3.5消毒和灭菌 发酵是利用特定的一种或几种微生物的代谢活动，大量生产菌体或特定的代谢产物。在此过程中，需要保证没有其它杂菌的侵染，否则，将可能产生以下一些不利的后果： （1）杂菌消耗培养基成分，造成生产水平下降； （2）杂菌菌体大量繁殖及其代谢产生某些化合物会造成目标产物提取的难度增大，如果污染杂菌有可能影响发酵液的过滤（滤速降低，滤渣含水量增高），也会使溶媒提取时易发生乳化现象； （3）杂菌产生某些对生产菌有毒害或者能分解预期产物的物质。这在抗生素发酵 中很常见，如某些杂菌会产β内酰胺酶，从而分解含β内酰胺结构的抗生素； （4）若是噬菌体污染，则会造成发酵菌体细胞的溶解； （5）若杂菌的生长速度超过生产菌，就会取而代之。 正是由于上述原因，消毒和灭菌工作在发酵产业中起到决定性的作用。虽然，生产上也有轻度染菌对生产和产品质量影响不大的情况，但这是有条件的极少数例外。 灭菌（Sterilization）的英文字意为使之失去生殖能力，即杀死一切微生物（繁殖体孢子）的措施，包括杂菌和生产菌、病原和非病原菌在内。实践中灭菌可分杀菌和溶菌。前者使菌体死亡，但形体尚存，后者使细胞溶化，消失。消毒（Disinfection）字意为去除感染，消去毒害。即杀死引起感染的微生物。通常是杀死病原微生物。工业上指消除杂菌，除去引起感染的微生物。 消毒和灭菌都可以采用类似的各种物理和化学方法，但它们也存在一定的差异。消毒偏向于利用一些化学因素，较为温和；而灭菌偏向于利用一些物理因素，较为剧烈。消毒的结果不一定灭菌，灭菌的结果应该无菌。 除杀死微生物以外，我们常采取一些抑制微生物生长的手段，即抑菌。它包括防腐和化疗。 总之，灭菌、消毒和抑菌都是常用的控制有害微生物的措施。 杀菌 彻底杀灭---灭菌 杀灭 溶菌 部分杀灭---消毒 控制有害菌措施 抑制霉腐微生物---防腐 抑制 抑制宿主体内病原菌---化疗 3.5.1常见的灭菌和消毒的物理方法 最常用的物理方法是高温灭菌（消毒）法。因为微生物的生物功能完全依赖于蛋白质、核酸等生物大分子，而高温可引起这些活性大分子氧化或变性失活，从而导致微生物死亡。 当环境温度超过微生物的最高生长温度，将会引起微生物死亡。不同微生物的最高生长温度不同，不同生长阶段的微生物抗热性也不一样，因而可以根据不同对象，通过控制热处理的温度和时间达到灭菌或消毒的目的。常见的高温灭菌（消毒）方法主要有干热和湿热两大类： 火焰灼烧法 干热灭菌法 烘箱热空气灭菌法 高温灭菌（消毒）法 巴氏消毒法 湿热灭菌（消毒）法 常压下 煮沸消毒法 间歇灭菌法 常规加压灭菌法 加压下 连续加压灭菌法 对于不能进行高温处理的物品可以采取过滤除菌、紫外线、(射线照射等物理方法，或采取化学控菌的方法。 3.5.1.1干热灭菌法（dry heat sterilization） 干热灭菌时，微生物主要由于氧化作用而死亡。干热灭菌的Q10值（即温度升高10℃时的生长速度常数与原来温度时的生长速度常数的比值）通常约为2~3。 1) 灼烧法(incineration) 这是最简单、最彻底的干热灭菌方法，它将被灭菌物品放在火焰中灼烧，使所有的生物质碳化。但是，该法对被灭菌物品的破坏极大，适用的范围较小。常用于实验室接种针、勺、试管或三角瓶口和棉塞的灭菌，也用于工业发酵罐接种时的火环保护。 2) 烘箱热空气法(hat-air oven) 将物品放入烘箱内，然后升温至150~170℃，维持1~2小时。一般的营养体在100℃，维持1小时即会死亡，芽孢在160℃，维持2小时才会全部死亡。所以，经过烘箱热空气法可以达到彻底灭菌的目的。该法适用于玻璃、陶瓷和金属物品的灭菌。其优点是灭菌后物品干燥，缺点是操作所需时间长，易损坏物品，对液体的样品不适用。 3.5.1.2 湿热灭菌法（Moist heat sterilization ) 湿热灭菌时，微生物死亡与细胞蛋白质等大分子变性有关，其Q10值比干热灭菌的高，对芽孢（在100~135℃）约为8~10，对营养细胞则更高，因此，湿热灭菌比干热灭菌更有效。 湿热法就是利用水蒸汽的热量将物品灭菌。同样温度下，湿热灭菌的效果与干热发的比较见表3.5.1。水蒸汽具有穿透能力强，易于传导热量的优点, 干热和湿热空气穿透力的比较见表3.5.2。实验表明蛋白质的含水量与其凝固温度成反比，见表3.5.3，因此湿热更易将蛋白质的氢键打断，使其发生变性凝固。另外，由于蒸汽在被灭菌的物品表面凝结，释放出潜热，这种潜热能迅速提高灭菌物品的温度，缩短灭菌所需的时间。总之，湿热灭菌具有经济和快速等特点，广泛用于培养基和发酵设备等的灭菌。 湿热条件下，多数细菌和真菌的营养体在60℃左右，5~10分钟即死亡；酵母菌和真菌的孢子稍耐热，80℃以上才会死亡；而细菌的芽孢一般在120℃，维持15分钟才能杀死。（嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢在121℃，需要12分钟才能杀死。） 表3.5.1 干热与湿热空气对不同细菌的致死时间比较 加热方式 细菌种类 干热90℃ 90℃，相对湿度分别为    20% 80%  白喉棒杆菌 痢疾杆菌 伤寒杆菌 葡萄球菌 24小时 3小时 3小时 8小时 2小时 2小时 2小时 3小时 2分钟 2分钟 2分钟 2分钟   表3.5.2 干热和湿热空气穿透力的比较 加热方式 温度（℃） 加热时间（小时） 透过布的层数及其温度（℃）     20层 40层 100层  干热 湿热 130~140 105 4 4 86 101 72 101 70以下 101   表3.5.3 蛋白质含水量与其凝固温度的关系 蛋白质含水量（%） 蛋白质凝固温度（℃） 灭菌时间（分）  50 25 18 6 0 56 74~80 80~90 145 160~170 30 30 30 30 30   常用湿热法有以下几种。 1) 巴斯德消毒法（Pasteurization） 巴斯德消毒法是十九世纪六十年代，由巴斯德发展起来的。该法主要针对牛奶、啤酒、果酒和酱油等不易长时间高温灭菌的液体食品，其目的是杀死无芽孢的病原菌（如牛奶中的结核杆菌和沙门氏杆菌），但又能保持食品的风味。 巴斯德消毒法的一般操作是将待消毒的液体食品置于60 ~85℃下处理15秒~30分钟，然后迅速冷却。多年来，具体的处理温度和时间都有所变动。较为传统的操作是低温维持法（low temperature holding method, LTH)或称低温长时法（low temperature long time, LTLT），即将液体食品（如牛奶）置于62.9℃(145℉)下处理30 分钟。对于较稠的食品（如冰淇淋，奶油）常采用69.5℃(155℉)； 另一类是高温瞬间法（high temperature short time, HTST），将液体食品置71.6℃(161℉)下处理15~17秒种。近年来，由于设备的改良，尤其是采用流动连续操作系统（见图3.5.1）后，巴斯德消毒法逐渐演化成一种采用更高温度、更短时间的灭菌方法，即超高温巴斯德灭菌法（ultrapasteurization），让液体食品停留在140℃左右（如137℃或143℃）的温度下保持3~4秒钟，急剧冷却至75℃，然后经均质化后冷却至20℃。该法能够达到灭菌之目的，而且处理后的牛奶等饮料可存放长达6个月。  图3.5.1 高温瞬间巴斯德消毒法的操作流程图 2) 煮沸消毒法 人们常将饮用水加热至100℃，煮沸数分钟，以达到消毒的目的。在条件有限的情况下，可采用该法消毒物品。 3) 间歇灭菌法，或称丁达尔灭菌法（Tyndallization） 间歇灭菌法是在80 ~100℃蒸煮15~60分钟，再搁置室温（28~37℃）下过夜，并重复以上过程三遍以上。其中蒸煮过程可以杀死微生物的营养体，但不能杀死芽孢，室温过夜促使芽孢萌发形成营养体，再经蒸煮过程可杀死新的营养体。循环三次以上可以保证彻底杀死包括芽孢在内的微生物。这种方法可以在较低的温度下，达到彻底灭菌的目的，对设备的要求较低，适用于不耐高温的物品灭菌。但其缺点是费时。 4) 常规加压灭菌法 蒸汽加压灭菌是目前应用最广、最有效的灭菌手段。蒸汽（湿热）灭菌过程是个一级反应，可用下式表示： -dN/dt = kN 式中N是现存的活菌数；t是灭菌处理的时间；k是反应速率常数或比死亡速率。对于一级反应，其反应速度，即k值随温度升高而增大。上式积分可得如下表达式： Nt/N0 = e-kt 式中N0是灭菌处理开始时存在的活菌数目；Nt是经过t时间后存在的活菌数目。Arrhenius曾提出温度与反应速度常数之间的关系式： dlnk/dT =E/RT2 式中，E是活化能；R是气体常数；T是绝对温度。积分后可得： K =A e-E/RT 式中，A是Arrhenius常数。将上述两式联立就可得培养基在一恒定温度下灭菌的表达式： ln (N0 /Nt )= A·t·e-E/RT。 式中，ln (N0 /Nt )被称为Del系数，它表示在一定热量和时间条件下，活菌数目减少的数量。对为达到某一Del值所需灭菌时间的对数和绝对温度的倒数作图，可得一直线。直线的斜率与反应的活化能有关。见图3.5.2。从图中可清楚地看到，在相当大的范围内，不同灭菌时间和温度值可以得到相同的灭菌效果。也就是说，高温瞬时灭菌和低温长时间灭菌均可达到同样的效果。 因为我们无法了解所有的待灭菌物中微生物的热致死特性，所以，常假设杂菌是嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的芽孢，一种已知耐热性最强的微生物，并根据是否能够杀死该芽孢来设计，使灭菌过程有可靠的保障。嗜热脂肪芽孢杆菌的热致死特性为：E = 67.7千卡/摩尔；A = 1×1036.2秒-1。然而，应该考虑到这些参数会随着培养基的不同而改变，例如：干燥的嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢悬浮在含水量较低的脂肪和油中比其在其它湿润条件下的耐热性强十倍。 在考虑获得预期Del系数的同时，我们还要注意到灭菌过程对培养基成分的破坏。图3.5.3 说明了延长培养基的灭菌时间对随后的发酵过程的影响。曲线开始一段产量上升是因为短时灭菌造成培养基的“烹饪效应”而使菌体能更快地获取养分。  图3.5.2 灭菌温度和时间对Del系数的影响 图3.5.3 灭菌时间对相继发酵产量的影响 表3.5.4 纯蒸汽压力与纯蒸汽温度的关系 蒸汽压力 蒸汽温度  大气压(atm) 千克/厘米2(Kgf/cm2) 磅/英寸2 (1bf/in2) 兆帕(MPa) ℃  0 F  1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.50 3.00 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.50 2.00 0.00 3.75 7.50 11.25 15.00 22.50 30.00 0.000 0.025 0.050 0.075 0.100 0.150 0.200 100.0 107.0 112.0 115.5 121.0 128.0 134.5 212 224 234 240 250 262 274  注：1千克/厘米2(Kgf/cm2) =105帕；1磅/英寸2 = 6894.76帕； 0 F=9/5×℃+32；℃=5/9×（0 F-32） 实验室常用高压蒸汽锅灭菌。高压蒸汽灭菌不是靠压力，而是靠蒸汽的高温。其主要过程是煮沸灭菌锅内的水或通入水蒸汽，驱尽空气，使锅或罐内温度升至100℃以上。纯蒸汽压力与纯蒸汽温度的关系见表3.5.4。若锅内留有空气，锅内温度将达不到压力表所对应的温度。一般将蒸汽压升至0.1MPa，此时的温度是121℃，维持15~30分钟。有时待灭菌物品中有糖等易受热变性的化合物，则要适当地降低灭菌的压力和时间，尽管这样做会增大染菌的危险性。也可以采用分别灭菌的方法以避免热敏物质的降解或营养物之间的反应。灭菌完毕后应缓慢地放气减压，以免被处理容器内液体突然沸腾，弄湿棉塞或冲出容器。当压力降到零时，才能打开灭菌锅的盖子。高压蒸汽灭菌锅适用于一切微生物实验室、医疗保健单位和工厂菌种室的培养基、器材和其它物料的灭菌。图3.5.4是一种直接利用蒸汽加热的灭菌器。  图3.5.4 一种高压蒸汽灭菌装置 发酵工厂将培养基和发酵设备放在一起灭菌的过程称为实罐灭菌（实消）。发酵罐体单独的灭菌过程称为空罐灭菌（空消）。空罐灭菌一般用于连续灭菌的罐体准备以及染菌罐处理等。实罐灭菌和空罐灭菌都属常规加压灭菌，也可称为批式灭菌。培养基连续经过流动式灭菌器灭菌后再进入发酵罐的过程称为连续灭菌（连消）。 实罐灭菌先将输料管路内的污水排掉，冲洗干净，然后将配制好的培养基用泵打入发酵罐（种子罐或料罐）内，同时开动搅拌器。灭菌前先将各排气阀打开，将蒸汽引入夹套或蛇管进行预热，待罐温升至80~90℃时，将排气阀逐渐关小。接着，将蒸汽从进气口、排料口和取样口直接通入罐中（如有冲视镜管也应同时进汽），使罐温上升到118~120℃，罐压维持在0.9~1.0公斤/厘米2（表压），保温30分钟左右。各路蒸汽进口的进汽要通畅，防止短路逆流。罐内液体翻动要激烈。排气也要通畅，但排气量不宜过大，以节约蒸汽。灭菌将要结束时，立即引入无菌空气，以保持罐压，然后再开夹套或蛇管冷却水冷却。这样可以避免罐压迅速下降而产生负压并抽吸外界空气。在引入无菌空气前，罐内压力必需低于空气过滤器压力，否则，培养基或物料将倒流入过滤器内。灭菌时，总蒸汽压力要求不低于3.0~3.5公斤/厘米2，使用压力不低于2公斤/厘米2。（总蒸汽压力系指蒸汽总管道压力。使用压力系指通入罐中时的蒸汽压力）。 空罐灭菌即发酵罐的罐体灭菌。空罐灭菌一般维持罐压1.5~2.0公斤/厘米2 、罐温125~130℃、时间30~45分钟，灭菌时要求总蒸汽压力不低于3.0~3.5公斤/厘米2，使用蒸汽压力不低于2.5~3.0公斤/厘米2。灭菌结束后，为避免罐压急速下降造成负压，要等到经过连续灭菌的无菌培养基输入罐内后，才可以开冷却水冷却。 实罐灭菌和空罐灭菌必需避免“死角”，即活蒸汽到达不了或达不到灭菌温度的地方。因为“死角”处只能靠热传导进行灭菌，假如积垢过多，单靠热传导会造成灭菌不彻底而染菌。 除了灭菌温度和时间外，蒸汽灭菌效果还受到其它一些因素的影响，如灭菌物品的含菌量，容器内残留空气量，灭菌对象的pH等等。pH6.0~8.0时，微生物不易死亡，pH小于6.0时，则易被杀死。灭菌对象的体积将影响热传导，体积越大，灭菌所需的时间也越长。 实罐灭菌需要较长时间在罐内加热和冷却培养基，如一个50m3的发酵罐，装料35m3，从预热到消后冷却，就需要8小时左右。这段时间发酵罐不能用于发酵，所以，实罐灭菌的设备利用率要低于连续灭菌。由于实罐灭菌是间歇性操作，蒸汽负荷高峰相对集中，这也将给蒸汽的供应系统带来一定的困难。然而，实罐灭菌的操作比较简单，染菌的机会较少，而且当采用较低的冷却温度和较大的冷却面积时，对培养基的质量影响较小。 为了降低高温对培养基成分的破坏，在设计批式灭菌的工序时，应该将升温和降温过程也考虑进去，即Del系数总 = Del升温 + Del冷却 + Del恒温期 。 Del系数随发酵罐体积增大而增大。为达到较高的Del系数而增加恒温时间将会增加养分的破坏，而且，随着规模的增大，升温和降温过程对养分的破坏将会加剧。这是批式灭菌的规模增大会造成产量下降的原因之一。较好的解决方法是采用连续灭菌法。 5) 连续灭菌法( continous sterilization) 在考察Del系数时，显然可见采用高温瞬时灭菌将更有利于达到灭菌目的，而且大大降低了对培养基成分的破坏。有人做过试验，将芽孢和维生素在高压下加热，当温度为118℃，加热时间为15分钟时，杀死99.99%芽孢，维生素的破坏率为10%；而当加热温度为128℃，时间1.5分钟时，芽孢同样可杀死99.99%，维生素的破坏率却下降为5%。所以，理想的手段是将培养基瞬间升温，然后迅速降温至发酵温度。但是，实际操作中将一大罐原料迅速加热到高温，持续片刻后又迅速冷却显然是不可能的。能实现短时高温灭菌效果的唯一可行方法是流动式连续灭菌。就是将培养基在发酵罐外按需要连续不断地加热、保温和冷却，然后送入发酵罐内。一般采用135~140℃、5~15秒短暂的加热过程，然后需要在维持罐内继续保温5~8分钟，以达到彻底灭菌的目的。输送培养基泵的出口压力一般为6公斤/厘米2，所以总蒸汽压力要求达到4.5~5.0公斤/厘米2以上。两者压力接近时才能使培养基的流速维持均匀稳定，否则，流速的变化将影响灭菌的效果。连续加压灭菌既达到了灭菌的目的，又减少了营养物质的损失。同时，总的灭菌时间减少了，还能提高发酵罐的利用率。操作过程的劳动强度低，适合采用自动化操作。 典型的培养基的连续灭菌的流程见图3.5.5。  图3.5.5 培养基连续灭菌示意图  图5.3.6 双层螺旋型换热器 早期的连续灭菌器是由一些板式换热器组成的。它们存在两大不足。一是若平板间的填料出现故障将会造成已消毒的蒸汽和未消毒的蒸汽混合；二是培养基中的颗粒成分会堵塞换热器。现代的连续灭菌器是双层螺旋型换热器，见图5.3.6 。两层不锈钢薄板，围绕中轴旋转形成两层平行的螺旋通道。螺旋通道的末端被封闭。为达到灭菌温度，蒸汽通过其中一层螺旋通道，而培养基逆流通过另一层螺旋通道。螺旋换热器也可作为冷却器用于流出培养基的冷却。而配料罐流出的培养基在注入灭菌器前可作为第一冷却器的冷源而被预热，省略了预热罐。同时使流出的培养基得到一定的冷却。这种换热器能保证两股流体分开，而且，不易被颗粒堵塞。恒温的时间由蛇管的长度和培养基的流速来调控。 连续处理过程主要优点是可以使用一个较高的灭菌温度和较短的恒温时间，所以养分损失较小。连续灭菌过程中培养基是一点点加入的，所以相对于批式灭菌系统其升温和降温所需的时间也较短。但是，批式灭菌与连续灭菌法相比仍有它的优势，如（1）设备投资省。连续灭菌需要较高的控制精度，需要较为成熟的计算机控制系统；(2 ) 受污染的风险小，因为连续灭菌时必须将无菌发酵液通过无菌操作输送到发酵罐中；(3) 更易于人工控制；(4) 便于对固体成分较高的培养基进行灭菌。所以，目前连续灭菌只是一种供选用的灭菌方法，批式灭菌仍被大多数发酵企业所采用。 发酵过程中需要添加各种各样添加剂。对添加剂灭菌的方法应依其性质、体积和进料速度而定。如果，添加剂是以大剂量进料，那需要采用连续灭菌法。一般采取将蒸汽通入补料的储罐进行批式灭菌。如糖水罐灭菌的压力1Kg/cm2，时间30分钟左右。油（消泡剂）罐灭菌的压力1.5~1.8Kg/cm2，时间60分钟。灭菌时，糖水要翻腾良好，但温度不能过高，否则，将使糖分大量破坏。.不论采用哪种灭菌法，都需对进料的辅助设备和管路进行灭菌。一般都应灭菌保温60分钟。 生产用的大多数微生物存在“异种”基因，所以，它们将受到严格的污染控制。这些微生物发酵的废液在排放之前必须灭活。灭活可采取分批或连续法。批式操作是将蒸汽通入恒温槽中。连续法是采用前面讨论过的热交换器。无论哪种方法，处理液都要冷却到60℃以下再倾倒。 有机物 多肽类沉淀 高温灭菌的 形成沉淀物 无机物 磷酸盐、碳酸盐沉淀 不利影响 破坏营养成分 （ 产生氨基糖、焦糖和黑色素） 改变pH值 （ 一般会降低pH值） 降低培养基浓度 （ 冷凝水的聚集） 虽然，高温是有效的灭菌手段，但是，它也对被灭菌物品带来以下一些不利的影响： 高温灭菌过程对培养基的破坏主要有两种情况：造成培养基成分相互作用；造成热稳定性差的化学成分的破坏。 前者在降低培养基质量的同时，还会引起培养基变色、沉淀。变色反应一般是由来自还原糖的羰基与氨基酸和蛋白质中的氨基反应而引起的。在加热情况下，培养基中Ca2+、Fe3+等成分易与磷酸盐发生沉淀反应。 后者使某些维生素、氨基酸、蛋白质和糖等遭到破坏。例如：10%的葡萄糖溶液经121℃灭菌15分钟后，会被破坏24%。 在某些特殊情况下，可采取过滤除菌等方法。然而，对于大多数发酵过程，以上问题都可以通过选择合适的灭菌条件加以解决： (1) 分开灭菌 对培养基中糖类等不耐高温的成分与培养基其它成分分开灭菌，冷却后再混合。将培养基中Ca2+、Fe3+成分与磷酸盐分别灭菌，以免发生沉淀反应。 (2) 低温灭菌 葡萄糖经过112℃（0.75Kg/cm2,或8磅/in2 ）灭菌15分钟，只会破坏了0.60%。所以，对这些成分可通过降低灭菌温度或缩短灭菌时间，尽可能减少损失。 (3) 间歇灭菌 采用丁达尔灭菌法。 (4) 连续灭菌 连续灭菌可以缩短灭菌的时间，减少营养成分的损失。 在实际工作中，无论采用哪种灭菌的方法，都不能也没有必要做到理论上的彻底无菌。对发酵工业而言，只要做到染杂菌的概率在1%以下，就可满足发酵的基本要求。过高的灭菌指标往往造成营养物的过度损失、能耗及其它操作成本的增加。 3.5.1.3过滤除菌法(filter sterilization) 过滤器主要有两类。一类是绝对过滤器(absolute filter)，过滤介质呈膜状，其滤孔比要除去的颗粒的直径小。理论上可以100%除去微生物；另一类是深层过滤器(depth filter)，其空隙的直径比要除去的颗粒的直径大。它们由毡毛、棉花、石棉和玻璃纤维等组成。“绝对”和“深层”术语的描述并不准确。因为绝对过滤器的过滤作用并不只发生在过滤器的表面，其实它也有一定厚度，过滤器的内部与表面一样有过滤作用。因此，有人将前者称为固定孔过滤器(fixed pore filter)，其空隙的孔径均一；后者称为非固定孔过滤器(non-fixed pore filter)，其空隙的孔径不均一。绝对过滤器去除颗粒的主要机理是拦截作用(interception)。可以通过控制孔的大小来保证除去一定大小范围的颗粒。因为也有一定的厚度，所以，也可通过惯性碰撞(inertial impaction)、扩散(diffusion)和吸附(electrostatic attraction)等作用去除比孔径小的颗粒。这些作用在空气过滤时显得格外重要。绝对过滤器的主要缺点是流动阻力会造成巨大的压力降。采用带许多皱褶的薄膜可以增大表面积，从而减小压力降。深层过滤器主要工作机理是通过惯性碰撞、扩散和吸附等作用除菌，而非拦截作用。从理论上讲，它不可能绝对地去除所有的颗粒。深层过滤介质可分为两类。一类如棉花纤维、玻璃纤维、合成纤维和颗粒状活性炭等，它们要填充在一定的容器中定形；另一类已制成板或管状。如石棉板和烧结材料等。这些材料的除菌效率比前一类高。 培养基的过滤除菌 对于含酶、血清、维生素和氨基酸等热敏物质的培养基，无法采用高温灭菌法，但可以通过过滤手段除去菌体。过滤介质有醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚醚砜、尼龙、聚丙烯腈、聚丙烯、聚偏氟乙烯等膜材料，也有石棉板、烧结陶瓷和烧结金属等深层过滤材料。实验室中常用察氏（Seitz）滤器和一些膜过滤器，见图3.5.7。  图3.5.7 实验室用过滤除菌装置 1.经典的察氏过滤器；2.目前常见的膜过滤器 实验室常用滤器的孔径是0.45(m 和0.22(m 。可以拦截细菌、放线菌、酵母和霉菌等通过。图3.5.8是采用醋酸纤维素膜过滤器所拦截的大肠杆菌。常用的过滤器一般无法去除病毒。如果有必要，可使用孔径0.04(m 的过滤器去除病毒。通常情况下，可将一系列不同的滤器组合使用。如用于制备无菌、无支原体的血清过滤系统。它包括四个按顺序安装的过滤器。第一道过滤器是带正电的聚丙烯膜过滤器，其直径5(m ，用于去除粗糙的沉淀物、块状物等。第二道也是带正电的聚丙烯膜过滤器，其直径0.5(m 。可以去除大部分微生物和脂类物质等。第三道是带正电的单层尼龙/聚酯膜过滤器，其孔径0.1(m ，可进一步去除微生物和内毒素。第四道过滤器与第三道相似，但它是双层结构，可以去除支原体，并保证绝对无菌。联合使用多级过滤器可以延长昂贵的小孔径过滤器的使用寿命。  图3.5.8 醋酸纤维素膜过滤器拦截的大肠杆菌图片 2) 空气过滤除菌 绝大多数工业生产菌是好氧性的，发酵过程中必须通入无菌空气来满足生产菌的生理需求。工业发酵中的空气系统通常采用过滤法去除空气中的菌体、灰尘和水分等。其一般过程见图3.5.9。 通常将天空高处的空气吸入后，经过粗过滤器初滤，然后进入空气压缩机。提高空气吸入口的高度可以减少吸入空气的微生物的含量。据报道，吸气口每提高3.05米，微生物数量减少一个数量级。由于空气中的微生物数量因地区、气候而不同，因此吸气口的高度也应因地制宜。一般以离地面5~10米较好。在吸气口处需要设置防止颗粒及杂质吸入的筛网（也可装在粗过滤器上）。吸入空气在进入压缩机前先经过粗过滤器过滤，可以减少进入空压机的灰尘和微生物，减少往复式压缩机活塞和汽缸的磨损，也减轻过滤除菌的负荷。常用的粗过滤器由油浸铁丝网、油浸铁环或泡沫塑料等材料构成。 图3.5.9 空气过滤除菌系统 从空气压缩机出来的空气（一般压力在2.0Kg/cm2以上，温度120~150℃），先冷却至适当温度（20~ 25℃)除去油和水，再加热至30~35℃，最后通过总空气过滤器和分过滤器（有时不用分过滤器）除菌，获得洁净度、压力、温度和流量都符合工艺要求的灭菌空气。 空气中的微生物通常不单独存在，而是依附在尘埃和雾滴上。因此，空气进入压缩机前应尽量去除尘埃和雾滴。空气中的雾滴不仅带有微生物，而且，还会使空气过滤器中的过滤介质受潮而降低除菌效率，以及使空气过滤器的阻力增大。因此，必须设法使进入过滤器的空气保持相对湿度在 50~60%左右。从空气压缩机出来的空气，温度为120℃（往复式压缩机）或150℃（涡轮式压缩机），其相对湿度大大降低，如果在此高温下就进入空气过滤器，可减少压缩空气中夹带的水分，使过滤介质保持干燥。但是，一般的过滤介质耐受不了这样的高温，因此，压缩空气一般是先经过一级冷却器将温度降至40~50℃左右，再经二级冷却器将温度降至20~25℃。冷却后空气的相对湿度提高到100%，所以，水分凝结成水滴或雾沫。用旋风分离器和丝网除沫器等将它们分离出去。然后再将压缩空气加热，降低其相对湿度，使未除尽的水分不致于凝结出来。 空气通过往复式压缩机的汽缸后所夹带的油雾滴，同样也会粘附微生物、降低过滤器的除菌效率及使过滤阻力增大。通过以上冷却分离过程可以和水分一起分离除去。如果往复式压缩机采用半无油润滑或无油润滑的，可大大降低压缩空气的油雾含量。 空气过滤介质不仅要有较高的除菌效率，而且，还要能用高温灭菌、不易受油水沾污、阻力小、成本低、来源充足、经久耐用和便于调换操作等特点。常用的空气过滤介质有棉花和活性炭（总过滤器和分过滤器）、玻璃棉和活性炭（一级过滤）、超细玻璃纤维纸（一般用在分过滤器）、石棉滤板（分过滤器）、烧结陶瓷和金属。 棉花和活性炭过滤器，因其介质层厚、体积大、吸油水的容量大，受油水影响相对要小。但这种过滤器调换介质时较为麻烦。填充也不易均匀。气体处理的量不大且质量差。尤其是遇水湿润会造成气阻增大。这种过滤器已逐渐被淘汰。 超细玻璃纤维纸作为过滤介质时，一般采用4~6层叠在一起使用。其除菌效果较好，调换方便，但易被水、油所沾污，易被蒸汽冲击折裂。在空气预处理较好的情况下，采用超细玻璃纤维纸作为总过滤器和分过滤器的介质，染菌率很低。但在空气预处理较差的情况下，其除菌效果往往受影响较大。 金属过滤器是用超细镍粉经压延等加工处理制成的管状的金属多孔滤膜，膜厚度约0.7mm，每个短管即为一个过滤单元，根据处理量，可采用易一系列多管复式过滤装置。金属过滤器的除菌效率也较高，这使得过滤器体积可大大减小。一般在空气进罐前设置粗滤（0.45(m）和精滤(0.22(m)两道金属过滤器。 聚四氟乙烯和聚偏二氟乙烯等疏水性微孔滤膜构成的过滤器是国际上八十年代发展起来的高效空气滤菌新技术。聚四氟乙烯类是疏水性的，不会受潮，可以用蒸汽灭菌。由于质地柔软，可以随意褶叠，具有体积小，过滤面积大的优点，能抗气流和抗氨（有时空气需加氨调整pH）。因为膜孔径可以均匀控制，所以气体净化的质量高。上述优势使这类绝对过滤器已成为较理想的空气滤菌的替代产品。 实验室中的超净工作台和超净室也是通过空气过滤系统，送入无菌的空气。 3.5.1.4 紫外线灭菌 紫外线是一种较常用的杀菌剂.波长在210~313nm范围都有效，最常用的波长是253.7nm左右。紫外线对芽孢和营养细胞都能起作用，但其穿透力很弱，一般只用于物体表面和空间的消毒。其灭菌的原理主要是它作用于生物体的DNA，促其形成胸腺嘧啶二聚体，造成菌体死亡。另外，它可使空气中氧形成臭氧（O3），臭氧也会与生物体的活性成分发生氧化反应，造成它们失活。 3.5.1.5其它放射线灭菌 CO60可放出(射线，它是较先进的杀菌剂。将待灭菌物品通过传送带经过CO60照射区就可达到灭菌的目的。其优点每次可灭菌较多的物品，尤其是密封的物品，不耐热的物品。不会留下污染物。医用的一次性塑料用品就是用CO60照射灭菌的。但是，该法对设备的要求高，适用范围有限。如培养基等就不宜通过该法灭菌。 3.5.2常用控菌的化学方法 能抑制、杀死微生物的化学因素种类较多，用途也相当广泛，主要可以分为以下几类： 液体消毒剂 表面消毒剂 气体消毒剂 化学因素 防腐剂 化学治疗剂 （抗代谢药物，磺胺类，抗生素） 凡用于杀死微生物的化学药品都称为化学消毒剂；凡用于抑制体外微生物生长的化学药品称为防腐剂；实际上，小剂量的消毒剂也就是防腐剂。 3.5.2.1 化学表面消毒剂 化学消毒剂的种类较多，主要见表3.5.5。 表3.5.5 主要的表面消毒剂及其应用 类型 名称及使用方法 作用机制 应用范围  醇类 70~75%乙醇 蛋白变性，破坏细胞膜，脱水，溶解类脂 皮肤，器皿  醛类 0.5~10%甲醛 2% 戊二醛（pH8左右） 破坏蛋白质氢键或氨基 破坏蛋白质氢键或氨基 物品消毒，接种室熏蒸 物品消毒  酚类 3~5%石炭酸 2%煤酚皂（来苏儿） 蛋白质变性，损伤细胞膜 蛋白质变性，损伤细胞膜 地面，家具，器皿 皮肤  酸类 5~10ml醋酸/米2 破坏细胞膜和蛋白质 房间熏蒸消毒  氧化剂 0.1%高锰酸钾 3%过氧化氢 0.2~0.5%过氧乙酸 ~1mg/L臭氧 氧化蛋白质活性基团 氧化蛋白质活性基团 氧化蛋白质活性基团 氧化蛋白质活性基团 皮肤、水果、蔬菜 污染物品表面 皮肤、塑料、玻璃，人造纤维 食品  气体 600mg/L环氧乙烷 有机物烷化，酶失活 手术器械，食品，毛皮  重金属盐类 0.05~0.1%升汞 2%红汞 0.01~0.1%硫柳汞 0.1~1%AgNO3 0.1~0.5%CuSO4 与蛋白质巯基结合使失活 与蛋白质巯基结合使失活 与蛋白质巯基结合使失活 变性、沉淀蛋白 与蛋白质巯基结合使失活 非金属物品，器皿 皮肤、粘膜、小伤口 皮肤、手术部位、生物制品防腐 皮肤，新生儿眼睛 杀植物真菌  卤素及其化合物 0.2~0.5mg/L氯气 10~20%漂白粉 0.5~1%漂白粉 0.2~0.5%氯胺 4mg/L二氯异氰尿酸钠 3%二氯异氰尿酸钠 2.5%碘酒 破坏细胞膜、蛋白质 破坏细胞膜、蛋白质 破坏细胞膜、蛋白质 破坏细胞膜、蛋白质 破坏细胞膜、蛋白质 破坏细胞膜、蛋白质 酪氨酸卤化，酶失活 饮水，游泳池水 地面 饮水，空气（喷雾），体表 室内空气（喷雾），表面消毒 饮水 空气（喷雾），排泄物 皮肤  表面活性剂 0.05~0.1%新洁尔灭 0.05~0.1%杜灭芬 蛋白变性，破坏膜 蛋白变性，破坏膜 皮肤，粘膜，手术器械 皮肤，金属，棉织品，塑料  染料 2~4%龙胆紫 与蛋白质的羧基结合 皮肤，伤口   1) 乙醇 乙醇的杀菌机理是它的脱水作用、溶解细胞膜脂和进入蛋白质的肽键空间结构，引起蛋白质变性。70~75%是乙醇消毒的最佳浓度。乙醇浓度过高时， 会使菌体表面蛋白变性，形成一层蛋白质沉淀膜，阻止乙醇进入菌体。浓度太低时，乙醇无法起到原有的作用。 乙醇主要用于物体的表面和皮肤的消毒。 2) 甲醛 甲醛的杀菌机理是它能破坏蛋白质的氢键，并能与氨基结合，从而造成蛋白质变性。它的杀菌效果较好，对营养体和孢子都有作用。工厂和实验室常采用甲醛熏蒸进行空间消毒。熏蒸的要求是6克甲醛/米3，熏8~12小时。可以采用加热或加入高锰酸钾促进甲醛蒸发。甲醛对人体有害，并有强烈的刺激性气味，可以在熏蒸后，用氨水中和气味。 3) 新洁而灭 新洁而灭是季胺类，属阳离子表面活性剂。它与菌体表面结合，破坏膜结构，并能使蛋白变性。常用于物体表面和皮肤的消毒。 4) 氯、次氯酸钠、漂白粉（次氯酸钙） 利用它们的氧化性可破坏细胞膜和酶蛋白的结构，从而造成菌体死亡。可以利用它们进行环境消毒和空间消毒。 5) 来苏儿（2%煤酚皂） 石炭酸（甲酚）能使蛋白质变性，并能损伤细胞膜，因而是较好的消毒剂。石炭酸的水溶性较差，通常将它与皂液和煤油混合，增加其溶解度。这种混合液称为来苏儿。常用于物体表面、地面和皮肤等消毒。 早期，新研制的消毒剂常与石炭酸作比较，以石炭酸系数（Phenol coefficient,P.C.）作为评价的指标。所谓的石炭酸系数是指在一定时间内，被试药物能杀死全部供试菌的最高稀释度与达到同效的石炭酸稀释度比率。如供试菌为沙门氏杆菌，受试药1:300稀释度，10分钟可杀菌，石炭酸在1:100稀释度，10分钟可以杀菌，那么，受试药的石炭酸系数为3。 6) 硝酸银（AgNO3） 硝酸银属重金属，能造成蛋白质变性沉淀。它常在医学上用于皮肤和眼睛等部位的消毒。 7) 红汞 也属于重金属，它能与蛋白质的巯基结合，使蛋白质变性失活。医学上常用于皮肤伤口的消毒。 9) 龙胆紫（结晶紫染料） 2~4%的结晶紫溶液也是较好的皮肤伤口消毒剂。结晶紫染料能与蛋白质的羧基结合，造成蛋白变性，达到杀菌的目的。 10) 过氧化氢（H2O2） 3%的过氧化氢也是一种皮肤伤口消毒剂。其杀菌机理是利用其氧化性使蛋白质活性基团被氧化而失活。 11) 碘酒 2.5%的碘溶解于酒精中，就成了另一种皮肤消毒剂。其杀菌机理是利用碘与蛋白质中的酪氨酸发生卤化反应，而使得蛋白失活。 12) 硫磺粉 硫磺燃烧产生SO2，SO2与水结合形成H2SO3，在菌体表面夺取氧成为H2SO4，从而致使菌体脱氧死亡。硫磺粉常被用于厂区消毒。 3.5.2.2 防腐剂 防腐是利用物理和化学的手段，完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，防止食品等发生霉变的措施。此时，微生物并没有被杀灭，而只是受到抑制。防腐的手段很多，如造成低温、隔氧（或充氮）、干燥、高渗、高酸等保藏环境。而添加防腐剂也是一种常用的防腐措施。如酱油中的苯甲酸钠，饮料和化妆品中的山梨酸钠都是良好的防腐剂。 3.5.2.3 化学治疗剂 所谓的化学治疗就是利用具高度选择毒力的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，甚至杀灭，达到治疗疾病的目的。化学治疗剂主要有抗代谢类药物、抗生素和中草药等。 1) 抗代谢类药物 有些化合物在结构上与生物体所必需的代谢物很相似，以致可以和特定的酶结合，从而阻碍酶的功能，干扰代谢的正常进行，这些物质称为抗代谢物。若用于疾病的治疗，可以称为抗代谢类药物。 磺胺类药物是典型的抗代谢类药物，至今，已合成过许多磺胺类药物，其中有代表性的见表3.5.6，它们都有相同的核心结构。磺胺类药物可以治疗许多传染病，其作用机理较清楚。因为它的核心结构与细菌的生长因子对氨基苯甲酸（PABA）相似，见图3.5.10，两者有竟争性拮抗作用。许多细菌需外界提供PABA作为生长因子，用于合成四氢叶酸（FH4，THFA）。四氢叶酸是合成代谢中不可缺少的重要辅酶，专门用于转移一碳单位。四氢叶酸在细菌胞内合成的过程如图3.5.11所示。  图3.5.10 PABA与磺胺结构的比较  图3.5.11 四氢叶酸在细菌胞内的合成途径 磺胺可竞争性地抑制酶①催化的反应。此外，TMP（三甲基苄二氨嘧啶）能抑制酶③，使二氢叶酸无法还原成四氢叶酸，所以，它是磺胺药的增效剂，可以加强磺胺药的作用。 以PABA为生长因子的细菌，如链球菌会因为磺胺类药的存在而不能存活；而人体不存在这一反应酶系，所以，不能利用PABA来合成FH4，需要体外直接提供FH4，所以，磺胺类药物对人体本身的代谢没有影响；有些致病菌也没有该酶系，必需外界提供FH4，磺胺药对这些菌也无效；另外，当环境中含有大量的PABA或FH4时，磺胺药也会失效。 2) 抗生素（antibiotics) 抗生素是许多生物的生命活动过程中产生的一类次级代谢产物或其人工衍生物，它们在很低浓度时就能抑制或影响其它种类生物的生命活动。抗生素通过抑制细胞壁的合成、改变细胞膜的通透性、抑制蛋白质或核酸的合成等反应机理抑制或杀死微生物。抗生素是目前治疗微生物感染和肿瘤等疾病的常用药物。在工业发酵中，抗生素也可以用于控制杂菌污染；在微生物育种中，抗生素常常作为高效的筛选标记。 3.6 菌种保藏 菌种是一个国家的重要自然资源。菌种保藏是一项重要的工业微生物学基础工作。优良的菌种来之不易，所以，在科研和生产中应设法减少菌种的退化和死亡。菌种保藏的目的是保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活能力，不被其它杂菌污染，形态特征和生理性状应尽可能不发生变异，以便今后长期使用。 表3.5.6 若干磺胺药物的分子结构 3.6.1菌种的退化及防治 3.6.1.1菌种退化(Degeneration ) 生产菌株生产性状的劣化、遗传标记的丢失称为菌种退化。菌种退化可以是形态上的，也可以是生理上的。如产孢子能力、发酵主产物比例下降等。 就产量性状而言，菌种的负变就是退化。其它原有的典型性状变得不典型时，也是退化。最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变。例如苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis)的芽孢和伴孢晶体变得小而少等；其次，就是生长速度缓慢，产孢子越来越少。例如，细黄链霉菌（Streptomyces microflavus)“5406”在平板培养基上菌苔变薄、生长缓慢，不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层，有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝；再次，则是代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降。比如赤霉素生产菌种藤仓赤霉（Gibberella fujikuroi）产赤霉素能力的下降，枯草杆菌（Bacillus subtilis）“B.F.7658”生产(-淀粉酶能力的衰退，以及白僵菌（Beauveria bassiana)对宿主致病能力的下降等；最后，退化还表现在抗不良环境条件（抗噬菌体、抗低温等）能力的减弱等。 菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程。首先，在细胞群体中出现个别发生负变的菌株，这时如不及时发现并采取有效的措施，而一味地移种传代，则群体中这种负变个体的比例逐渐增大，最后占据了优势，整个群体发生严重的退化。所以，开始时，所谓“纯”的菌株，实际上其中已包含着一定程度的不纯因素；同样，到了后来，整个菌种虽已“退化”，但也是不纯的，即其中还会有少数尚未退化的个体存在。 3.6.1.2 菌种退化的原因 1) 基因突变 菌种退化的主要原因就是那些控制生产性状的基因发生负突变。在生物进化的历史长河中，遗传性变异是绝对的，而它的稳定性是相对的；退化性变异是大量存在的，而进化性变异则是个别的。在自然条件下，个别适应性变异通过自然选择就可保存和发展，最后成为进化的方向。在人为条件下，人们通过人工选择，有意识地筛选出个别正突变体用于生产实践。相反，如不自觉、认真地去选择，大量自发突变菌株就会趁机泛滥，最后导致菌种退化。这也说明菌种的生产性状不进则退。 从生物体角度讲，生产实践中采用的优良菌株往往是不正常的，许多菌种是营养缺陷型，一旦发生回复突变，成为野生型，回到了正常的生理状态，生长力变得旺盛，在群体中就具有生长优势，随着传代次数增加，回复突变菌株在数量上逐渐占据优势，成为主要菌株，但对生产而言则是菌种发生了退化。表3.6.1 中说明了产腺苷的芽孢杆菌黄嘌呤缺陷型菌株随着接种传代次数的增加，出现产量下降和回复突变子增加的现象。可以看出，总保藏时间相同的情况下，回复子的比例随传代次数的增加而增加，回复子的比例越大，腺苷产量越低，这明确证实了基因突变与菌种退化的关系，并且，突变依赖于传代。 表3.6.1 产腺苷的黄嘌呤缺陷型菌株在接种传代中的产量和回复子数量的变化 实验 传代次数 每代斜面保存的时间（天） 回复子比例 腺苷产量（g /L）  ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ 1 2 6 7 9 12 (147) (133)(14) (47)(3)(9)(3) (71)(14) (47)(3)(9)(3)(13)(58)(14) (47)(3)(9)(3)(13)(8)(3)(47)(14) (47)(3)(9)(3)(13)(8)(3)(4)(14)(6)(6)(31) 1/4.5X106 1/2.4X106 1/2.2X105 1/3.5X106 1/5.3X103 1/1.0X103 13.2 14.9 10.7 13.1 8.1 7.4   对于非营养缺陷型的生产菌，也可自发突变成为负突变的菌株。当这些突变有利于它适应环境时，它们也能在数量上占据优势，造成菌种退化。如青霉素生产菌的两个变异菌株br bio nic和 w hi met都保持高产性状。但如果把bio nic每隔两周传代一次，则第10代产量降至75%，第11代为50%，第14代只有约33%；而 w hi met在4℃保藏半年产量并没下降。把退化菌株与4℃保藏菌混合接种到基本培养基筛得异核体，再分出两类菌株，则发现bio nic都是低产的，而w hi met都是高产的。保持异核体前性状表明了基因突变是其产量退化的原因。 2)分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核，或是单核但DNA双链之一发生突变，随着传代，其生产性状也将发生退化。这种退化不是基因突变引起的，而是由于诱变获得的高产株本身不纯。高产突变只发生在一个核和一条DNA单链上，随着细胞分裂，核发生分离，突变基因和未突变基因发生分离，出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株。 退化是菌种自发突变的结果，培养环境营养不良、发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化。根据菌种退化原因分析，可以制定出一些防治退化的措施。 3.1.6.3菌种退化的防治 1) 从菌种选育时考虑 在育种过程中，应尽可能使用孢子或单核菌株，避免对多核细胞进行处理，采用较高剂量使单链突变的同时，另一条单链丧失了模板作用，可以减少出现分离回复现象。同时，在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化，以保证获得菌株的“纯度”。 增加突变位点的筛选，也能预防回复子、减少菌种退化的可能性。如图3.6.1所示， 黄嘌呤缺陷型腺苷酸生产菌的代谢中，次黄嘌呤核苷酸是腺苷酸和鸟苷酸的共同前体，位点2处酶基因发生突变，则使鸟苷酸途径阻塞，前体转向合成腺苷酸，但位点2基因回复突变则又可使鸟苷酸途径畅通，腺苷酸产量下降。但是，如果筛选2、3位点同时突变的突变株，则能保持菌株的稳定性，因为，二个位点同时回复突变的可能性极低。 2) 从菌种保藏角度考虑 微生物都存在着自发突变，而突变都是在繁殖过程中发生或表现出来的，减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性。所以，不论在实验室还是在生产实践上，必须严格控制菌种的传代次数。斜面保藏的时间较短，只能作为转接和短期保藏的种子用，应该在采用斜面保藏的同时，采用沙土管、冻干管和液氮管等能长期保藏的手段。  图3.6.1 腺苷酸生产菌代谢途径 3) 从菌种培养角度考虑 各种生产菌株对培养条件的要求和敏感性不同，培养条件要有利于生产菌株，不利于退化菌株的生长。如营养缺陷型生长菌株培养时应保证充分的营养成分，尤其是生长因子；对一些抗性菌株应在培养基中适当添加有关药物，抑制其它非抗性的野生菌生长。另外，应控制碳源、氮源、pH和温度，避免出现对生产菌不利的环境，限制退化菌株在数量上的增加。例如在赤霉素生产菌Gebberella fujikuroi的培养基中加入糖蜜、天冬酰胺、谷氨酰胺、5’-核苷酸或甘露醇等丰富的营养物后，有防止菌种退化的效果；在栖土曲霉Aspergillus terricola3.942的培养中，有人采用改变培养温度的措施，即从28~30℃提高到33~34℃来防止它产孢子能力的退化。由于微生物生长过程产生的有害代谢产物，也会引起菌种退化，因此应避免将陈旧的培养物作为种子。 4) 从菌种管理的角度考虑 要防止菌种退化，最有效的方法是定期使菌种复壮(rejuvenation)。所谓的菌种复壮就是在菌种发生退化后，通过纯种分离和性能测定，从退化的群体中，找出尚未退化的个体，以达到恢复该菌种原有性状的一种措施。但这是一种消极的措施。有人对Streptomycees microflavus“5406”的分生孢子，采用-10~-30℃的低温处理5~7天，使其死亡率达到80%。结果发现，在抗低温的存活个体中，留下了未退化的健壮个体，从而达到了复壮的目的。 广义的复壮应是一项积极的措施，是在菌种尚未退化之前，定期地进行纯种分离和性能测定，以使菌种的生产性能保持稳定，广义的复壮过程有可能利用正向的自发突变，在生产中培育出更优良的菌株。 3.6.2菌种保藏的原理和方法 人们在长期的实践中，对微生物种子的保藏建立了许多方法。各种方法所适用微生物的种类和效果都不一样，在具体应用中各有优缺点。采用的措施有的简单，有的复杂，但它们的原理基本上是一致的，即选用优良的纯种，最好是休眠体（分生孢子、芽孢等），创造一个使微生物代谢不活泼，生长繁殖受抑制，难以突变的环境条件。其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养以及添加保护剂等。以下是一些常用的菌种保藏方法。 3.6.2.1定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基，也可进行穿刺培养，待生长成健壮的菌体（对数期细胞、有性孢子或无性孢子）后，将菌种放置4℃冰箱保藏，每间隔一定时间需重新移植培养一次。芽孢杆菌每3~6个月移种一次。其它细菌每月移种一次。如保藏温度高，则间隔的时间要短；放线菌4~6℃保藏，每3个月移种一次；酵母菌在4~6℃保藏，每4~6个月移种一次。某些种类酵母。如芽裂酵母、阿氏假囊酵母、棉病囊霉等，必须每1~2月移种一次；丝状真菌在4~6℃保藏，每4月移种一次；担子菌4~6℃保藏，每3月移种一次。 该方法是最早使用而且至今仍然普遍采用的方法。在实验室和工厂中，即便同时采用几种方法保藏同一菌种，这种方法仍是必不可少的。该法简单易行，代价小，能随时观察保藏菌株是否死亡、变异、退化或染菌。然而，这种方法的缺点是显而易见的。其保藏过程中微生物仍然有活动，所以，保藏的时间较短，菌种容易退化。采用无菌的橡皮塞代替棉塞，可以避免水分散发并且能隔氧，能适当延长保藏期。 3.6.2.2液体石蜡保藏法 液体石蜡保藏法如图3.6.2所示。这种方法是定期移植保藏法的补充。在生长良好的斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡，液面高出培养基1厘米，将其置试管架上以直立状态低温保藏。液体石蜡可以防止水分蒸发、隔绝氧气，所以，能延长保藏的时间。但其缺点是必须直立放在冰箱内，占据较大的空间。   图3.6.2 液体石蜡保藏法示意图 图3.6.3 沙管保藏示意图 3.6.2.3沙管保藏法、土壤保藏法 土壤是自然界微生物的共同活动场所，土壤颗粒对微生物具有一定的保护作用。沙管保藏法见图3.6.3。取河沙过24目筛，用10~20%的盐酸浸泡除去有机质，洗涤，烘干，分装入安瓿管，加塞灭菌。需要保藏的菌株先用斜面培养基培养，再用无菌水制成细胞或孢子悬液，将10滴悬液注入装有洗净、灭菌河沙的沙管内，使细胞或孢子吸附在沙上，放到干燥器中吸干沙中的水分，将干燥后的沙管用火焰熔封管口。可以室温或低温保藏。土壤法以土壤代替河沙，不需酸洗，经风干、粉碎、过24目筛，分装灭菌后，同上制备。以上两种方法统称为沙土管法，其特点是干燥、低温、隔氧、无营养物。保藏的效果较好，制作也简单，比液体石蜡法保藏时间长。此法适用于芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、放线菌和一些丝状真菌的保藏。保藏时间可达数年，甚至数十年。 3.6.2.4.麸皮保藏法 麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌的保藏。我国制曲已有悠久历史，曲既是酿造的酶制剂，又是保藏酿造用微生物的一种方式。将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀，加水或培养液与麸皮的比例为1:0.8或1:1或1:1.5，原则是按照不同菌种对水分要求不同而定。将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中，装入的麸皮应保持疏松，不要紧压。高温灭菌后，将菌种的孢子液接入。适宜温度下培养，直至长出菌丝。再放在干燥器中干燥后，20℃以下温度保藏。也可将小管用火焰熔封。该法操作简单，菌种保藏时间长，不易退化。工厂中经常采用。 3.6.2.5蒸馏水保藏法 这是最简单的保藏方法。每个试管中装5毫升灭菌的无菌水，用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞，接入蒸馏水中并使之悬浮，试管用无菌的橡皮塞塞紧，放置10℃低温保藏。需用时，可从管内移出一环接到培养基上，而原来的管加塞后仍可继续保藏。该法为菌种创造了一个无营养的环境，所以，也是一种保藏菌种的好方法。根据DeVay试验，该法适宜保藏诡谲棒状杆菌（Cornebacterium insidiosum)、根瘤病土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens)、假单孢菌（Pseudomonas sp.)等。也有人将其用于酵母菌保藏。 3.6.2.6冷冻干燥保藏法（Lyophilization,Freeze-Drying） 该法是将菌液在冻结状态下升华其中水分，最后获得干燥的菌体样品。它同时具备干燥、低温和缺氧的菌种保藏条件，所以，可使微生物菌种得到较长时间的保存。冻干的菌种密封在较小的安瓿中，避免了保藏期间的污染，也便于大量保藏。它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法。但是，该法操作相对繁琐，技术要求较高。 根据文献记载，除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外，其它多数微生物，如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等都能冻干保藏。许多菌种用此法可保藏10年以上。 安瓿管 菌种 配制保护剂 酸洗、水洗 培养 分装 烘干 制备菌悬液 灭菌 灭菌 分装安瓿管 预冻 真空干燥 装在歧管上抽真空 火焰上熔封安瓿管口 检测真空 保藏 图3.6.4 冷冻干燥保藏菌种的一般过程 冷冻干燥法一般过程见图3.6.4。预先将安瓿管用2%盐酸浸泡，洗净、烘干后，加入菌种编号标签纸条，加棉塞，湿热灭菌后烘干。微生物斜面培养至稳定期（最好形成孢子），加入保护剂制成细胞悬液。液体培养的菌体最好用离心法除去培养基后加保护剂制成细胞悬液。 在冷冻干燥脱水的过程中，保护剂起到稳定细胞膜的作用，即能推迟或逆转膜成分的变性，同时，由可以使细胞免于冰晶损伤而死亡。保护剂还在菌种保藏和复苏过程中起稳定细胞的作用。保护剂一般为脱脂牛奶或马血清等。 脱脂牛奶可由新鲜的牛奶制备。最好将新鲜牛奶冷藏过夜，除去表面脂肪皮膜。再每次用离心机3000rpm离心20~30分钟，离心2~3次，彻底去除脂肪。分装后116℃高压灭菌15~20分钟。也可用脱脂奶粉制备保护剂。用蒸馏水配制成10%或20%W/V浓度后，分装灭菌。 悬液的细胞浓度以108~1010个/ml为宜。将2~3ml保护剂加入斜面内，用接种针轻刮菌苔，注意不使悬液中带入培养基，也不能有过多的气泡。随即将悬液分装安瓿管。为避免保护剂或带入的培养基中某些成分或产物的影响，在1小时内必须将分装安瓿管放到-25~-40℃的低温冰箱或冻干装置中预冻。 预冻的目的是使水分在真空干燥时直接由冰晶升华为水蒸汽。预冻一定要彻底，否则，干燥过程中一部分冰会融化而产生泡沫或氧化等副作用，或使干燥后不能形成易溶的多孔状菌块，而变成不易溶解的干膜状菌体。预冻的温度和时间很重要。预冻温度一般应在-30℃以下。在0~(10℃范围内冻结，所形成的冰晶颗粒较大，易造成细胞损伤。-30℃下冻结，冰晶颗粒细小，对细胞损伤小。 待结冰坚硬后（约需0.5~1小时），可开始真空干燥。要求真空度在15分钟内达到0.5mmHg，并逐渐达到0.2~0.1mmHg 。在0.2mmHg真空度后水分大量升华，此时也可以略加温，以加快样品中水分升华，但需注意不能超过30℃。抽真空过程中样品应始终保持冷冻状态。当样品基本干燥后，样品温度上升，加速了样品残留水分的蒸发。少量样品经4小时左右便可以干燥。当真空度达到0.01mmHg时继续抽几分钟后，一边抽气，一边即可用喷灯熔封安碚管口。然后以高频电火花检查各安瓿的真空情况，管内呈灰蓝色光表示已达真空。检查时电火花应射向安瓿的上半部，切勿直射样品。制成的安瓿管可在4℃冰箱或室温下保藏。 冷冻真空干燥装置有各种形式，根据需要的工作量可选用单管式、岐管式、钟罩式、离心式、舱箱式等类型的真空干燥机。排列越是后面的类型，处理的量越大，设备也越复杂。一般实验室可采用现成的真空冷冻干燥机，也可自制歧管式冻干装置，见图3.6.5，这种装置每次能冻干10-20支安瓿，冻干管见图3.6.6。   图3.6.5 一种简易冷冻干燥装置 图3.6.6 冷冻干燥保藏管 冻干的菌种经保藏后，需用时可在无菌环境下开启安瓿恢复培养。先用锉刀在安瓿上部横锉一道痕迹。用烧热的玻棒置痕迹处，安瓿壁即出现裂纹。也可将安瓿上部置酒精灯上烧热，用冷的无菌水或培养基滴在痕迹处使其崩裂而打开安瓿瓶。将无菌的培养基注入安瓿中，溶解干燥的样品酥丸，摇匀。用无菌吸管取出悬液并移入适宜的培养基中培养。 研究表明，冻干法保藏菌种的存活率受到多方面的影响。不同的生物承受冻干处理过程的能力不同，所以，有些菌种不适合用冻干法保藏。冻干前的培养条件和菌龄也是影响因素，适宜条件下培养至稳定期的细胞和成熟的孢子具有较强的耐受冻干的能力。提倡采用较浓的菌悬液，虽然其存活率低，但绝对量比较高。保护剂对存活的影响很大，保护效果与保护剂化学结构有密切关系，有效的保护剂应对细胞和水有很强的亲和力，脱脂牛奶作为保护剂对多种微生物均有满意的结果。冻结速度慢会损坏细胞，而冻结速度过快（几秒钟内完成冻结）也会在细胞内形成冰晶，损害细胞膜，影响存活。干燥样品中残留少量水分（0.9~2.5%）对生物的生存有利；冻干管应避光保藏，尤其是避免直射光。适宜的恢复培养条件可以提高存活率。 3.6.2.7液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法，而其它方法又不能长期保藏，根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法。液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一。也是适用范围最广的微生物保藏法。几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏。只有少量对低温损伤敏感的微生物例外。液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏，不论孢子或菌体、液体培养物或固体培养物均可使用该法。 液氮超低温保藏过程是将菌种悬浮液封存于圆底安瓿管或塑料的液氮保藏管（材料应能耐受较大温差骤然变化）内，放到-150~-196℃的液氮罐或液氮冰箱内保藏。操作过程中一大原则是“慢冻快融”。 细胞冷冻损伤主要是细胞内结冰和细胞脱水造成的物理伤害。当细胞冷冻时，细胞内外均会形成冰晶，其冻结的情况因冷冻的速度而异。冷冻速度缓慢时，只有细胞外形成冰晶，细胞内不结冰，此现象为细胞外冻结。当冷冻速度较快时，细胞内外均形成冰晶，称为细胞内冻结。细胞缓慢冷冻时，主要发生细胞脱水现象。细胞大量脱水后电解质浓度升高，以致渗透压发生变化而导致细胞质壁分离。轻度的质壁分离损伤是可逆的，当脱水严重时，细胞内有的蛋白质、核酸等细胞成分的结合水也被排出，发生永久性损伤，导致死亡。细胞内结冰，特别是大冰晶，会造成细胞膜损伤而使细胞死亡。 对于抗冻性强的微生物，细胞外冻结几乎不会使细胞受损伤，而对于多数细胞来说，不论细胞外或细胞内冻结均易受到损伤。为了减轻冷冻损伤程度，可采用保护剂。液氮保藏一般选用渗透性强的保护剂，如甘油和二甲亚砜。它们能迅速透过细胞膜，吸住水分子，保护细胞不致大量失水，延迟或逆转细胞膜成分的变性并使冰点下降。通常将菌种悬浮在10%（V/V）甘油蒸馏水或10%（V/V）二甲亚砜蒸馏水保护剂中。孢子或菌体悬液的浓度大于108个/ml为好。事先，保护剂甘油应在121℃，蒸汽灭菌15分钟。二甲亚砜应过滤除菌。 细胞的冻伤程度随细胞的表面积大小、细胞壁厚薄和细胞浓度而异，因而要根据所保藏的微生物种类来设计降温曲线。一般可由室温开始以每分钟下降1~7℃的速度降至-40℃，然后，再快速降温至-150或-196℃。分二个或三个阶段降温可减轻细胞的冻伤程度。对一些厚壁的微生物细胞，即使每分钟下降100℃也不会引起细胞的内冻结。而对于一些细胞壁薄的微生物，特别是无细胞壁的原生质体，降温的速度影响很大。有人报道用液氮保藏青霉素生产菌的原生质体时，采用1℃/分降温速度慢速冷冻，原生质体存活率可达53.7~78.5%，而快速冷冻则造成原生质体破裂死亡。 微生物细胞的浓度对冷冻损伤程度也有影响。如去甲万古霉素生产菌用液氮保藏时，孢子浓度大于107个/ml的存活率比105个/ml孢子浓度时高15倍以上。 菌体的生长阶段对液氮保藏的效果也有影响。不同生理状态的微生物对冷冻损伤的抗性不同。一般来说，对数生长期菌体对冷冻损伤的抗性低于稳定期的菌体，对数生长期末期菌体的存活率最低。 细胞解冻的速度对冷冻损伤的影响也很大。因为，缓慢解冻会使细胞内再生冰晶或冰晶的形态发生变化而损伤细胞，所以，一般采取快速解冻。在恢复培养时，将保藏管从液氮中取出后，立即放到38~40℃的水浴中振荡至菌液完全融化，此步骤应在一分钟内完成。 液氮冷冻保藏管应严格密封。若有液氮渗入管内，在从液氮容器中取出时，管中液氮的体积将膨胀680倍，具很强的爆炸力，必须特别小心。 因为液氮容易渗透逃逸，所以，需要经常补充液氮。这是该法操作费用较大的原因。 3.6.2.8甘油保藏法 该法与液氮超低温保藏法类似。菌种悬浮在10%（V/V）甘油蒸馏水，置低温（-70~-80℃）保藏。该法较简便，保藏期较长，但需要有超低温冰箱。 实际工作中，常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中，并使甘油的终浓度在10~30%左右。再分装于小离心管中，置低温保藏。基因工程菌常采用该法保藏。 3.6.3国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种、菌株的基础上，把它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、不乱和便于交换使用的目的。国际上很多国家都设立了菌种保藏机构。例如：中国微生物菌种保藏管理委员会（CCCCM），美国典型菌种保藏中心（ATCC），美国的北部地区研究实验室（NRRL），英国的国家典型菌种保藏所（NCTC），日本的大阪发酵研究所（IFO），东京大学应用微生物研究所（IAM），荷兰的真菌中心收藏所（CBS），法国的里昂巴斯德研究所（IPL），及德国的科赫研究所（RKI）等。 中国微生物菌种保藏管理委员会成立于1979年。它的任务是促进我国微生物菌种保藏的合作、协调与发展，以便更好地利用微生物资源，为我国的经济建设、科学研究和教育事业服务。该委员会下设六个菌种保藏管理中心，其负责单位、代号和保藏菌种的性质如下： 普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）： 中科院微生物所，北京（AS），真菌、细菌； 中科院武汉病毒研究所，武汉（AS-IV），病毒； 农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）： 中国农业科学院土壤肥料研究所，北京（ISF）； 工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）： 轻工业部食品发酵工业科学研究所，北京（IFFI）； 医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）： 中国医学科学院皮肤病研究所，南京（ID），真菌； 卫生部药品生物制品检定所，北京（NICPBP），细菌； 中国医学科学院病毒研究所，北京（IV)，病毒； 抗生素菌种保藏管理中心（CACC）： 中国医学科学院抗生素研究所，北京（IA）； 四川抗生素工业研究所，成都（SIA）； 华北制药厂抗生素研究所，石家庄（IANP）； 兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC）： 农业部兽医药品检察所，北京（CIVBP） 中国微生物菌种保藏管理委员会汇集了六个保藏管理中心及其所属专业实验室、菌种站保藏的部分微生物名录，编写出版《中国菌种目录》一书，其中包括病毒、噬菌体、细菌、放线菌、酵母菌和丝状真菌六部分。 除上述保藏单位外，我国还有许多从事微生物研究并保藏有一定数量各类专用微生物菌种的科研单位和大专院校。 我国菌种保藏一般采用三种方法：(1)斜面定期移植法;(2)液体石蜡封藏法; (3) 冷冻干燥保藏法。对放线菌还另有沙土法，对丝状真菌另加麸皮法保藏。  图3.6.7 ATCC采用两种保藏方法示意图 在国际著名的美国ATCC（American Type Culture Collection），目前已改为仅采用两种最有效的方法，即保藏期一般达5~15年的冷冻干燥保藏法和保藏期一般达20年以上的液氮保藏法，以达到最大限度减少传代次数，避免菌种退化，见图3.6.7。图中表示当菌种保藏机构收到合适菌种时，先将原种制成若干液氮保藏管作为保藏菌种，然后再制成一批冷冻干燥管作为分发用。经5年后，假定第一代（原种）的冷冻干燥保藏菌种已分发完毕，就再打开一瓶液氮保藏原种，这样，至少在20年内，凡获得该菌种的用户，至多只是原种的第二代，可以保证所保藏的分发菌种的原有性状。