3.3 微生物的培养方法 微生物培养就是提供一个适宜特定微生物生长的理化环境，使其大量地繁殖。微生物培养的目的各有不同，有些是以大量增殖微生物菌体为目标（如单细胞蛋白或胞内产物），有些则是希望在微生物生长的同时，实现目标代谢产物的大量积累。由于培养目标的不同，在培养方法上也就存在许多差别。让所需的微生物大量繁殖，并进而产生大量目标代谢产物的过程称为微生物发酵，这尤其是指工业上大规模的微生物培养。“培养”和“发酵”两个概念经常是通用的，但它们与生物氧化中的“发酵”概念是截然不同的。 从历史发展的角度来看，微生物培养技术的发展主要有以下特点： （1）从少量培养发展到大规模培养。 （2）从浅盘培养发展到厚层固体或深层（液体）培养。 （3）从以固体培养为主发展到以液体培养为主。 （4）从静止式液体培养发展到通气搅拌式液体培养。 （5）从分批培养发展到连续培养以至多级连续培养。 （6）从游离的微生物细胞培养发展到利用固定化细胞培养。 （7）从单一微生物培养发展到混合微生物培养。 （8）从利用野生菌种发展到利用变异菌株以及“工程菌”。 总之，微生物培养的形式丰富多样，各具特色，各有所长。根据微生物种类、培养目的和要求、规模和资金投入的不同可以有不同形式的培养装置。良好的装置应在提供丰富而均匀的营养物质的基础上，保证微生物获得适宜的温度和对绝大多数微生物所必需的良好通气条件（除少数厌氧菌外），此外，还要为微生物提供一个适宜的物理化学条件和严密的防止杂菌污染的措施。以下是一些实验室和工厂中常见的微生物培养方法： 3.3.1固体培养（solid-state culture） 固体培养就是利用固体培养基进行微生物的繁殖。微生物贴附在营养基质表面生长，所以，又可称为表面培养(surface culture）。固体培养在微生物鉴定、计数、纯化和保藏等方面发挥着重要作用。一些丝状真菌也可进行生产规模的固体发酵。 3.3.1.1 实验室常见的固体培养 实验室主要有试管斜面、培养皿平板、较大型的克氏扁瓶和茄子瓶斜面等固体培养方法用于菌种的分离、纯化、保藏和生产种子的制备。用接种针挑取原始培养物后，在固体培养基表面划线接种，见图3.3.1(1,2,3) 和图3.3.2。也可以用涂布棒将少量的液体培养物涂布在整个固体培养基表面，或将少量液体培养物与融化后降温至50~60℃的固体培养基混匀，倒入培养皿中，浇注成平板。接种后的培养物直接放入培养箱中恒温培养。这些方法适用于好氧和兼性好氧微生物的培养。  图3.3.1 斜面接种和穿刺接种培养方法 斜面接种：1.接种针火焰灼烧灭菌；2.管口置近火焰处；3. 用接种针蘸取菌样后，移到斜面上划线；穿刺接种：4.将蘸取菌样的穿刺接种针（头部无环）垂直插入固体培养基内，再原路拔出 对微好氧微生物采取穿刺培养则更适宜于它们生长，见图3.3.1(4)。玻管中加入固体培养基，灭菌后穿刺接种，然后塞上橡皮塞。越靠近培养基深处越缺氧，生长的菌厌氧程度越高。 对厌氧菌培养必需创造更严格的无氧环境。一种方法是在斜面接种后，将培养管棉塞上部截去或用火点着烧掉，用玻璃棒将管内部分的棉花压至离培养基1cm处，棉塞上方再压入一含水的脱脂棉，加入1:1比例混合的焦性没食子酸和碳酸钠粉末，立即加上橡胶塞。焦性没食子酸和碳酸钠在有水的情况下，缓慢作用，吸收氧气，放出CO2，造成无氧环境，见图3.3.3。也可将厌氧微生物固体培养物放在真空干燥器内，用泵排出其中的空气，并可进一步向其中充入氮气或95%氮气和5%二氧化碳的混合气体，再放置一定的温度环境中培养。   (a) (b) 图3.3.2. 平板划线培养方法 平板划线的过程：1.用接种针蘸取菌样；2. 在平板固体培养基表面划线；(b) 平板划线培养结果：在划线的起点，菌落相互重叠，在划线的末端，逐渐出现单菌落   图3.3.3 一种厌氧菌的斜面培养法 图.3.3.4Hungate滚管技术 中的厌氧试管的剖面图 针对厌氧微生物有人采用一些专用的培养装置，如： （1）Hungate滚管技术 主要原理是利用除氧铜柱来制备高纯氮，并用高纯氮驱除小环境中的空气，使培养基的配制、分装、灭菌和储存，以及菌种的接种、培养、观察、分离、移种和保藏等过程始终处于高度无氧的条件下，从而保证了厌氧菌的存活。用这种方法制备的培养基称为预还原无氧灭菌培养基。将菌接种到融化的培养基中，然后将特制的试管（见图3.3.4）用丁基橡胶塞严密塞住后平放，置冰浴中均匀滚动，使含菌的培养基布满在试管的内表面，犹如好氧菌在培养基平板表面一样，最后长出许多单菌落。 （2）厌氧培养皿 用于厌氧培养的培养皿有几种设计：有的利用皿盖创造了一个狭窄的空间，加上含有还原剂的培养基，达到无氧的培养目的（例如Brewer皿，见图3.3.4）；有的利用皿底有两个相互隔开的空间，其中一个放焦性没食子酸，另一个放NaOH溶液，待在皿盖平板上接入待培养的厌氧菌后，立即密闭。摇动使焦性没食子酸和NaOH溶液接触，发生吸氧反应，从而造成无氧环境（例如Spray皿和Bray皿，见图3.3.5）。  图3.3.5 三钟厌氧培养皿 （3）厌氧罐 厌氧罐的类型很多，一般都有一个用聚碳酸酯制成的透明罐体，上面是一个用螺旋夹紧密夹住的罐盖，盖内的中央有不锈钢丝织成的网袋，内放钯催化剂。罐内放有含美蓝的氧化还原指示剂，见图3.3.6。使用时，先装入待培养物，然后密闭罐盖，接着抽真空→灌氮→抽真空→灌氮→抽真空→灌混合气体（N2:CO2:H2 = 80:10:10V/V)。罐内少量剩余氧在钯催化剂作用下，可被灌入的混合气体中的H2还原成水，从而造成很高的无氧状态。真空度低于266.64Pa(20mmHg)时，指示剂美蓝被还原成无色。罐内一般可以放10只培养皿或其它液体培养物。也可以在罐内放入商品化的“Gaspak”产气袋，将袋口剪开一只角，加入适量的水后，即会自动放出H2和CO2。  图3.3.6 厌氧罐的一般构造 图3.3.7 手套厌氧箱的一般构造 (4) 厌氧手套箱（anaerobic glove box）手套箱是由透明的材料制成的箱式结构，箱体结构严密，可以通过与箱壁相连的手套进行箱内的操作。箱内充满85% 氮气、5%二氧化碳和10%的氢气，同时，还用钯催化剂清除氧气，使箱内保持严格的无氧状态。物料可以通过特殊的交换室进出，见图3.3.7。 3.3.1.2 生产中常见的固体培养 在生产实践中，好氧真菌的固体培养方法都是将接种后的固体基质薄薄地摊铺在容器的表面，这样，既可使菌体获得充足的氧气，又可以将生长过程中产生的热量及时释放，这就是传统的曲法培养的基本原理。 固体培养使用的基本培养基原料是小麦麸皮。将麸皮和水混合，必要时添加一些辅助的营养物和缓冲剂，灭菌后待冷却到合适温度便可接种。疏松的麸皮培养基的多孔结构便于空气透入，为好氧微生物提供生长必需的氧气。这时，固体培养基中的含水量控制在40%~80%之间（典型的液体培养基含水量在95%以上），细菌和酵母菌将无法忍受如此低水含量的环境，所以，固体培养被细菌或酵母菌污染的可能性大大降低。这也是生产实践中固体培养主要用于霉菌进行食品酿造及其酶制剂生产的原因。 进行固体培养的设备有较浅的曲盘、转鼓和通风曲槽等。接种时用的种子可以通过逐级扩大培养获得。将接好种的麸皮培养基在曲盘里铺成薄层，就可放在有温度控制的培养室（曲房）内培养。目前，一些酶制剂的工业生产仍采用此方法。也可以将接种后的培养基放到缓慢转动的转鼓内培养。图3.3.8 是以米为原料，米曲霉（ Asperigillus oryzae）固体培养生产日本酒曲的转鼓装置示意图。清洗、蒸煮、接种、固体翻松、水的喷淋、冷却、空气循环、过滤和排气等所有操作都在该装置上完成。  图3.3.8 转鼓式自动固体培养装置示意图 通风曲槽的机械化程度和生产效率比较高。它一般是一个面积10m2左右的曲槽，曲槽上有曲架和适当材料编织成的筛板，筛板上可摊一层较厚（30cm左右）的曲料，曲架下部不断通以低温、潮湿的新鲜过滤空气，进行半无菌的固体培养，见图3.3.9。酱油酿造和酒精发酵等一般都能用此方法。 生产实践中对厌氧菌固体培养的例子还不多见。在我国传统的白酒生产中，一向用大型深层地窖进行堆积式的固体发酵。虽然其中的酵母菌为兼性厌氧菌，但也可以算作厌氧固体发酵的例子。 总之，固体培养的设备简单，生产成本低，但是pH、溶解氧和温度等不易控制，耗费劳动力较多，占地面积大，容易污染，生产规模难以扩大。  图3.3.9 通风曲槽结构模式图 1.曲床；2.风道；3.鼓风机；4.电动机；5.入风口；6.天窗；7.帘子；8.曲料；9. 曲槽罩 3.3.2液体培养(liquid-state culture） 液体培养就是将微生物接种到液体培养基中进行培养。由于大多数发酵微生物是好氧性的，而且微生物只能利用溶解氧，所以，如何保证在培养液中有较高的溶解氧浓度至关重要。常温（20℃）常压下达到平衡时，氧在水中的溶解度仅为6.2ml/L(0.28mmol)。这些氧只能保证氧化8.3mg(0.046mmol）葡萄糖，仅相当于培养基中常用葡萄糖浓度的1%。除葡萄糖外，培养基中的无机或有机养分一般都可保证微生物使用几小时至数天。所以，对好氧菌而言，生长的限制因子几乎总是氧。在好氧微生物静止培养中常常将培养液装成浅层进行浅层液体培养（shallow liquid culture），使氧不至于成为限制因子。但大多数液体培养都是采用更先进的深层培养（submerged culture)。 液体培养中，一般可通过增加液体与氧的接触面积或提高氧分压来提高溶氧速率。具体可采取以下措施： （1）浅层液体培养。 （2）利用摇床作三角瓶的振荡培养。 （3）从深层液体培养器底部通入加压空气，并用气体分布器使空气以小气泡形式均匀喷出。 （4） 对培养液进行机械搅拌，并在培养器壁上设置挡扳，以降低气泡直径，增加相界面积。 （5）提高罐压。 3.3.2.1 实验室常见的液体培养 在实验室进行好氧菌液体培养的方法主要有四类。 (1) 试管液体培养 此法的通气效果一般较差，仅适用于培养兼性厌氧菌，以及进行微生物的各种生理生化试验。 (2) 浅层液体培养 在三角烧瓶中装入浅层培养液，其通气量与装液量、棉塞通气程度密切相关。通气量对微生物的生长速度和生长量有很大关系，该方法一般也仅适于兼性厌氧菌。 (3) 摇瓶培养（shaking flask culture） 将装有液体培养基的三角瓶（摇瓶），上盖8~12层纱布或用疏松的棉塞塞住以阻止空气中杂菌或杂质进入瓶内，而空气可以透过棉塞供微生物呼吸之用。为使菌体获得充足的氧，一般装液量为三角瓶的10%以下，如250ml三角瓶装10~20ml培养液。有时，为提高搅拌效果，增加通气量，也可在三角瓶内设置挡板或添加玻璃珠等。将摇瓶放在摇瓶机（摇床）上以一定速度保温振荡培养。摇床有旋转式和往复式二类。摇瓶培养不仅操作简便，而且可以将许多摇瓶（在大摇床上可多达上百个）同时在相同的温度和振荡速度等条件下进行培养试验。还采用适当的传感器可以随时监测微生物生长过程中的各种变化。摇瓶培养在实验室里被广泛用于微生物的生理生化试验、发酵和菌种筛选等，也常在发酵工业中用于种子培养。 (4) 台式发酵罐 实验室用的发酵罐体积一般为几升到几十升。商品发酵罐的种类很多。一般都有多种自动控制和记录装置。如配置有pH、溶解氧、温度和泡沫检测电极，有加热或冷却装置，有补料、消泡和pH调节用的酸或碱储罐及其自动记录装置，甚至计算机控制。因为它的结构与生产用的大型发酵罐接近，所以，它是实验室模拟生产实践的试验工具，见图3.3.10。 实验室中，用液体培养基进行厌氧菌培养时，一般采用加有机还原剂（如巯基乙醇、半胱氨酸、维生素C等）或无机还原剂（铁丝等）的深层液体培养基，其上方封以凡士林-石蜡层，以保证氧化还原电位Eh 0保持在-150mV~-420mV的范围内。如放在厌氧罐中培养，则效果更好。  图3.3.10 台式发酵罐 3.3.2.2 生产中常见的液体培养 液体培养生产效率高，适于机械化和自动化，所以，它是当前微生物发酵工业的主要生产方式。液体培养有静置培养和通气培养两种类型。静置培养适于厌氧菌发酵，如酒精、丙酮/丁醇、乳酸等发酵。通气发酵适于好氧菌发酵，如抗生素、氨基酸、核苷酸等发酵。 浅盘培养(shallow pan culture) 容器中盛装浅层液体静止培养，没有通气搅拌设备，全靠液体表面与空气接触进行氧气交换。这是最为原始的液体培养形式，劳动强度大，生产效率低，易污染。早期的青霉素和柠檬酸发酵曾采用过浅盘培养。当时生产一千克青霉素就需要100万个容积为一升的培养瓶。  图3.3.11 通用式发酵罐的构造及其运行原理 (2) 发酵罐深层培养 液体深层培养的主体设备是发酵罐。典型的发酵罐构造及其运转原理见图3.3.11。罐体为碳钢或不锈钢材料，圆筒形直立，扁球形的底和盖，高径比1: 2~2.5，有几组搅拌浆，沿罐壁有等周角分布的垂直挡板，培养过程产生的热量用夹套冷却，夹套内有螺旋形导流片以提高夹套内冷却水的动程度，增大传热系数。根据发酵产物和目标的不同，发酵罐容积有大有小，见表3.3.1。大型发酵罐的容积有50~500m3，常采用列管式换热器代替夹套进行冷却，这是因为罐体越大，单位体积培养液所具有的周壁面积越小，不能满足传热的需要。气升式发酵罐体积可以很大，最大的是英国ICI（帝国化学工业公司）的甲醇蛋白发酵罐，容积达到3000 m3，发酵时装液可达2100m3。从罐底部通入空气，巨大的气泡浮力使发酵液高速循环流动，内套管装有19层多孔挡板以提高空气利用率，罐内没有机械传动部分。 表3.3.1 各种发酵产物的发酵罐体积大小 发酵罐体积（升） 发酵产物  1~20，000 40~80,000 100~150,000 ~450 诊断用酶，分子生物学试剂 一些酶和抗生素 青霉素，氨基糖苷类抗生素，蛋白酶，淀粉酶，氨基酸 谷氨酸   发酵罐可以为微生物提供丰富而均匀的营养，良好的通气搅拌，适宜的温度和酸碱度，并能防止杂菌污染。为此，发酵罐配备有培养基配制系统、蒸汽灭菌系统、空气压缩过滤系统和补料系统。 液体深层培养是在青霉素等抗生素发酵中发展起来的技术。由于生产效率较高，易于控制，产品质量稳定，因而在发酵工业中被广泛应用。但是，深层培养耗费的动力较多，设备较为复杂，需要较大的投资。 大型发酵罐的发酵一般需分几级进行，使发酵的种子逐级扩大，以提高发酵罐的利用率和节约能源等。罐的级数一般是根据菌体繁殖速度以及发酵罐的容积而确定的。谷氨酸发酵生产多采用二级培养；而生长较慢的青霉素和链霉素生产菌种一般需要三级培养。图3.3.12是商品酵母菌的三级培养过程。在菌种室，酵母菌的斜面种子经摇瓶培养活化，在发酵车间，经过两级种子罐培养，再转移到下一级发酵罐中完成发酵。 迄今为止，能作大规模液体培养的厌氧菌仅局限于丙酮/丁醇发酵一种。由于丙酮丁醇梭菌是严格厌氧菌，不需要通气和搅拌装置，工艺简单，便于扩大发酵罐体积，并有利于实行连续培养技术。  图3.3.12 商品酵母菌的三级培养过程 3.3.3 连续培养 从微生物群体生长规律的分析可知，分批培养中，营养物不断消耗，代谢产物不断积累，微生物所处的环境不断在改变，造成微生物生长不能长久地处于对数生长期。若改变培养方法，在对数生长期的培养容器中不断添加新鲜的培养基，同时不断放出代谢物，使微生物所需的营养及时得到补充，有害的代谢产物又能够及时排除，菌体的生长不受影响地始终处于对数生长期，这就是连续培养。要达到连续培养的目的，就要在分批培养的基础上，引入有效的营养物补充和代谢物排出的控制装置。连续培养的控制方式主要有两类：恒化培养(chemostatic culture)和恒浊培养(turbidostatic culture)。 3.3.3.1恒化培养 保持培养液的流速不变，使培养罐内的营养物质浓度基本恒定，并使微生物始终在低于其最高生长速度的条件下进行繁殖，这种连续培养方式称为恒化培养。所涉及的培养和控制装置称为恒化器（chemostat），见图3.3.13(a)。 营养物质浓度对微生物的生长有很大影响。但当营养物浓度高到一定程度后，就不再影响微生物的生长速度，只有在营养物浓度低时才会影响生长速度，而且在一定范围内，生长速度与营养物浓度成正相关，营养物浓度越高，生长速度越快，见图3.3.14。恒化培养中，必须将某种必需的营养物质限制在较低的浓度，使其成为限制性底物，而其它的营养物质均需过量，使微生物的生长速度主要决定于生长限制因子。恒化培养中，限制性底物的供给速率与微生物的消耗速率达到平衡，使恒化器中的化学组成能够保持稳定。恒化器培养既可以获得一定生长速度的均一菌体，又可获得虽低于最高菌体产量，却能保持稳定菌体浓度的菌液。 能作为恒化连续培养的生长限制因子的物质有很多，这些物质必须是微生物生长所必需的，在一定浓度范围内能决定该微生物的生长速度。常用的生长限制因子有作为氮源的氨或氨基酸，作为碳源的葡萄糖、麦芽糖、乳酸，以及生长因子和无机盐等。 用不同浓度的生长限制因子进行恒化培养，可以获得不同生长速度的培养物。恒化培养主要用于实验室中与生长速度有关的理论研究。另外，在遗传学研究中，利用它作长时间的培养，以便从中分离出不同的变种。在生理学研究中，也利用它来观察微生物在不同生活条件下的生理变化。恒化培养也是研究自然条件下微生物的生态体系的实验模型，因为自然条件下的微生物一般处于低营养浓度的环境中。  图3.3.13 实验室连续培养系统示意图 恒化培养系统；(b)恒浊培养系统；1.无菌培养基储存容器；2.流速控制阀； 3.培养室；4.排出管；5.光源；6.光电池；7.流出液  图3.3.14营养物浓度对细菌生长速度的影响 3.3.3.2恒浊培养 根据体系中微生物的生长密度，不断调整流加培养液的流速，以取得菌体密度和生长速度恒定的微生物细胞的培养方式称为恒浊培养。所涉及的培养和控制装置称为恒浊器（turbidostat），见图3.3.13(b)。恒浊器中由浊度计检测培养室中的菌液密度，借光电效应产生的电流信号变化来自动调节培养液流进和培养物流出的速度。当培养液的流速低于微生物的生长速度时，即培养室菌液密度超过预定值，就加大培养液的流速，使浊度下降。反之亦然。以此来维持培养物的浊度，使之始终处于同一水平。这类培养器的工作精度是由浊度测量和控制的灵敏度决定的。 恒浊培养中，微生物生长速度主要受流速控制，但也与菌种、培养基成分和其它培养条件有关。恒浊培养可以不断提供具有一定生理状态的、始终以最高生长速度生长的微生物细胞。并可在一定范围内控制不同的菌液密度。在生产实践中，为了获得大量菌体或与菌体生长同步产生的初级代谢产物都可以采用恒浊培养。恒浊培养与恒化培养的比较见表3.3.2。 表3.3.2 恒化培养与恒浊培养的比较 装置 控制对象 生长限制因子 培养液流速 生长速度 产物 应用范围  恒化器 培养液流速 有 恒定 低于最高生长速度 不同生长速度的菌体 实验室为主  恒浊器 菌液密度 无 不恒定 最高生长速度 大量菌体或与菌体生长平行的代谢产物 生产为主   3.3.3.3 多级连续培养 连续培养也可以分级进行。以获取菌体或与菌体生长同步产生的代谢产物为目标时，只要用单级连续培养器就可以满足研究或生产的需要。若要获取与菌体生长不同步的次级代谢产物，就应该根据菌体和产物的产生规律，设计与其相适应的多级连续培养装置，第一级发酵罐以培养菌体为主，后几级发酵罐则以大量生产代谢产物为主。 我国采用的丙酮/丁醇两级连续发酵法就是一个成功的例子。丙酮/丁醇梭菌的生长可以分为两个阶段，前期较短，以产菌体为主，生长温度以37℃为宜；后期较长，以产丙酮/丁醇为主，温度以33℃为宜。针对该菌特点，第一级发酵罐保持37℃，pH4.3，培养液的稀释率为 0.125/小时。第二级发酵罐为33℃，pH4.3，稀释率为0.04/小时。这样的生产流程可连续运转一年以上，并达到比单级连续发酵高得多的生产效率。 表3.3.3 包埋固定化细胞的例子 细胞 载体 应用  S. cerevisiae E. aerogenes E. coli Trichoderma reesei Z. mobilis Acetobacter sp. Morinda citrifolia Canada tropicallis Nocardia rhodocrous E. coli Rhodotorula minuta (-角叉（菜）胶或聚丙烯酰胺 (-角叉（菜）胶 (-角叉（菜）胶 (-角叉（菜）胶 海藻酸钙 海藻酸钙 海藻酸钙 海藻酸钙 聚氨基甲酸乙酯 聚氨基甲酸乙酯 将葡萄糖转化成乙醇 将葡萄糖转化成2,3丁二醇 将富马酸转化成天冬氨酸 纤维素生产 将葡萄糖转化成乙醇 将葡萄糖转化成葡萄糖酸 形成蒽醌 苯酚降解 睾丸激素转化 青霉素G转化成6-APA 将琥珀酸酯转化成醇   3.3.3.4 固定化细胞连续培养 近年来，细胞固定化技术在微生物培养中的应用研究非常活跃，这给连续培养技术赋予了新的形式。固定化细胞培养与游离细胞培养相比 ，有以下一些优势： （1）固定化可提供较高的细胞密度。 （2）固定化减少了细胞的流失，使细胞可以反复利用。 （3）固定化可以提供对细胞有利的微环境。 （4）某些情况下，固定化可以使菌株的遗传性状稳定。 （5）可以保护某些细胞免受剪切损伤。 （6）简化了下游的细胞分离步骤。 细胞固定化就是通过包埋法、微胶囊化、吸附法等手段，将微生物细胞限制在载体的内部或表面。目前，最常用的是利用聚合物进行细胞的包埋。包埋法不会损伤细胞，但它容易造成严重的营养物和代谢产物的传质量阻力，因此应尽量采用多孔材料，形成的颗粒要尽可能小。包埋材料有琼脂、海藻酸盐、k-角叉（菜）胶、聚丙烯酰胺、壳聚糖、明胶和胶原等；微胶囊是由半透膜形成的中空球体，营养物和产物通过膜进出，因为细胞悬浮在微囊中，所以，球内扩散限制较低。许多材料可以用于做微胶囊，如尼龙、火棉胶、聚苯乙烯、丙烯酸盐、硫酸纤维素和聚脲等，见表3.3.3。 最简单的包裹方法是采用中空纤维反应器，将细胞接种到纤维外侧，营养液在纤维管内部流动，通过管壁扩散到细胞侧，代谢产物可以通过管壁扩散到营养液流动相。载体表面吸附法的应用也较为普遍，细胞吸附量及其牢固程度主要与细胞和载体表面性质有关。微孔载体材料可以获得较高的细胞吸附量。丝状菌体除了可以通过静电、氢键和范德华力等与载体相互吸引外，还能靠菌丝紧紧缠绕在载体上，较适合采用吸附法进行固定。细胞吸附的材料主要有多孔玻璃、多孔硅石、氧化铝、陶瓷、明胶、壳聚糖、活性炭、木片、聚丙烯、离子交换树脂（DEAE-Sephadex,CMC-）和Sepharose等。细胞表面固定也可以通过化学共价偶联，见表3.3.4。由于细胞和载体表面的反应基团较难相配，偶联试剂对细胞有较大毒性，所以，共价固定化方法较少使用于活细胞。 表3.3.4细胞表面固定的例子 细胞 载体 应用  乳酸杆菌（Lactobacillus sp) (Clostridium acetobutylicum) (Streptomyces) E.coli (B.subtillis) (Solanum aviculare) 明胶（吸附） 离子交换树脂（吸附） Sephadex（吸附） 氧化钛（共价固定） 琼脂糖（共价固定） 聚苯氧（共价固定） 将葡萄糖转化成乳酸 将葡萄糖转化成醋酸和丁醇 链霉素 形成糖碱类固醇（steroid glycoalkaloids)    图3.3.15 填充床和流化床固定化细胞反应器示意图 分批培养时，只按实线运行；连续培养时，按实线和虚线运行 因为固定化载体常常是易碎的，以及固定的细胞容易脱落等原因，固定化细胞培养器（或称反应器）中的剪切力也不宜过高，一般采用填充柱、流动床或气升式反应器。机械搅拌式反应器只适用于载体牢固、不易脱落的固定化细胞。通常是将固定化细胞装在反应器内，一端流入培养基，另一端放出发酵液，而固定化微生物细胞始终停留在反应器内。固定化细胞反应器可以进行连续培养，也可以是分批培养，见图3.3.14。这里指的连续培养并不一定是严格意义上的恒浊培养或恒化培养，只是指培养可以不间断地连续进行。 虽然固定化细胞有许多优点，但是也存在着一些问题有待于进一步研究解决，主要是：固定化细胞的成本还比较高，固定化过程中及固定化细胞使用时的污染控制比较困难，细胞固定到固体载体中后，增加了营养物质、氧和产物的传质阻力，特别是好氧发酵时的氧传递问题比较难以解决，固定化细胞在长期使用中的遗传稳定性也将成为问题，此外，固定化细胞培养的另一个缺陷是它一般只能用于细胞分泌型产物的发酵。因此，目前固定化细胞还处于实验室研究阶段，真正在工业发酵中的应用还有待于进一步的研究和开发。 3.3.3.5 连续培养的局限性 与分批培养相比，连续培养最大的优越性是培养可连续运行，生产周期缩短，能提高设备利用率和生产效率。另外，它还便于自动化控制，产品的质量稳定。但是，连续培养也有一些致命的缺点。（1）连续培养是数百、数千小时长时间的连续操作，它较易受杂菌的污染，即使初始染菌数量极小，也可能引起严重的后果。另外，连续发酵的设备较复杂，也容易导致染菌。而一旦染菌，造成的后果比批式培养会更严重。特别是连续培养中常见的多级（多罐）发酵，一个生产罐染菌，所有的罐都要停止运作，必须灭菌后再启动。（2）连续培养的收率和产物浓度相对批式培养要低，这将不利于下游的提取操作。（3）连续培养的营养物质利用率较低，会增加生产成本。（4）连续培养必须与整个作业的其它工序连贯进行，它对设备的要求较高，需要复杂的检测和控制系统。（5）连续培养更易受菌种退化的影响，因为退化菌往往比生产菌更具生长优势，少数退化菌经较长时间的培养，会逐渐占据优势，从而造成减产。正是由于连续培养存在上述问题，在工业生产上的应用还不多见，只局限于酒精发酵、单细胞蛋白培养及丙酮/丁醇发酵等少数几个工业发酵产品。 3.3.4 补料分批培养（Fed-batch culture) 连续培养的局限性限制了它在实际生产中的广泛运用。在生产实践中，完全封闭式的分批培养或纯粹的连续培养较为少见。更多见的是两者的折衷形式 ── 补料分批培养，又称为半连续培养（semi-continuous culture)或流加培养。 补料分批培养是根据菌株生长和初始培养基的特点，在分批培养的某些阶段适当补加培养基，使菌体或其代谢产物的生产时间延长。补料分批培养的优点体现在如下几个方面： 可以消除底物抑制。某些微生物的生长受到高浓度底物的抑制，如果采用间歇培养，将限制初始底物浓度，这样，也就限制了菌体密度和产物浓度的提高。采用补料分批培养可以从较低的底物浓度开始培养，就不存在底物抑制的问题，随后通过不断的流加限制性底物，使菌体能够不断生长，代谢产物也能不断地积累。对于存在葡萄糖效应的体系，通过补料操作，可以避免葡萄糖效应对微生物生长和产物积累的影响。 可以达到高密度细胞培养。由于补料分批培养能不断地向发酵罐补偿限制性底物，微生物始终能有充分的营养繁殖，菌体密度就可以不断增加，通过选择适当的补料策略并配合氧传递条件的改进，文献报道的最高细胞密度达到了150克干细胞/升。对于以细胞本身或鲍内产物作为目标产物的发酵过程，高密度培养显然可以大大提高生产效率。 延长次级代谢产物的生产时间。次级代谢产物的合成往往与细胞生长速率无关，常常在生长到达稳定阶段时才开始合成，因此与稳定阶段的细胞密度和延续时间直接相关。一般的间歇培养中稳定阶段的时间比较短，因为营养物质已经消耗而只能维持很短的时间就会进入细胞死亡阶段，使次级代谢产物的生产时间很短，从而影响了产量。通过补料就可以给微生物生长提供所需要的营养，延长稳定期的时间，因此能达到较高的生产水平。 稀释有毒代谢产物。微生物在代谢过程中，都会分泌出一些有毒的代谢产物，对微生物本身的生长产生影响。通过流加就能够稀释有毒的代谢产物，减轻毒害作用。对于目标产物抑制的情况，流加操作也能起到稀释产物，降低抑制作用的效果。 补料分批培养的操作时间有限，因此在染菌控制方面不象连续培养那样严格，菌种的遗传不稳定性问题的影响也与间歇培养类似，操作和控制都比较简单。 正是由于补料分批培养具有上述优点，因此在发酵工业中得到了广泛的应用。在需要细胞高密度培养、生产次级代谢产物等发酵工业中普遍采用了补料分批培养技术，为提高发酵工业的生产水平作出了贡献。例如，在抗生素发酵生产中常采用这种培养方式。在青霉素发酵中，前期是菌体生长阶段，后期是产物形成阶段。前期希望菌体能以最大比生长速率快速生长，后期则能限制生长和控制氧的消耗，使青霉素快速合成。在前期过多的葡萄糖将导致有机酸积累和溶解氧下降，葡萄糖不足将使有机氮源中的碳被迅速利用而导致pH上升。因此，可以用pH或溶氧为控制参数进行前期的葡萄糖补加，在后期一般采用控制溶氧和补加葡萄糖的操作方式。 通过补料分批培养可以获得高密度的培养物。例如用分批培养法培养大肠杆菌，其菌体浓度一般不超过40g/L；当采用中间补料进行培养时，维持溶氧浓度2~3ppm，在培养过程中不断加入葡萄糖溶液或固体葡萄糖，同时增加供氧量，包括导入与纯氧混合的空气甚至纯氧，11小时后，其菌体浓度可达125g/L。 表3.3.5 例举了一些代表性的补料分批培养过程。 表3.3.5 补料分批培养的实例 产物 补料物 产物 补料物  酵母菌 单细胞蛋白 谷氨酸 赖氨酸 柠檬酸 乳酸 葡萄糖酸 乙醇 甘油 丙酮和丁醇 维生素B2 维生素B12 麦芽汁、氮、磷、镁 甲醇 氨水 乙醇、尿素，葡萄糖 铵盐、糖 葡萄糖 碳酸钙、氢氧化钙 葡萄糖 糖、碳酸钙 麦芽汁 糖 葡萄糖、拟维生素B12 蛋白酶 纤维素酶 葡萄糖苷酶 淀粉酶 青霉素酰化酶 青霉素 新生霉素 灰黄霉素 利福霉素 赤霉素 四环素 链霉素 葡萄糖、酪蛋白胨 葡萄糖 淀粉 葡萄糖 苯乙酸铵 葡萄糖、氨水、苯乙酸 各种碳源和氮源 碳水化合物 葡萄糖、脂肪酸 葡萄糖 葡萄糖 葡萄糖和氨水   广义上讲，微生物培养中补充酸或碱以调节发酵液pH值的过程也属于补料分批培养。 3.3.5 混菌培养（multiple strain culture，mixed culture） 大规模的微生物培养基本上都是采用纯种（单菌）培养，需要严格地防止其它微生物的侵入，以保证产量和产品的纯度。而在自然生态环境中，各种生物都是混居的。有时，它们各自的代谢活动具有互补性，并且，不会互相抑制生长，表现出互生关系（symbiosis）。如果能够在工业发酵中能够将两种或更多种具有互补性质的菌种进行混合培养，有时也能获得良好的效果。混菌培养的一个典型例子是将苯丙氨酸营养缺陷型的乳酸杆菌和叶酸营养缺陷型的链球菌混合培养，它们就能相互交换生长因子共同生长，而将它们分开进行纯培养，它们的生长都将受到抑制。几乎所有的传统食品发酵都是利用天然微生物的混菌培养，一些典型的例子包括：奶酪的制作是在新鲜的消毒牛奶中接入乳酸链球菌和乳酸杆菌，发酵产生的乳酸使蛋白发生凝固，形成蛋白沉淀块，细菌或一些霉菌会使蛋白块进一步老化。参与奶酪制作的霉菌有Penicillum camemberti和Penicillum roqueforti，另外还要接入Brevibacterium linens, Propionibacterium shermanii, Leuconostos sp.和 Streptococcus diacetilactis等菌株以增加其口味和芳香。传统的葡萄酒酿造是由一组酵母菌共同完成的。在发酵初期，酒精敏感菌占据优势，它们包括Kloekera apiculata, Hanseniaspora quille mondii和Candida pulcherrina等，然后是Saccharomyces rosei、S.veronae和S.cerevisiae Var. Ellipsoideus等酵母起作用。当酒精含量升至10%以上时，S. serevisiae Var.ellipsoideus, S.oviformis, S. chevaleiri 和S.italicus等酵母将占据优势。 乳酸菌能够与酵母一起用于威士忌的发酵生产，一方面，乳酸杆菌混入酵母菌中可以降低体系的pH，减少染菌的可能性，另一方面，乳酸杆菌还能增加威士忌的口味和芳香。世界各国用各种方法制备的酸菜、发酵饮料及其它发酵食品都是混菌发酵的产品。为了提高这类发酵产品的质量并对质量能够进行控制，研究混菌发酵的微生物并人为地控制混菌培养中各种微生物之间的比例是非常重要的。 典型的废水生物处理也是采用混菌培养。如活性污泥（activated sludge)就是由许多细菌、原生动物和其它微生物群体与污水中悬浮有机物、胶状物和吸附物质一起构成的凝絮团。利用纤维素酶生产菌、产酸菌和产甲烷菌混合培养可以厌氧消化纤维素质的废水。土豆加工的淀粉质废水可以利用Endomycopsis fibuligera产生的淀粉酶水解淀粉，产朊假丝酵母（candida utilis）则利用淀粉水解物大量生长，从而使产朊假丝酵母的SCP生产与废水处理同步进行。 有人研究了用固定化的混合菌种将淀粉原料转化成乙醇。他们用海藻酸钠包埋黑曲霉（Asperigillus niger）和运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis），形成固定化细胞小球。黑曲霉好氧，故长在小球表层，运动发酵单胞菌厌氧，生长在小球中间。当淀粉液流过固定化细胞反应器时，表层的黑曲霉将淀粉分解成葡萄糖并进入小球内层，运动发酵单胞菌随即将葡萄糖转化成乙醇。 某些假单胞菌能将甲烷氧化成甲醇，但是，假单胞菌会被终产物甲醇抑制，若在培养基中同时接入甲醇利用菌Hyphomicrobium，就能消除产物抑制现象，其机理见图3.3.16。 反馈抑制 假单胞菌 Hyphomicrobium CH4 ((((( CH3OH ((((( CO2 + H2O 图3.3.16利用混合微生物使甲烷降解的机理示意图 以上实例中，许多发酵过程是纯菌株无法实现的，只有混合菌株才能完成，所以，采用混菌培养有可能获得新型的或优质的发酵产品。混菌培养有时比单菌培养反应更快、更有效、更简便。但是，混菌培养的反应机制较复杂，随着对单菌培养技术和微生物互生现象研究的深入，混菌培养将可能成为一个新的发展方向。 3.4影响微生物生长的环境因素 微生物与所处的环境之间具有复杂的相互影响和相互作用，一方面，微生物需要从环境中摄入生长和生存所必须的营养物质，只能在一定的环境条件（如温度，湿度及pH等）下才能够生存，而环境条件的变化会引起微生物的形态、生理、生长和繁殖特征发生变化，另一方面，微生物也向环境中排泄出各种代谢产物，抵抗和适应环境变化，甚至影响和改变环境。本节主要探讨非生物环境因子，即物理和化学因子对微生物的影响，以及在微生物学研究和应用中如何利用这些影响因素。 环境因子对微生物的影响主要有三种情况： （1）有利于微生物进行正常代谢。 （2）不利于微生物正常代谢，微生物生长受到抑制或被迫改变其原有的一些特征。 （3）恶劣的环境可造成微生物死亡或发生遗传变异。 3.4.1物理因子对微生物生长的影响 这里主要讨论温度、水、表面张力和辐射等物理因子对微生物生长的影响。 3.4.1.1温度 温度主要通过影响微生物细胞膜的流动性和生物大分子的活性来影响微生物的生命活动。一方面，随着温度的升高，细胞内酶反应速度加快，代谢和生长也相应的加快，另一方面，随着温度进一步增高，生物活性物质（如蛋白质、核酸等）发生变性，细胞功能下降，甚至死亡。所以，每种微生物都有个最适生长温度。微生物作为整体可以在较广的温度范围中生长，已知的所有微生物可以在-10~95℃范围内生长。极端下限为-30℃，极端上限为105~300℃。但是对于特定的某一种微生物，它只能在一定的温度范围内正常生长，温度的下限和上限分别称为该微生物的最低和最高生长温度。当低于或高于最低或最高生长温度时，微生物就停止生长，甚至死亡，见图3.4.1。  图3.4.1 温度对生长速度的影响 表3.4.1 同一微生物不同生理活动的最适温度 菌名 最适生长温度（℃） 最适发酵温度（℃） 积累产物的最适温度（℃）  灰色链霉菌（Streptomyces griseus)(链霉素生产菌） 产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)(青霉素生产菌) 北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)(谷氨酸生产菌） 嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus） 乳酸链球菌（Streptococcus lactis） 丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum） 37 30 32 37 34 37 28 25 33~35 47 40 33 ( 20 ( 37 产细胞25~30 产乳酸30 (   需要指出的是微生物不同的生理活动需要在不同的温度条件下进行，所以，生长速率、发酵速度、代谢产物累积速度的最适温度往往不在同一水平的温度下。例如乳酸链球菌在34℃时繁殖速度最快，25~30℃时细胞产量最高，40℃时发酵速度最快，30℃乳酸产量最高。其它微生物也有类似特点，见表3.4.1。 最适生长温度是指某微生物群体生长繁殖速度最快的温度，但它不等于发酵的最适温度，也不等于积累代谢产物的最适温度，更不等于积累某一代谢产物的最适温度。在较高温度下，细胞分裂虽然较快，但维持时间不长，容易老化。相反，在较低温度下，细胞分裂虽较慢，但维持时间较长，结果细胞的总产量反而较高。同样，发酵速度与代谢产物积累量之间也有类似的关系。所以，研究不同微生物在生长或积累代谢产物阶段时不同的最适温度，对提高发酵生产的效率具有十分重要的意义。在青霉素发酵生产中，采用各阶段变温培养比在25℃下恒温培养的产量高14%以上，具体做法是：接种后在30℃下培养5小时，将温度降至25℃培养35小时，再下降至20℃培养85小时，最后又升温至25℃培养40小时后放罐。另外，不同微生物产生同一代谢产物的最适温度也不相同，要根据不同菌种的特性确定。 如果环境温度低于最适生长温度，微生物的代谢活动就下降。环境温度低于最低生长温度时，微生物生长代谢将停止；一旦环境温度回升，微生物还能够复活。利用低温对微生物生长代谢活动的影响已形成了许多微生物菌种的低温保存方法。但是，冰点以下的低温往往会造成微生物死亡。这主要是因为温度降低，细胞内水分转化为冰的晶体，冰晶的形成不但会引起细胞脱水，而且会对细胞结构，尤其是细胞膜造成机械损伤，使细胞发生破裂。 在冷藏微生物菌种时，应采用一些措施预防细胞损伤，如加入甘油、血清或脱脂牛奶等保护剂，降低脱水的有害作用，防止冰晶过大，以保护细胞膜结构。设计合理的降温曲线可以减小冰晶体对细胞膜的机械损伤。 实验室中常利用冰晶体会损伤微生物细胞的特性来进行细胞的破碎。细菌等微生物细胞经历三次以上的反复冻融过程可达到较好的破壁效果。 如果环境温度超过了最高生长温度，微生物就会死亡。使微生物死亡的最低温度界限称为致死温度。致死温度与处理时间有关。一般是指能在10分钟完全杀死微生物的最低温度。测定微生物致死温度一般在生理盐水中进行，以减少有机物质的干扰。不同微生物的致死温度是不同的，见表3.4.2。 表3.4.2 一些细菌的致死温度 菌名 致死温度（℃） 致死时间（分）  大豆叶斑病假单胞菌 48~49 10  胡萝卜软腐欧文氏菌 48~51 10  维氏硝化杆菌 50 5  白喉棒杆菌 50 10  锦葵黄单胞菌 50-51 10  甘兰黑腐病黄单胞菌 51 10  根瘤土壤杆菌 53 10  普通变形菌 55 60  粘质沙雷氏杆菌 55 60  肺炎链球菌 56 5-7  伤寒沙门氏杆菌 58 30  大肠杆菌 60 10  嗜热乳杆菌 71 30   多数细菌、酵母菌、霉菌的营养细胞和病毒，在50~65℃下10分钟就会死亡；有的更敏感，如梅毒密螺旋体在43℃下10分钟即死亡。另一些微生物抗热性很强，嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）是目前所知抗热性较强的微生物之一，营养细胞可在80℃下生长，其芽孢在120℃下12分钟才死亡。其它细菌芽孢的抗热性也很强，见表3.4.3。 表3.4.3 几种各种细菌芽孢的抗热性 细菌种类 湿热灭菌温度（℃） 杀菌所需时间（分）  蜡状芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌 炭疽芽孢杆菌 肉毒梭状芽孢杆菌 嗜热脂肪芽孢杆菌 100 100 105 120~121 120~121 6 6~17 5~10 10 12   少数动物病毒也具较强的抗热性，如脊髓灰质炎病毒在75℃30分钟才死亡。噬菌体要比宿主细胞的抗热性强，一般在65~80℃才失活。通常可先用60℃处理15~20分钟使宿主死亡而分离得到噬菌体。放线菌和霉菌的孢子比营养细胞的抗热性强，76~80℃10分钟才会死亡。 表3.4.4 微生物的生长温度类型 微生物类型 生长温度范围（℃） 分布区域   最低 最适 最高   嗜冷微生物 专性嗜冷型 -12 5~15 15~20 地球两极   兼性嗜冷型 -5~0 10~20 25~30 海洋、冷泉、冷藏食品  嗜温微生物 室温型 10~20 20~35 40~45 腐生环境   体温型 10~20 35~40 40~45 寄生环境  嗜热微生物 25~45 50~60 70~95 温泉、堆肥、土壤   高温对微生物的致死作用主要是它引起菌体蛋白和核酸发生不可逆变性，也可能是它破坏了细胞的其它组成，或者可能细胞膜被溶解而形成小孔，使细胞内含物泄漏而引起死亡。高温对微生物的致死作用已广泛用于灭菌和消毒。 根据最适生长温度不同，可将微生物分为三大类：嗜冷微生物(psychrophile)、嗜温微生物(mesophile)和嗜热微生物(thermophile)，见表3.4.4。温度对三类微生物生长速度的影响见图3.4.2 。  图3.4.2 温度对典型嗜冷微生物、嗜温微生物和嗜热微生物生长的影响 (1) 嗜冷微生物，或称低温微生物 能在0℃以下生长的微生物称为嗜冷微生物。它们分布在地球两极地区的水域和土壤中，那里大部分地区几乎终年冰冻，但即使在其微小的液态水间隙中也有微生物存在。它们有的分布在平均温度5℃的海洋中，有的在只有1~2℃的海洋深处生存，有的分布在冷泉。冷藏食品腐败往往是由这类微生物引起的。 嗜冷微生物可分为专性嗜冷型和兼性嗜冷型。专性嗜冷菌的最适温度在15℃左右或者更低，最高生长温度约20℃，可在0℃以下甚至-12℃的环境中生长。它们分布在常冷的环境中，即使短时的受热或室温条件，都会使其死亡。兼性嗜冷菌最适生长温度为20℃左右，而其最高生长温度可达35℃甚至更高，能在最低温度0℃时生长，但生长不良。细菌和霉菌中都有兼性嗜冷型。定居和生长在冷藏食品上的微生物都是兼性嗜冷型。 嗜冷微生物能在低温下生长的机理还不清楚。许多学者认为是由于它们的酶能在低温下有效地催化，而在30~40℃，这些酶反而会失活。此外，它们的膜中不饱和脂肪酸成分较多，所以在低温下仍能保持半流动状态，可以进行物质的传递。 (2) 嗜温微生物 它们的最适生长温度在25~37℃之间。自然界绝大多数微生物属于嗜温微生物。这类微生物最低生长温度约为10~20℃。它们可分为室温型和体温型。室温型为腐生或植物寄生；体温型为动物寄生。室温型适于20~25℃生长，如土壤微生物、植物病原微生物。体温型微生物多为人及温血动物的病原菌。它们的最适生长温度与其宿主体温相近，在35~40℃之间，它们生长的极限温度范围在10~45℃。人体寄生菌的最适生长温度为37℃左右。 (3) 嗜热微生物 这类微生物能在45~50℃以上温度的环境中生长，最适温度在50~60℃左右。它们在环境温度低于35~40℃时一般不能生长。它们常出现在温泉、堆肥和土壤中。分布在温泉中的细菌，有的能在近100℃的高温下生长。工业中常用的德氏乳酸杆菌就属于此类，其最适生长温度在45~50℃。 如果嗜热微生物在37℃下也能生长的称为兼性嗜热微生物；而在37℃下不能生长的称为专性嗜热微生物。其中，如果最高生长温度超过75℃， 称为高度嗜热微生物。如果最高生长温度在55~75℃之间， 称为中度嗜热微生物。 嗜热微生物的耐热性可能与以下一些特点有关： （1）菌体内酶蛋白有较强的抗热性。 （2）蛋白合成机构——核糖体有较强的抗热性。 （3）核酸具较高的热稳定性，如tRNA中G-C含量高，融解温度高。 （4）膜内含饱和脂肪酸或直链脂肪酸多，所以，膜具有较强的热稳定性。 （5）在较高温度促进下，能迅速合成生物大分子，弥补高温造成的损伤。 以上的推断是初步的，实际情况有时会有所不同。例如：Sulfolobus 和Acidianus能在65~96℃生长，最适生长温度90℃，它们的DNA中GC比例却都较低。Sulfolobus的GC比例为38%，Acidianus的GC比例只有31%。而在体外，当GC比例为30~40%时，在90℃DNA就会快速融解。显然，菌体内存在着更复杂的DNA保护机制。 微生物抗热性与菌龄也有关系。一般幼龄的比老龄的对热更敏感，例如菌龄为1.75小时和2.75小时的大肠杆菌在53℃加热5分钟，其菌数分别下降到万分之一和万分之五，而菌龄为62小时的菌数只下降到十二分之一。 一般而言，原核生物耐热能力比真核生物强，非光合生物比光合生物强，构造简单的比构造复杂的强。表3.4.5 列出了不同生物类型的最高生长温度。 表3.4.5 不同生物种类生长最高温度比较 生物种类 最高生长温度（℃）  动物 鱼及其它水生脊椎动物 昆虫 介形虫 植物 导管植物 苔藓类 真核微生物 原生动物 藻类 真菌 原核微生物 真细菌 蓝细菌 向光性细菌 化能异养细菌 古细菌 甲烷细菌 极端嗜热菌  38 45~50 49~50 45 50 56 55~60 60~62 70~73 70~73 >90 >100 >100   3.4.1.2水分 微生物的生命活动离不开水。前面已经述及微生物需在水活度((=0.63~0.99之间的环境中生长。 培养基中添加溶质会造成水活度下降，超过一定程度后，生长在低水活度的微生物就需要做更多的功来获取水，从而导致生长速率下降。不同菌种都有生长的最低((值。见表。因为各种溶质的解离和水合程度不同，所以，它们对水活度的影响程度也不同。 细胞内溶质浓度与胞外溶液的溶质浓度（如0.85%NaCl溶液）相等时的状态，称为等渗状态。溶液的溶质浓度高于胞内溶质浓度，则称为高渗溶液。能在此生长的微生物，称为耐高渗微生物。当溶质浓度很高时，细胞就会脱水，发生质壁分离，甚至死亡。盐渍（5~30%食盐）和蜜饯（30~80%糖）可以抑制或杀死微生物，这是一些常用食品保存法的依据。若溶质浓度低于胞内溶质浓度，则称为低渗溶液。微生物在低渗溶液中，水分将向胞内转移，细胞膨胀，甚至胀破。这是低渗破碎细胞法（通常将洗净并离心得到的菌体投入80倍预冷的5(10-4M MgCl2溶液中，剧烈搅拌，使细胞内容物释放到溶液中）的原理。该方法对细胞壁较牢固的革兰氏阳性菌等不适用。 干燥环境（((<0.60~0.70）条件下，多数微生物代谢停止，处于休眠状态，严重时引起脱水，蛋白质变性，甚至死亡。这是干燥条件能保存食品和物品，防止腐败和霉变的原理，同时，这也是微生物菌种保藏技术的依据之一。不同微生物在不同的生长时期对干燥的抵抗能力不同。酵母菌失去水后可保存数个月；产荚膜的菌比不产荚膜的菌对干燥的抵抗力强；小型、厚壁细胞的微生物比长型、薄壁细胞的微生物抗干燥能力强；芽孢、孢子抗干燥的能力比营养细胞强。 3.4.1.3 表面张力 在液体表面有种尽可能缩小表面积的力称为表面张力。常温下纯水的表面张力为7.2×10-4N/cm，一般液体培养基的表面张力在4.5~6.5×10-4N/cm。一些无机盐可以增强溶液的表面张力，如矿泉水的表面张力较大。许多物质如有机酸、蛋白质、醇和肥皂等都能降低表面张力。凡能改变（通常是降低）液体表面张力的物质称为表面活性剂。它分为阳离子型、阴离子型和非离子型三类。表面活性剂的存在会影响微生物的生长和繁殖。阴离子型表面活性剂如肥皂、十二烷基磺酸钠（SDS）等，它们有抑菌作用，但很弱。肥皂对肺炎球菌或链球菌有效，但对葡萄球菌、革兰氏阴性菌、细菌芽孢和结核分枝杆菌等无效。一般认为，用肥皂洗手主要是机械地除菌，而不是杀菌。阳离子型表面活性剂有季胺盐类化合物等。它们能被吸附在细胞膜表面，使细胞膜损伤，从而抑制细菌。如新洁而灭高度稀释后仍有强烈的抑菌作用，浓度高时，能杀死细菌。某些高分子化合物是非离子型表面活性剂，如聚醚类表面活性剂等。 表面活性剂在发酵工业中的重要用途是作为消泡剂以除去泡沫，防止发酵罐因泡沫过多而产生跑液。过去常用植物油作为消泡剂，近年来，已经采用聚醚类表面活性剂代替植物油，具有更好的消泡效果。表面活性剂的另一个重要用途是改变细胞膜的通透性，使胞内合成的代谢产物能够顺利的排到胞外，这样，一方面降低了产物的胞内浓度，因此减少了产物抑制，另一方面则有利于提高产量发酵产物的产量并简化产物的分离提取。表面活性剂也常用于与微生物细胞膜结合的酶的提取，因为这些酶在细胞破碎后仍然很难从膜上溶解下来。 3.4.1.4辐射 辐射是能量通过空间传播的一种物理现象。能量借波动而传播的现象称电磁辐射。能量借原子或亚原子粒子高速运动传递的现象称微粒辐射。与微生物有关的电磁辐射主要有可见光和紫外光。与微生物有关的微粒辐射主要有X射线、(射线。 见图3.4.3。 1) 可见光 (visible ray) 波长400~800nm的电磁辐射称为可见光，它为光合细菌提供了能源（800~1000nm的红外线也可为光合菌提供能量）。一般来讲，可见光对大多数化能微生物没有影响，但是，太强或连续的可见光照射也会引起微生物死亡。  图3.4.3 微粒辐射和电磁辐射能谱及其对微生物的影响 2) 紫外线（ultraviolet ray ) 紫外线的波长范围是100~400nm，其中260~280nm的生物效应最大，杀菌能力也最强，因为核酸（DNA、RNA）的吸收峰为260nm，蛋白质的吸收峰在280nm。紫外线对DNA的作用可引起其产生胸腺嘧啶二聚体，它使得DNA复制错误或无法复制，轻则使微生物发生变异，重则导致菌体死亡。紫外线是常用的物理杀菌剂和诱变剂。 紫外线除了引发胸腺嘧啶二聚外，还会使空气中分子氧变成臭氧O3，臭氧不稳定，释放的原子氧O有杀菌作用。 不同微生物、不同生长阶段的生物对紫外线的抵抗能力不同。革兰氏阴性菌比革兰氏阳性菌敏感，带色菌比不带色菌抗性强，多倍体比单倍体抗性强，孢子和芽孢比营养细胞抗性强，干燥细胞比湿细胞抗性强。 3) 电离辐射(ionizing radiation) X、(、(和(射线均能引起被作用物的电离，所以，又可称为电离辐射。这些辐射的波长短，能量高。电离辐射对微生物的作用不是直接对细胞成分起作用，而是间接地通过射线引起环境中水分子和细胞中水分子吸收能量后电离，产生自由基，后者与细胞中敏感大分子反应，使之失活。水分解成自由基的过程如下： H2O((e- + H2O+ ((OH* + H+ e + H2O ((H2O- (( H* + OH- 上述离子常与液体中存在的氧分子作用，产生一些具强氧化性的过氧化物如H2O2与HO2等： O2 + e- (( O2- O2- + H+((HO2 O2 + 2e-((O2= O2 = + 2H+ ((H2O2 这些强氧化性基团可使细胞中蛋白质或酶发生变化，造成细胞损伤或死亡。 电离辐射是非专一性的，能作用于一切细胞成分，微生物的死亡通常是它们对DNA作用的结果。(射线具有非常强的穿透能力和杀菌效果，常用做杀菌剂。 3.4.1.5.液体静压力 自然界深海中，有很高的静压力，深达6浬（1浬等于1,852米）处的压力可达水面的1000倍以上。通常陆生细菌和海洋细菌在200到600大气压时就有不利的影响，在如此高的压力下绝大多数微生物都不能生长，但是人们发现此深海中仍然有极少数微生物存在。这些微生物反而不适应在常压下生活，它们被称为专性嗜压菌。虽然它们对高压环境能够具有某种程度的适应性，它们的生长却极其缓慢。例如将Pseudomonas bathycetes放在1,000大气压、3℃培养，结果发现延迟期长达约4个月，传代时间为33天，一年后才达到静止期。高压条件下的微生物生长一般比正常条件下的微生物慢1,000倍。 另一类高压环境是深油井和硫泉内。在这些环境中，每下降10 米压力平均增加约一个大气压。每下降一米温度也平均升高0.014℃。在约4,000米深的油井和硫泉内，压力约为400大气压，温度达到60~105℃。从这样的环境中仍能分离出耐热的硫酸还原菌。 3.4.1.6声能 频率2万赫兹以上的超声波具有强烈的生物学效应。超声振荡在液体介质中会引起空化作用，产生大量直径10(m左右的空泡，空泡随后爆炸。在此过程中，产生高达几千大气压的冲击波和局部高温，可使细胞破裂，见图3.4.4。几乎所有微生物细胞都会受其破坏，其效果与声波频率、处理时间、微生物种类、细胞大小、形状和数量等因素相关。淋病奈氏球菌对其极为敏感，而发光细菌却要处理1.5小时才死亡。病毒对其抗性较强。一般来讲，高频率比低频率杀菌效果好；球菌较杆菌抗性强；革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌抗性强；细菌芽孢具有更强的抗性，大多数情况下不受超声波的影响。 因为超声波能引起细胞破裂，内含物外溢，所以，实验室也常用超声波来破碎细胞。超声产生的热量可用冰水浴来冷却。为防止泡沫可适当地加入消泡剂。为防止氧化作用可通入氮气及其它惰性气体。  图3.4.4 超声波破碎细胞（杀菌）的机理 3.4.2. 化学因子对微生物生长的影响 影响微生物生长的化学因子有很多，除了前述的营养物质外，主要还有氢离子浓度和氧化还原电位。 3.4.2.1氢离子浓度 氢离子浓度可表示为环境或培养基中的pH值。环境中pH值对微生物生长的影响很大。主要效应是引起细胞膜电荷变化，以及影响营养物离子化程度，从而影响微生物对营养物的吸收；pH值也会影响生物活性物质如酶的活性。 与温度对微生物的影响类似，微生物存在最低生长pH值、最适生长pH值和最高生长pH值。不同微生物对环境pH值适应的范围不同，见表3.4.6。微生物生长的最适pH值通常在pH4.0~9.0的范围内。一般真菌生长的pH值范围广，而细菌较窄（3~4 pH单位）。细菌、放线菌一般适应于中性偏碱性环境，而酵母菌、霉菌适应于偏酸性环境。 最适生长pH值偏酸性的微生物，称为嗜酸性微生物，其中不能在中性环境生长的称专性嗜酸微生物，如乳酸杆菌和假单胞杆菌。既能适应酸性，也能在中性环境中生长的称兼性嗜酸菌；最适生长pH值偏碱性的称嗜碱性微生物，如链霉菌。 同一种微生物在不同的生长阶段和不同生理生化过程中，对环境pH值也有不同的要求。例如：丙酮丁醇梭菌在pH5.5~7.0时，以菌体生长繁殖为主，pH4.3~5.3时，才进行丙酮和丁醇发酵。 表 3.4.6 不同微生物对氢离子浓度的适应范围 微生物种类 pH值   最低 最适 最高  氧化硫杆菌 嗜酸乳杆菌 大豆根瘤菌 褐球固氮菌 亚硝酸细菌 一般放线菌 一般酵母菌 黑曲霉 1.0 4.0~4.6 4.2 4.5 7.0 5.0 3.0 1.5 2.0~2.8 5.8~6.6 6.8~7.0 7.4~7.6 7.8~8.6 7.0~8.0 5.0~6.0 5.0~6.0 4.0~6.0 6.8 11.0 9.0 9.4 10.0 8.0 9.0   同一种微生物由于培养环境pH值不同，可能积累不同的代谢产物。例如黑曲霉在pH2~3的环境中发酵蔗糖，产物以柠檬酸为主，只产极少量的草酸；当pH值接近中性，则大量产生草酸，而柠檬酸的产量很低；又如酵母菌生长在最适pH值时，进行乙醇发酵，不产生甘油和醋酸；如果环境pH值大于8，发酵产物除乙醇外，还有甘油和醋酸。因此，在发酵过程中，根据不同的目的，常采用变动pH的方法，以提高生产效率。 虽然微生物能适应的环境pH值范围较广，但是各种微生物细胞内的pH值却都接近中性，因为胞内的DNA、ATP和叶绿素等对酸性敏感，RNA和磷脂等对碱性敏感。微生物胞内酶的最适pH值一般为中性，胞外酶最适pH值接近其所处的环境。 大多数微生物能分解糖，产生酸性物质，造成环境的pH值下降。少数微生物能分解尿素成氨，使环境pH值上升。蛋白质脱羧产胺反应也会使pH值上升。所以说，微生物的代谢活动会改变环境的pH值，从而影响其生存。pH值变化的程度与培养基的C/N比有关，C/N比高，则pH值下降明显，反之，pH有可能会上升。 pH值变化往往对发酵生产不利，需及时调整pH值，可以采用以下这些措施： 治标 过酸时，加入NaOH、Na2CO3 过碱时，加H2SO4，HCl。 pH值调节措施 过酸时 加适量N源：尿素，NaNO3，硫酸胺，蛋白质， 治本 提高通气量。 过碱时 加适量碳源 ：糖，乳酸，油脂， 降低通气量。 这些调节措施可分为“治标”和“治本”两大类。前者是根据表面现象而进行直接、快速但不能持久的调节；后者则根据内在机制所采用的间接、缓效但能持久发挥作用的调节。 环境pH值超过最低生长pH值或最高生长pH值就会使微生物致死，因此，强酸或强碱都具有杀菌作用。无机酸如硫酸、盐酸等杀菌力虽很强，但腐蚀性太强，没有作为杀菌剂的实用价值，某些有机酸如苯甲酸等可以作为防腐剂，在面包等食品中添加丙酸也可以防霉。酸菜、饲料青贮则是利用乳酸菌发酵产生的乳酸抑制腐败微生物的生长，使之得以长久保存。强碱可以用作杀菌剂，但是它的毒性太大，其用途局限于排泄物及环境的消毒。 3.4.2.2.氧化还原电位 氧化还原电位Eh对微生物生长有明显影响。环境Eh主要与氧分压有关，环境中氧气越多，Eh越高。Eh也受pH影响，pH值低时，Eh高，反之则Eh低。标准氧化还原电位Eh’是pH7.0 时测得的氧化还原电位。在自然环境中，Eh’的上限为+0.82V，这是当环境中存在高浓度氧气，但没有利用氧气的系统（呼吸链）的情况下测得的。Eh’的下限为-0.42V，是在富含氢气的环境下测量的。 微生物代谢活动常消耗氧气，并产生维生素C、硫化氢、含巯基化合物等还原性物质，从而使Eh下降；向培养基中添加化学试剂可以改变Eh，如：抗坏血酸、硫化氢、铁、含巯基的二硫苏糖醇、半胱氨酸和谷胱甘肽等还原剂可使Eh减小；加入高铁化合物和氧气等氧化剂可使Eh增加。微生物培养时常将空气或氧气强力通入培养基中，维持适当的Eh。分子氧在水中的溶解度很低，影响微生物生长的是溶于水的溶解氧。 可以根据微生物适合生长的环境Eh将其分成好氧（需氧）性微生物和厌氧性微生物。好氧性微生物，在Eh >+0.1V均可生长，最适Eh为 +0.3~0.4V。厌氧性微生物只能在<+0.1V的环境中生长。 好氧微生物又可以分为专性好氧微生物、兼性好氧微生物和微好氧微生物。专性好氧微生物必须在有氧的情况下生长，有完整的呼吸链，以氧气为最终电子受体，细胞内含超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，简写SOD）和过氧化氢酶。多种细菌和大多数真菌属于专性好氧微生物。兼性好氧微生物在有氧和无氧的条件下都能生长，但在有氧的条件下生长得更好。它在有氧时表现为好氧呼吸，无氧情况下进行酵解或无氧呼吸，细胞内也含有SOD和过氧化氢酶。许多酵母菌和细菌属于兼性好氧微生物，如酿酒酵母、肠杆菌科细菌等。微好氧微生物只能在较低的氧分压下生活，如霍乱弧菌、一些氢单胞菌属和发酵单胞菌属的种。 厌氧微生物又分为耐氧性微生物和专性厌氧微生物。耐氧性微生物不能利用氧气，但氧气的存在对它无害。它没有呼吸链，只能通过酵解获取能量。细胞内存在SOD和过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶。多数乳酸菌都是耐氧微生物。 专性厌氧微生物不能利用氧气，并且氧气存在会对它们造成损害，即使短时接触空气，也会抑制生长甚至致死。专性厌氧微生物通过酵解、无氧呼吸或循环光合磷酸化等获取能量，细胞内缺乏SOD，细胞色素氧化酶，大多数还缺少过氧化氢酶。以上五类微生物在深层固体培养基中的生长特性有较大的差异，见图3.4.5。  图3.4.5 五类与氧气关系不同的微生物在半固体培养基中的生长状态 1. 好氧菌; 2.兼性好氧菌; 3.微好氧菌; 4. 耐氧菌; 5 厌氧菌 在微生物世界中，绝大多数种类都是好氧微生物和兼性好氧微生物，厌氧性微生物的种类相对较少，但近年来已发现了越来越多新的厌氧微生物。 厌氧性微生物不能利用氧气是因为它们无法进行以分子氧为终受体的电子传递，而氧气对厌氧性微生物的损害可能是因为没有SOD，不能消除氧气产生的超氧阴离子自由基（(O2-），以致毒害细胞。不能利用的氧气会引起较高的Eh，同样对它们的生存不利。 超氧阴离子自由基是活性氧的形式之一，因有奇数电子，故带负电。它既有分子性质，又有离子性质，它的反应性极强，性质不稳定，在细胞内可破坏各种生物大分子和膜，也可形成其它活性氧化物，故对生物十分有害。在体内，超氧阴离子自由基可由酶促（如黄嘌呤氧化酶）或非酶促反应形成： O2 + e (( (O2- 好氧性生物因为含有SOD，剧毒的(O2-就被歧化成毒性稍低的H2O2，在过氧化氢酶的作用下，H2O2进一步变成无毒的H2O。厌氧微生物因为没有SOD，就无法使(O2-歧化，这样，在有氧的存在下，它们体内形成的(O2-就使自身受到伤害。绝大多数的耐氧微生物能合成SOD，且有过氧化物酶，因此，剧毒的(O2-也能够先歧化成H2O2，再还原成H2O。即： 过氧化氢酶 ((( H2O + 1/2O2 SOD 好氧菌 2(O2- + 2H+ ((( H2O2 + O2 好氧菌，耐氧菌 过氧化物酶 ((( 2H2O 耐氧菌