长时，若有机物的供应量高于还原性硫化物，Calvin循环的酶活力降低以减少从二氧化碳固定所获得的碳源，有时Calvin循环的酶活力甚至完全被抑制。T. versutus对环境很强的适应性使其既能在混养型的条件下生长，又能适应环境中营养物质供应的急剧变化。在该菌株的连续培养实验中，每隔4小时交替供应有机底物和硫化物，细菌仍能生长良好，因为它能将酶系及时地进行切换并将酶水平调整到所需的反应速率。 无色硫细菌Beggiatoa属中的一些种也能兼性生长，但它们的培养非常困难，关于它们的代谢机理也知之甚少。 无机化能异养型(Chemolithoheterotrophs) 这类硫细菌能利用还原态的硫化物作为能源，不能固定二氧化碳，因此需要有机物作为碳源。它们的原栖居地一般都存在硫化物作为能源，但是从能学角度分析，利用硫化物所产生的能量还不足以满足通过Calvin循环固定二氧化碳的能量需求。 Beggiatoa属的一些种属于无机化能异养型，它们在好氧生长时需要利用硫化物，但是硫化物是否作为生长的能源至今还有争论。有人认为它们在好养培养时硫化物的作用是还原剂，能与所产生的过氧化氢作用，硫化物本身被氧化；也有人认为在以醋酸盐作为碳源培养时，硫化物只是一种辅助性能源。 脱氮硫细菌(Denitrifying Sulfur Bacteria) 几乎所有的硫细菌在呼吸时都能利用氧作为最终电子受体，但Thiomicrospira denitrificans只能在微氧环境下才能利用氧作为最终电子受体。在厌氧条件下，少数几个种只有在硝酸盐或氧化氮的存在下才能生长，并将硝酸盐或氧化氮作为电子受体。属于这类的微生物有：专性自养型的Thiobacillus denitrificans 和Thiomicrospira denitrificans、兼养型的Thiosphaera pantotropha、Thiobacillus versitus和Paracoccus denitrificans等。 12.4.1.2光养型硫细菌(Phototrophic Sulfur Bacteria) 各种不同类型的光养型硫细菌列于表12.4.2。氰细菌（又名蓝绿藻, Cyanobacteriaceae）与其它类型的光养型细菌不同之处是它们在光合作用中甚至能利用水作为电子供体，最终产物是氧气。紫色和绿色细菌不能进行产氧的光合作用，而需要在厌氧条件下才能光养生长，它们的电子供体的氧化还原势比水还要低，如还原态的硫化物、氢或小的有机分子等。绿色光养型细菌分为两类：Chlorobiaceae和Chloroflexaceae，两者都是硫细菌；紫色菌也分为两类：Chromatiaceae 和Rhodospirillaceae。氰细菌和Rhodospirillaceae利用硫化物或硫代硫酸盐作为电子供体，但不会利用硫，而且在自然界中的数量比Chlorobiaceae 和Chromatiaceae要少得多，对Chloroflexaceae的了解比较少，是一类绿色的、嗜热的滑动菌。 Chlorobiaceae 和Chromatiaceae的差别表现在超微结构、细菌叶绿素和二氧化碳固定方式的不同。Chlorobiaceae还缺少Clavin循环。 表12.4.2 光养型硫细菌 颜色 科 光合色素 代谢特点 电子供体  绿色  Chlorobiaceae 细菌叶绿体a、c、 d或e，chlorobactene 专性光养、兼性光自养、外部So结累、专性厌氧 S2(，S2O32(，So，H2，有机酸    Chloroflexaceae 细菌叶绿体a和c； (-和(-胡罗卜素 兼性光养、兼性光自养、外部So结累、嗜热 S2(，有机酸  紫色  Chromatiaceae 细菌叶绿体a和c 兼性光养、兼性光自养、外部So结累、兼性好氧 S2(，S2O32(，So，H2，有机酸   Rhodospirillaceae 细菌叶绿体a和c 兼性光养、兼性光自养 S2(，S2O32(，有机酸  蓝—绿色  Cyanobacteriaceae 叶绿体a,藻蓝蛋白 或藻红蛋白，别藻蛋白，(-胡罗卜素 光养、兼性光自养 S2(，H2O   专性光养菌 专性光养菌属于绿菌科（Chlorobiaceae），能在硫化物/二氧化碳介质中生长，在缺乏硫化物的介质中生长十分缓慢甚至根本就不生长，颜色呈绿色或棕色。硫化物既作为专性光养菌的硫源又是光合成的电子供体。与红硫菌科（Chromatiaceae）通过Calvin循环固定二氧化碳不同的是专性光养菌通过柠檬酸循环固定二氧化碳。柠檬酸循环是可逆的，因此虽然Chlorobiaceae能同化少数低分子量的有机化合物（如乙酸），但不能提供用于细胞生长的还原功。如介质中没有硫化物, 乙酸是不能被同化的，因为必须有硫化物存在时专性光养菌才能合成还原态铁氧还原蛋白，随后乙酸在还原态铁氧还原蛋白催化下羧基化生成丙酮酸。 专性光养菌通过细菌叶绿体c、d或e吸收光能，为细胞生长提供还原功，细菌叶绿体a则存在于反应中心。有些棕色的细菌含有胡罗卜素，如Chlorobium phaeobacteroides和C. phaeovibroides。与所有光养型细菌一样，Chlorobiaceae通过增加色素含量，可以适应低光强度的环境条件。 Chlorobiaceae是专性光养菌，这意味着该菌在黑暗状态下可以从糖原分解中获得一些ATP用于维持生命，但是不能用于生长。它们又是专性厌氧的，即使在微氧环境中也不能生长。由于对硫化物的亲和性很好，所有的Chlorobiaceae都具有良好的代谢硫化物能力，而且对维持能的要求不高。 氰细菌的特点是能够利用水作为光合成的电子供体并产生氧，从这一点看，氰细菌与高等植物有类似之处，但是，它们的碳和氮代谢与专性光养菌类似。氰细菌的一些菌株也能够利用硫化物作为光合成的电子供体，最终产物是元素硫。 兼性无机光养型细菌 除了Chlorobiaceae和大部分氰细菌外，其它光养型细菌在利用无机或有机电子供体方面都或多或少地有一定的适应性，许多种都可以混合营养型生长，其中部分菌只有在生长限制的条件下（连续培养）能够混合营养型生长，另一些在间歇培养时就能够混养型生长。例如Chromatiaceae通常在硫化物和二氧化碳存在时就能够生长，但也能在含硫化物和乙酸或其它低分子量有机碳源的混合培养基中生长。极大多数菌株只要有乙酸就能生长，只有少数几种一定要有硫化物存在，因为它们缺乏腺苷磷酰硫酸酯（APS），因此不能从同化硫酸盐还原的途径获得细胞生长所需要的硫。Chromatiaceae能利用的有机物很有限，它们不能利用氨基酸作为碳源生长。无论是利用硫化物还是有机物生长，它们氧化硫化物的速度都很快，而且兼性无机光养型硫细菌中硫化物的氧化与二氧化碳的固定之间存在着确定的计量关系。 红螺菌科（Rhodospirillaceae）基本上属于有机光养型，但也能利用硫化物作为电子供体，因此也可以归入兼性无机光养型细菌。它们利用有机物的范围比较广，而且需要有比较稳定的有机底物供应，对环境变化的适应性就要差一些。 兼性光养型 某些光养型细菌能够通过有机物的发酵、呼吸作用或光吸收产生ATP，但利用有机物往往是为了生存而不是用于细胞生长，因此在这些条件下生长速度很低甚至不生长。生理上最为多样性的光养型细菌是Rhodospirillaceae，能以硫化物作为电子供体、利用厌氧光合成获得能量，大多数菌株都能在微氧或好氧的环境中生长，因此它们对供氧条件变化的适应能力特别强。  图12.4.2 木质素的结构示意图 12.4.2降解木质素及多环芳烃的微生物 木质素是地球上仅次于纤维素的第二大可再生的有机物质，主要存在于高等植物中。在植物体内，它与纤维素紧密结合在一起构成植物的细胞壁。木质素是主要由芥子醇、松柏醇和香豆酮三种基本结构单元构成的、具有三维结构的芳香族高聚物，由各种C-C键和苯氧基键联结在一起，见图12.4.2。由于木质素的这种特殊结构，微生物几乎不能通过水解方式进行分解。 木质素是造纸工业废水的主要成分，是我国重要污染源之一。多环芳烃的结构与木质素有一定的类似性，它们是印染工业、煤焦油加工工业、制药和农药等工业废水的主要成分，也是我国的主要污染源。多环芳烃一般都有毒，有些还会致癌, 它们会抑制大多数微生物的生长，因此很难被生物降解。 表12.4.3一些白腐真菌产各种氧化酶的能力及其生长的宿主木材 微生物 Lip Mup La Pho Aao 来源  Coliolus versicolor + + +   落叶树木  Pharerochacte chrysosporium + + 少   来源不清楚  Phlabia radiata + + +   落叶树木，针叶树木  Phlabia brevispora + + +   来源不清楚  Pleurotus ostreatus + + +  + 落叶树木  Pleurotus sajor caju + + +  + 来源不清楚  Ceriporiopsis subvermispora  + +   落叶树木  Dichomitussqualeus  + +   桦木、杨木、云杉等  Lentinula edodus  + +   落叶树木  Panus tigrinus  + + +  落叶树木  Rigidoporus lignosus  + +   橡胶树  Coriolus pruinosum + +    落叶树木  Ganoderma applanatum +   +  来源不清楚  Oudemansiella radicata +  +   山毛榉  Phlebia ochraceofulva +  +   来源不清楚  Phlebia tremellosus +  +   落叶树木、针叶树  Pleurotus florida +  +   来源不清楚  Polyporus platensis +  +   来源不清楚  Polyporus brumalis +  +   落叶树木  Polyporus pinsitus +  +   来源不清楚  Ustulina deusta +  +   落叶树木(山毛榉)  Xylaria polymorpha +  +   落叶树木(山毛榉)  Bjerkandera adusta +    + 落叶树木  Daedaleopsis confragosa +     落叶树木(樱桃树)  Phallus impudicus +     落叶树木、针叶树  Polyporus varitus +     山毛榉、赤杨  Phellimus noxius   +   橡胶树  Pleurotus eryngii     + 来源不清楚  Polystietus versicolor     + 来源不清楚  Phellinus weirii    +  针叶树   自七十年代以来，筛选降解木质素微生物的工作取得了长足的进展，人们从腐烂的木材中分离得到了能降解木质素的微生物，主要是那些称为白腐菌(White-rot fungi)的真菌，它们因为能够引起木材的白色腐烂而得名。同时也从它们的培养液中分离鉴别出了对木质素降解真正起作用的酶，包括：木素过氧化物酶(Lignin peroxidase, Lip)、锰过氧化物酶(Manganese peroxidase, Mnp)、漆酶(Laccase, La)、苯酚氧化酶(Phenol oxidase, Pho)及芳香醇氧化酶(Aryl alcohol oxidase, Aao)等。一些典型的白腐菌、它们来源及所产的酶系列于表12.4.3。其中研究得最多、也是最重要的是黄孢原毛平革菌(Pharerochacte chrysosporium)及其所产生的木素过氧化物酶和锰过氧化物酶。近年来随着生物制浆和纸浆生物漂白的需要，对漆酶及其生产菌的研究也在显著增加，如对采绒革盖菌(Coliolus versicolor)生产漆酶的研究受到了广泛的重视。本节将围绕这两种微生物及其在环境工程中的应用进行讨论。 12.4.2.1黄孢原毛平革菌 黄孢原毛平革菌属于担子菌纲(Basidiomycetes)、同担子菌亚纲(Homobasidiomycetidae)、非褶菌目(Aphyllophorales)、丝核菌科(Corticiaceae)。它的无性阶段产无色粉状分生孢子，菌丝体成平伏状。黄孢原毛平革菌广泛分布于北美各地，在我国尚未发现。 黄孢原毛平革菌能够产生一系列的胞外过氧化物酶和氧化酶，包括木素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶、乙二醛酶等，也能产生纤维素酶和半纤维素酶。在木质素降解中起主要作用的是过氧化物酶和乙二醛酶，过氧化物酶的催化作用依赖于H2O2的存在，但是过量的H2O2反而会引起过氧化物酶的失活，而乙二醛酶则起到了提供适量H2O2的作用。过氧化物酶都含有血红素，事实上是一组同工酶，有人曾用HPLC或凝胶电泳分别分离得到了10种或12种同工酶。 1983年，Tien和Glenn两个研究小组几乎同时从黄孢原毛平革菌的培养液中发现了木素过氧化物酶，但是酶的活力很低，而且只能在静止培养时产酶。八十年代中期，产酶研究出现了两个方面的突破，一是发现添加低浓度吐温能使黄孢原毛平革菌在液体深层培养时产酶；二是发现该菌的中间代谢产物藜芦醇对产酶具有诱导作用，从而大大提高了酶产量。黄孢原毛平革菌需要在限氮、或限碳、或限硫的培养基中进行培养，而且需要经常通纯氧才能产木素过氧化物酶。昂贵的藜芦醇、通纯氧及较低的酶活限制了木素过氧化物酶的应用。最近的研究进展表明，采用苯甲醇代替藜芦醇，即使在通空气培养时也能达到生产木素过氧化物酶的目标， 而且酶活能够达到400U/L以上。通过黄孢原毛平革菌的固定化，还能做到菌体的重复使用或连续产酶。对锰过氧化物酶的研究还比较少。 木素过氧化物酶降解木质素及多环芳烃的机理如图12.4.2所示。在酶催化反应过程中，该酶形成了两个中间体Lip1和Lip2。Lip1是Lip被H2O2氧化后失去两个电子而形成的过渡态形式；接着Lip1与一个底物分子反应得到一个电子生成另一种过渡态Lip2和一个自由基产物；最后Lip2又与第二个底物分子反应，Lip2得到第二个电子，使底物分子形成另一个自由基产物，酶本身则回复到原酶形态Lip。每一循环中生成的两个芳香正离子自由基具有很强的活性，经过一系列反应后，会发生侧链C—C键断裂、甲氧基水合或脱甲基等反应，从而被降解。  图12.4.2木素过氧化物酶降解木质素 图12.4.3锰过氧化物酶降解木质素 或多环芳烃的机理 或多环芳烃的机理 锰过氧化物酶只有在Mn+2存在时才具有催化活性，首先H2O2将Mn+2氧化为Mn+3，含Mn+3的酶是一个非特异性氧化剂，能将有机物氧化，本身则还原为含Mn+2的原酶。锰过氧化物酶的催化机理如图12.4.3所示，与木素过氧化物酶类似，也生成两个酶中间体Mnp1和Mnp2，酶的每一个循环中将两个底物分子氧化。 12.4.2.2彩绒革盖菌(Coliolus versicolor) 彩绒革盖菌又称为杂色云芝，是一种具有药用价值的担子菌，属于无隔担子菌亚纲(Homobasidiomycetes)。它所产生的木质素降解酶主要是漆酶(Laccase)，又称为酚酶(Phenolase)或多酚氧化酶(Polyphenoloxidase)。这是一种含铜的氧化酶，也是一种非特异性氧化酶，能够氧化多酚、甲氧基酚、二胺等多种有机化合物。到目前为止，还没有全部掌握它能作用的所有底物。漆酶氧化底物的机理是一种产生自由基的单电子反应，开始时形成的中间化合物不稳定，再经历第二次酶催化氧化或非酶催化反应，如水合反应、歧化反应、聚合反应等，最终得到氧化产物。与木素过氧化物酶和锰过氧化物酶需要过氧化氢不同，漆酶催化的反应只需要氧气作为电子受体，氧气本身被还原成水。图12.4.4显示了两种典型的漆酶催化反应。 对于漆酶在白腐菌降解木质素中的作用问题上有两种不同的看法，一些研究者认为漆酶的作用很关键，它能参与许多溶木素必需的反应，能够降解酚型木质素底物，在特殊条件下也能氧化非酚型木质素底物，而且只要存在酚类物质或某些木素类底物，就能够将Mn2+氧化为Mn3+螯合物，这些螯合物在木质素降解中起着重要的作用；另一些研究者的实验却表明漆酶和锰过氧化物酶单独作用时都不能降解木质素，混合在一起却能有效地起协同作用。也有一些研究者认为漆酶在降解木质素时几乎不起作用，当微生物产漆酶的能力受到抑制时，对其降解木质素的能力没有影响。事实上，木质纤维素是由纤维素、半纤维素和木质素组成的结构复杂的材料，各种木质纤维素的组成和结构存在着很大的差别，木质素的降解又是一个复杂的多酶体系共同作用的结果，不同的人得到不同的实验结果是完全可以理解的。但是，无论如何，许多降解木质素的微生物都能产生漆酶这一现象说明，漆酶肯定以某种形式参与了降解过程。 图12.4.4 两种典型的漆酶催化反应 12.4.3.3白腐菌在造纸工业中的应用 造纸工业是造成环境污染的重要污染源。造纸厂的污水主要来自造纸原料的脱木素和纸浆的漂白。人们之所以对白腐真菌感兴趣就是因为它们有可能改变传统化学制浆和化学漂白废水处理的现状，发展生物制浆和漂白废水生物处理的新工艺，达到降低污染、提高资源利用率和纸制品质量的目的。 白腐菌用于生物制浆可以采用两种方法：直接用菌丝体或经提取后的酶降解木质素。在直接用白腐菌处理硬木牛皮纸浆时取得了较好的效果，五天后纸浆的Kappa指数（注：Kappa指数是造纸工业常用的木质素含量指标）从11.6降到了7.9；在处理软木牛皮纸浆时直接效果并不明显，但是进一步用碱抽提后，Kappa指数降到了8.5，而不经白腐菌处理、直接用碱抽提时Kappa指数只能降到24，表明白腐菌在处理软木牛皮纸浆时也起着重要作用。直接用白腐菌制纸浆的另一个优点是不需要加过氧化氢，因为菌丝中的乙二醛酶能为木素过氧化物酶提供必须的过氧化氢。但是由于白腐菌也产生纤维素酶，直接应用菌丝也造成了一部分纤维素的降解，从而降低纸浆的收率。采用经过提纯的酶则可以避免纤维素损失。由于过氧化物酶需要过氧化氢参与才具有降解木质素的功能，因此一般不用提取的过氧化物酶，而是应用漆酶。单独用漆酶处理硬木牛皮纸浆时效果也不理想，要与ABTS(2, 2’-azinobis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)共同处理，五天后纸浆的Kappa指数可以从12.1降低到9.2。目前生物制浆正处于工业化试验阶段，如果与机械磨浆结合，能够达到较好的效果。 白腐菌用于纸浆漂白废水处理已经取得了很大进展，一般都直接利用白腐菌菌丝进行处理，还有人应用固定化菌丝。经过3~4天的处理后，废水的脱色率可以达到90%，COD和BOD降低60%以上，氯代有机物可减少45%，50%以上的芳香族化合物被降解，利用固定化菌丝的反应器可以连续操作30天以上。 12.4.2.4白腐菌在多环芳烃降解和染料降解中的应用 白腐菌所产生的能够降解木质素的酶系有一个显著特点，这就是它们对底物的非特异性。它们能够将结构和性质存在很大差异的化合物降解，如：多环芳烃（如苯并芘、蒽等）、含氯芳香化合物（如五氯苯酚、4-氯苯胺、2,4,5-三氯苯氧乙酸及二噁烷等）、杀虫剂（如DDT、六六六及氯丹等）、染料（如结晶紫、酸性黄9、天青B及雷玛唑亮兰等）、炸药（如TNT、RDX及HMX等）和其它化合物如氰化物、叠氮化合物、甚至四氯化碳等。上述类型的有机化合物在一般的废水生化处理过程中是很难被降解的，浓度较高时还会引起活性污泥中微生物群的死亡。正是由于白腐菌非特异性的广谱降解性能，近年来对白腐菌在环境工程中的应用引起了广泛的兴趣，对降解机理和动力学的研究正在逐渐深入。一般认为只要有机污染物中至少有一个广域(分子轨道系统，就能产生一个正电子自由基，这种(分子轨道系统允许正离子/自由基离域，从而降低了自由能，维持了中间体的稳定。这类化合物都能够被白腐菌所产的酶系降解。根据这一原理，白腐菌不能降解脂肪族醚类化合物，如甲基叔丁基醚等。 白腐菌降解这些有机化合物时既可以直接用菌丝进行，也可以应用提取的酶。同样，如果应用提取的过氧化物酶，系统中必须保持一定浓度的过氧化氢，而漆酶则不需要。 例12.4.1用C. versicolor处理印染废水 在一个鼓泡反应器中处理印染废水，C. versicolor将形成直径约3mm的菌丝球而自固定化，然后用于染料的脱色。当采用重复间歇操作时对染料酸性橙的脱色能力见表12.4.4；连续操作时稀释率对酸性橙脱色率的影响见表12.4.5；当直接用于某丝绸印染厂含卡布龙红及弱酸大红的真实废水时，保持稀释率为0.014hr-1时，废水的脱色率达到93.5%，漆酶活力则保持在1~2.5U/mL的范围内。 表12.4.4 用C. versicolor重复间歇培养处理含酸性橙溶液的脱色率和漆酶活力 批次 1 2 3 4 5 6 7 9 10  吸光值 480nm 开始 10.20  9.74 11.74 11.88  9.58  9.32  9.12 13.82 14.10   结束  0.21  0.18  0.19  0.21  0.20  0.22  0.20  0.29  0.28  脱色率，% 97.9 98.2 98.4 09.2 97.9 97.6 97.8 97.9 98.0  漆酶活力，U/mL  2.83  2.92  2.38  2.85  6.95  2.75  4.90  3.24  2.78   表12.4.5用C. versicolor连续培养处理含酸性橙溶液的稀释率 和脱色率的关系 稀释率，hr-1 0.0056 0.014 0.026  脱色率，% 97.0 70.0 53.0   从以上实验结果可以看出C. versicolor具有良好的染料脱色效果、稳定的产漆酶能力，在印染废水处理中有广泛的应用前景。 表12.4.6降解含氯有机化合物的微生物及其酶系 含氯有机化合物 微生物 酶系  2,2’二氯丙酸 恶臭假单胞菌, 根瘤菌属快速生长菌 脱卤酶  2-氯乙醇 假单胞菌 脱卤酶  二氯甲烷 好氧菌DM1, 生丝微菌属, 兼性甲基营养菌 脱卤酶为谷胱甘肽诱导酶  二氯乙烷 活性污泥体系   四氯化碳 活性污泥体系, 恶臭假单胞菌   氯乙烯 分枝杆菌属 烯烃单氧化酶  反-1,2-二氯乙烯 甲基单胞甲烷菌, 甲基球菌 甲烷诱导酶  三氯乙烯 硝化假单胞菌属的氨氧化菌 微生物混合培养 混合培养甲烷氧化菌体系 洋葱假单胞菌 不动杆菌属的好氧菌G4 苯诱导假单胞菌 甲烷营养菌 分枝杆菌属丙烷氧化菌 氨氧化酶 甲烷氧化酶 还原脱氯作用 还原脱氯作用 苯酚或甲苯诱导酶 甲苯双氧化酶 溶解型甲烷单氧化酶 特异性丙烷氧化酶  四氯乙烯 属厌氧菌的芽孢杆菌和脱硫肠状菌, 甲烷营养菌   氯代苯类 芽孢杆菌, 短杆菌, 棒杆菌, 诺卡氏菌, 毛单胞菌, 产碱菌, 厚单胞菌等   氯酚类 假单胞菌, 气单胞菌, 黄杆菌,白腐菌   氯苯酸类 恶臭假单胞菌,不可闻不动杆菌    12.4.3降解含氯有机化合物的微生物 微生物降解有机化合物时，由于有机化合物的结构和元素组成有很大的不同，它们被降解的难易程度也就存在着很大的差异。有机物的不同化学基团在微生物表面不同的部位进行吸附和反应，而且反应往往从有机物分子所含的基团开始。如果以有机物所含的官能团降解的难易程度进行排序，则有：羧基>醛基>酮基>羟基>胺基>卤代基。由此可见含卤素基团的有机化合物是最难被微生物降解的。含卤素的有机化合物因其用途广泛而成为主要的环境污染物之一，而且极大部分有毒，会引起人类的多种疾病，有些甚至引起癌症。因此研究降解含氯有机化合物的微生物是一项很有意义的工作。 与其它有机化合物相比，含氯有机化合物不易被微生物降解的主要原因是因为氯并不是微生物的必需元素。微生物的主要结构物质，如蛋白质、核酸、多糖及脂类物质中都不需要氯元素，即使细胞需要氯离子，也能够从环境（如水、土壤等）中大量获得，因此细胞中几乎不具备将含氯有机化合物转化为不含氯中间产物的酶系。 最初对含氯有机化合物的降解研究试图采用常规的混合微生物体系，如活性污泥，但往往不能获得满意的效果。后来，人们通过在含有含氯有机化合物的培养基中的富集培养和“驯化”，诱导出降解含氯有机化合物的酶系，获得了可以降解含氯有机化合物的菌株。可以降解含氯有机化合物的主要微生物属于假单胞菌属、分枝杆菌属、甲基单胞菌属、不动杆菌属、亚硝化单胞菌属及生丝微菌属等。上一节介绍的白腐菌也具有降解含氯有机化合物的能力，因此能用于含氯的纸浆漂白废水处理。能降解特定含氯有机化合物的菌株列于表12.4.6。从表中可以看到，通过富集、诱导和“驯化”等方法，可以使许多微生物具有降解含氯有机化合物的能力，但是降解的机理和参与降解的酶系却有很大的差别，有些能产生脱氯酶，有些是通过还原脱氯作用，更多的是各种氧化酶在起作用。 12.4.3.1氯代烃的降解机理 Vogel将氯代脂肪烃的降解区分为两种机理：1）需要外部电子转移体的氧化还原反应；2）不需要外部电子转移体的取代和脱氯作用。第一种机理在好氧环境下进行，一般先将氯代烃氧化为醇，再进一步氧化为酸或醛，然后自发分解为二氧化碳和水。三氯乙烯通过甲烷营养菌46—1菌株在甲烷单氧化酶作用下降解过程的第一步是形成三氯乙烯环氧化合物，然后在水溶液中自发水解为醇，再进一步氧化为二氯乙酸、乙醛酸及甲酸。第二种机理发生在厌氧环境中，如图12.4.5(a)所示的四氯乙烯在芽孢杆菌作用下逐个进行还原脱氯反应形成乙烯，然后进一步转化为甲烷。在氯代脂肪族化合物中，生物降解的难易次序为：氯代脂肪酸>氯代脂肪醇>氯代烷烃或氯代烯烃；同系物中含氯原子越多，越难降解；分子量大的含氯有机化合物比分子量小的难降解；多氯代物，如四氯乙烯和氯仿，只能在厌氧环境中才能被降解。 (a) (b) 图12.4.5 (a) 芽孢杆菌再厌氧条件下四氯乙烯被逐次还原脱氯，最终生成甲烷; (b)氯苯经氧化开环后再发生脱氯反应. 氯代芳烃的降解是从苯环先氧化为酚开始的，然后进一步开环并氧化为酸。以后的降解步骤就与脂肪族化合物类似了(图12.4.5b)。 12.4.3.2微生物共代谢在含氯有机物降解中的作用 微生物的共代谢是指：只有当初级能源物质存在时微生物才能进行有机化合物的生物降解过程。共代谢不但存在于微生物在正常生长代谢过程中对非生长底物的共同氧化，而且也适用于休止细胞(Resting cell)对不利用底物的共同氧化。 许多研究结果表明，微生物只有当初级能源物质存在时才能通过其诱导酶系完成氧化脱氯。例如：以甲烷和甲醇作为初级能源物质，甲烷营养菌就能够共代谢三氯乙烯，并检测到了乙醛酸和三氯乙酸等中间代谢产物；某些能分解代谢苯酚或甲苯的微生物也具有共代谢三氯乙烯及二氯乙烯的能力；一种生长在柠檬酸介质中的细菌能降解多氯乙烯等。究其原因，是因为微生物本身不能直接利用含氯有机化合物，因此必须有其它能被微生物代谢的碳源和能源物质时才能生长，并通过它们在氧化过程所产生的能量使含氯有机化合物氧化降解。 在厌氧环境中，还原脱氢是含氯有机物降解的第一步，因此也必须有其它能够被厌氧微生物利用的底物存在时，通过底物的代谢产生还原功使含氯有机物还原脱氯，因此产甲烷条件有利于氯乙烯和氯乙烷的生物转化。许多在好氧条件下难降解的氯代芳烃，如六氯苯及多氯联苯等也可以通过厌氧微生物的共代谢还原脱氯，形成毒性较小、更容易降解的部分脱氯中间产物，而且发现苯环上氯代程度越高，还原脱氯的速度反而越快。 12. 5生物修复(Bioremediation) 生物修复是近年来出现的一个新名词。它是指用生物的方法修复被人类长期的生产和生活活动所污染和破坏的局部环境，使之重现生机的过程。这类局部被破坏的环境很多，如：废弃的工厂和军事基地、地下水、加油站附近的土壤、原油泄漏造成的海洋及海滨污染等。这些受到严重污染的地区往往已经不适合于普通生物的生存，因此需要采用特殊的生物和特殊的方法予以处理。常用的生物修复方法有植物生物修复与微生物生物修复两类。 对于受污染的土壤，如果能找到在这种环境中生存的植物，植物根系就能够将污染物逐步分解或积累在植物组织中。这一方法对于受原油及其制品污染的土壤特别有用，已经发现了一些耐油的植物品种，它们的根系能够将污染物分解、转化。有些植物还能在受到重金属严重污染的土壤上生长，并将重金属离子逐步富集到植物的躯干和枝叶。我国对大量的盐碱地采用种植耐盐碱植物，逐步改造成良田，是利用植物进行生物修复的成功例子。 微生物生物修复是研究得最多的方法。由于微生物种类繁多，适应环境的能力强，而且能够诱导产生代谢特殊污染物的酶系，因此总是能够找到合适的微生物并利用它们对被污染的局部环境进行修复。理想的生物修复应该使环境中的有毒有机化合物在微生物的作用下彻底矿化为二氧化碳和水。好氧及厌氧微生物都能用于生物修复，但由于环境是一个开放体系，很难做到厌氧，一般更倾向于应用好氧微生物。 微生物生物修复既可以就地进行，也能够将被污染对象输送到合适的地点进行处理后再返回原地。显然后一种方法只适用于污染范围比较小及污染对象是流体的情况。对于受到污染的土壤，要区别不同情况采取不同的措施。如果土壤的表层受到了污染，可以在土壤的表面喷洒已经培养好的能降解特定污染物的微生物、营养物和水，并加强通风。理想的情况是微生物能够增殖，这样就能够增强生物修复的能力并加快进度。若深层土壤也受到了污染，则要充分利用土壤及地下水中的微生物，添加这些微生物需要的营养物质，增强通风，以强化生物降解过程。也可以采用加水浸泡，将污染物转移到水相，收集含污染物的污水进行处理。地下水的更新周期长达上百年，而且基本不含微生物，一旦地下水受到污染，要清除污染物将是一项十分困难的任务。通常需要将地下水抽到地面进行处理后再回注到地下，一些地区受三氯乙烯污染的地下水就是应用这种方法得当修复的。 应用基因工程的方法获得具有特殊降解能力的微生物并用于生物修复的研究已经受到了广泛的关注，但是从使用基因工程细胞安全性的角度考虑，它们只适用于在密闭系统中应用，目前还不宜用于大规模的现场就地生物修复。 从上面的简单讨论中可以看到，生物修复是一项十分复杂而且昂贵的任务，需要投入很大研究力量和巨额处理经费。另外，在某些情况下，生物修复还需要与其它物理或化学方法结合才能获得满意的效果。