工业微生物学（教材电子书）：第五章 微生物的菌种选育1

第五章 微生物的菌种选育 优良的微生物菌种是发酵工业的基础和关键，要使发酵工业产品的种类、产量和质量有较大的改善，首先必须选育性能优良的生产菌种。理想的工业发酵菌种应符合以下要求： 遗传性状稳定； 生长速度快，不易被噬菌体等污染； 目标产物的产量尽可能接近理论转化率； 目标产物最好能分泌到胞外，以降低产物抑制并利于产物分离； 尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产量及利于产物分离； 培养基成分简单、来源广、价格低廉； 对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感； 对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。 菌种选育包括根据菌种自然变异而进行的自然选育，以及根据遗传学基础理论和方法，人为引起的菌种遗传变异或基因重组,如诱变育种、杂交育种、原生质体融合和基因工程等技术。后一类方法在微生物的菌种选育工作中占踞主导地位，其中通过分子生物学手段，定向构建基因工程菌是微生物育种的重要发展趋势。当然，菌种选育的前提条件是从自然界获得相应的原始菌种。 5.1 从自然界中获得新菌种 自然界中微生物资源极其丰富，土壤、水、空气、动植物及其腐败残骸都是微生物的主要栖居和生长繁殖场所。微生物种类之多，至今仍是一个难以估测的未知数。从微生物的营养类型和代谢产物及其能在各种极端环境条件（高热、高压、低温、强碱、强酸及高渗透压等）下生存的角度分析，微生物种类应大大超过所有动植物之和。随着微生物学研究工作的不断深入，微生物菌种资源开发和利用的前景十分广阔。 新的微生物菌种需要从自然生态环境中混杂的微生物群中挑选出来，因此必须要有快速而准确的新种分离和筛选方法。典型的微生物新种分离筛选过程示于图5.1.1。 从以上表解可知，分离微生物新种的具体过程大体可分为采样、增殖、纯化和性能测定等步骤。 5.1.1 采样 采样应根据筛选的目的、微生物分布情况、菌种的主要特征及其生态关系等因素，确定具体的时间、环境和目标物。 土壤是微生物的大本营，菜园和耕作层土壤是有机质较多的土层，常以细菌和放线菌为主；果园树根土层中，酵母菌含量较高；动植物残体及霉腐土层中，分布着较多的霉菌。此外，豆科植物根系土中，往往存在根瘤菌；河流湖泊的淤泥中能分离到产甲烷菌；油田和炼油厂周围土层中常见分解石油的微生物等。季节、表面的植被、温湿、通风情况、养分、水分、酸碱度和光照等都会影响土壤中的微生物分布，故在采土样时应予以重视。采土样地点选好后，用小铲子去除表土，取离地面5(15cm处的土样几克，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧，并标明时间、地点和环境等情况，以备查考。 各种水体也是工业微生物菌种的重要来源，许多具有光合作用能力的微生物及兼性或专性厌氧微生物都能从各种水体中筛选得到。 调查研究并充分查阅资料 设计试验方案 确定采样的生态环境 采样 确定特定的增殖条件 增殖培养 确定定性或半定量的快速检测方法 纯种分离 原种斜面 确定发酵的基本条件 初筛（快速检测或一菌株1摇瓶培养测定） 筛选 复筛（一菌株3~5摇瓶） 结合初步的工艺条件 再复筛 较优菌株斜面（3~5菌株） 生产性能试验 性能鉴定 毒性试验 菌种鉴定 菌种保藏及作为进一步育种的出发菌株 图5.1.1 典型的微生物采样和筛选方法 随着工业的发展，许多人工合成物排入环境中。有证据表明微生物正在“学习”代谢这些陌生的非天然“营养物”。各种污染物，甚至一些剧毒的污染物都有可能在环境中找到对应的微生物，如已经分离到了能分解剧毒物氰和腈化物的微生物有诺卡氏菌、腐皮镰孢霉、木霉、假单胞菌、无色杆菌和产碱菌等14个属，共计49个种。污染源附近的土壤、水体、污泥、污水往往是对各类污染物具降解或转化能力的细菌、放线菌或真菌等微生物理想的采样地点。 5.1.2 增殖 在采集的样品中，一般待分离的菌种在数量上并不占优势，为提高分离的效率，常以投其所好和取其所抗的原则在培养基中投放和添加特殊的养分或抗菌物质，使所需菌种的数量相对增加，这种方法称为增殖培养或富集培养。其实质是使天然样品中的劣势菌转变为人工环境中的优势菌，便于将它们从样品中分离。 5.1.3 纯化 增殖培养的结果并不能获得微生物的纯种。即使在增殖培养过程中设置了许多限制因素，但其它微生物并没有死去，只是数量相对减少。一旦遇到适宜条件就会快速生长繁殖。故增殖后得到的微生物培养物仍是一个各类微生物的混合体。为了获得某一特定的微生物菌种，必须进行微生物的纯化即纯培养。常用的菌种纯化方法很多，大体可将它们分为二个层次，一个层次较粗放，一般只能达到“菌落纯”的水平，从“种”的水平来说是纯的，其方法有划线分离法，涂布分离法和稀释分离法。划线分离法简便而快速，即用接种针挑取微生物样品在固体培养基表面划线，适当条件下培养后，获得单菌落；涂布分离法与划线法类似，用涂布棒蘸取培养液，或先将少量培养液滴在固体培养基表面，再用涂布棒在固体培养基表面均匀涂布。稀释分离法所获得的单菌落更加分散均匀，获得纯种的机率较大。该法是将降至60℃左右的固体培养基与少量培养液（事先在培养液中加入无菌的玻璃珠搅拌打散细胞团，再经过滤处理，效果更佳。）混匀后，再浇注成平板以获取单菌落。另一层次是较为精细的单细胞或单孢子分离法。它可达到细胞纯即“菌株纯”的水平。这种方法的具体操作的方法很多，最简便的方法是利用培养皿或凹玻片等分离小室进行细胞分离。也可以利用复杂的显微操作装置进行单细胞挑取。如果遇到不长孢子的丝状菌，则可用无菌小刀切取菌落边缘疏稀的菌丝尖端进行分离移植，也可用无菌毛细管插入菌丝尖端，以获取单细胞。在具体的工作中，究竟采取哪种方法，应视微生物的实际情况和实验条件而定。 为了提高分离筛选工作的效率，除增殖培养时，应控制增殖条件外，在纯种分离时，也应控制适宜的培养条件，并选用特异的检出方法和筛选方案。 5.1.4 性能鉴定 菌种性能测定包括菌株的毒性试验和生产性能测定。若毒性大而且无法排除者应予以淘汰。尽管在菌种纯化中能获得大量的目标菌株，它们都具备一些共性，但只有经过进一步的生产性能测定，才能确定哪些菌株更符合生产要求。 直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。事实上，从自然界直接获得的野生型菌种往往低产甚至不产所需的产物，只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业发酵生产。所以，我们常将这些自然界中直接获得的新菌株称为进一步育种工作的原始菌株或出发菌株。 5.2 基因突变和微生物菌种选育 5.2.1 遗传的物质基础 在生物体中是否有物质专门行使遗传功能以及究竟何种物质承担此重任，是一个在历史上争论了很久的问题。十九世纪50年代孟德尔(Gregor Mendel)提出是“因子”（factor）行使着遗传功能，后来进一步确认因子就是摩尔根（Thomas Hunt Morgan）提出的“基因” （gene），并证明基因在染色体上。但染色体是由蛋白质和核酸等物质所组成的，生物体的主要物质是蛋白质，但组成蛋白质的有20种氨基酸，它的排列组合方式是个天文数字。而核酸只是由4种碱基构成的，与蛋白质相比，它的排列方式要简单得多。所以，当时人们自然推测只有蛋白质才能担负起复杂的生物遗传重任。直到本世纪40年代，由于先后有三个著名实验的论证，人们才普遍接受核酸才是真正的遗传物质。 5.2.1.1 遗传物质化学本质的确证 肺炎链球菌转化实验
图5.2.1肺炎链球菌的转化现象 肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）,旧称肺炎双球菌（Diplococcus pneumoniae）的菌体外有多糖的荚膜包围，它对菌体有保护作用，这种含有荚膜的菌株称为光滑型（Smooth，即S型），它可使人患肺炎，也可使小鼠患败血症而死亡，另有一类肺炎双球菌的突变菌株，没有荚膜保护，称为粗糙型（Rough，即R型），它在动物体内易被吞噬细胞吞噬，对动物不具毒力，不能杀死小鼠。1928年，英国医生格里菲斯（Griffith）发现将血清II型的R型肺炎双球菌菌株与经加热杀死的血清III型的S型菌株混合后，注射小鼠，能毒死小鼠，并从死鼠血中可以分离到血清III型的S型菌株。这现象被认为是血清III型的S型菌株使II型R型菌株发生了转化(Transformation)。就是说血清II型的R型菌株从已被杀死的血清III型的S型菌株中获得了遗传物质，见图5.2.1。 1944年艾弗里（Avery）证实了转化现象的化学本质。他将S型菌株中的蛋白质、核酸和荚膜等成分分离纯化后，分别再与R型菌株混合，发现只有DNA才能使R型菌株转化成S型菌株，分别用蛋白酶和核酸酶处理转化因子，进一步证实转化现象与蛋白质、荚膜多糖和RNA无关，只与DNA有关，而且DNA纯度越高，转化效率也越高。其结果见表5.2.1。另外，经元素分析、血清学分析和一系列物理特性（如超速离心、电泳、紫外吸收）等测定的结果也证明DNA是遗传信息载体。DNA的转化效率是非常高的，已知其最低作用浓度为1(10-5μg/ml，这是目前任何化学方法都无法检出的浓度。 表5.2.1. 肺炎链球菌S型菌株的细胞成分转化R型菌株（活）试验 细胞组分 处理条件 结果  S菌的DNA S菌的DNA S菌的DNA S菌的RNA S菌的蛋白质 S菌的荚膜多糖 未处理 蛋白酶等（除DNA酶） DNA酶 未处理 未处理 未处理 长出S型菌株 长出S型菌株 只长出R型菌株 只长出R型菌株 只长出R型菌株 只长出R型菌株  
图5.2.2侯喜-蔡斯（Hershey-Chase）的噬菌体感染试验示意图 2) 噬菌体感染试验 1952年，侯喜（Hershey）和蔡斯（Chase）两人利用同位素对大肠杆菌噬菌体T2的吸附、增殖和释放过程进行了示踪研究。因为蛋白质含有硫元素（S），不含磷元素（P），而DNA含有磷元素（P），不含硫元素（S），所以可以用P32或S35标记T2的核酸或蛋白质，分别得到P32标记的T2和S35标记的T2。将标记的噬菌体和大肠杆菌混合，经短时间(如10分钟)保温后，T2完成了吸附和侵入过程，然后在组织捣碎机中剧烈搅拌，使吸附在菌体表面的噬菌体外壳脱离细胞并均匀分布。接着进行离心沉淀，再分别测定沉淀物和上清液中的同位素标记。结果发现，几乎所有的P32都和细菌一起出现在沉淀物中，而几乎所有的S35都在上清液中，见图5.2.2。这意味着大肠杆菌噬菌体T2侵染大肠杆菌时，噬菌体的蛋白外壳完全留在菌体外，而只有DNA进入胞内。随后，菌体裂解释放出了具有与亲代同样蛋白质外壳的完整的子代噬菌体，这说明了只有核酸才是其全部遗传信息的载体。 3) 病毒重建实验 弗朗克-康勒托（Fraenkel-Conrat）等于1956年在植物病毒领域中所作的著名的病毒重建实验也证明了烟草花叶病毒（TMV）的主要感染成分是其核酸（这里是RNA，因为该病毒不含DNA），而病毒的外壳主要是起保护核心RNA的作用。 他们通过普通的TMV与毒株霍氏车前花叶病毒（HR）的核酸和蛋白质的拆开和相互对换重建的过程，同样令人信服地证实了核酸是TMV的遗传物质基础。
图 5.2.3 病毒拆开-重建实验 烟草花叶病毒经弱碱、尿素、去垢剂等处理，可以将其蛋白外壳与RNA分开，重新将蛋白外壳与RNA混合，病毒粒子又会重建。将普通的TMV外壳与毒株霍氏车前花叶病毒HR的RNA混合构成杂种病毒，TMV抗体处理会使其钝化，不能引起病斑，而用HR抗体处理，则不会影响杂种病毒的感染性，这说明杂种病毒的外壳确实是TMV病毒的外壳。杂种病毒感染烟草后，在烟叶上出现HR的病斑，而且从中分离到具HR外壳的HR病毒，这表明是TMV的RNA、而不是蛋白质携带着病毒的所有遗传信息，见图5.2.3。 核酸的结构与复制 核酸有二种类型，即DNA和RNA，它们都是由单核苷酸通过磷酸二酯键聚合而成的。核苷酸由碱基、戊糖和磷酸组成。DNA具双螺旋结构；RNA大多单链只局部为双螺旋结构。DNA的复制为半保留复制。在真核生物中，DNA复制有多个起点，即有数个复制叉，在原核生物中，只有一个固定的复制起点。细菌的复制为双向复制。有些病毒如(X174和(噬菌体是以滚环方式复制的。 基因是在生物体内具有自主复制能力的遗传功能单位，是一个具有特定核苷酸顺序的核酸片段，每个基因约有1000个碱基对，6.7(105道尔顿，即为一个冈崎片段。由于各种微生物所含的核酸分子的大小不同，使得它所含基因的数量差异较大。大肠杆菌DNA中约有7,500个基因，噬菌体T2约有360个基因，而最小的RNA噬菌体MS2却只有三个基因。 有关基因的概念和种类还在不断地更新和发展。例如：一个基因决定一个酶，一个基因决定一个多肽，一个基因是一个交换单位或突变单位或重组单位或功能单位等；另外还有一个基因是一个互补群；一个基因是一个顺反子等概念。基因的功能有明确的分工，如：决定蛋白结构的结构基因，控制结构基因表达的调控基因，包括启动基因、操纵基因、调节基因和抑制基因等。 总之，基因是合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核酸序列（通常是指DNA序列）。它包括编码蛋白质多肽链的核酸序列，也包括保证转录所必需的核酸调控序列以及5’和3’端的非翻译序列。 核染色体 原核生物的染色体 真核生物的染色体 遗传物质类型 真核生物的“质粒” 细胞质基因（质体）线粒体 叶绿体 中心体 动体 核外遗传因子 共生生物：卡巴颗粒 酵母菌：2(m质粒 原核生物质粒 F因子 R因子 Col质粒 Ti质粒， 巨大质粒，降解性质粒 基因不仅存在在染色体上，还存在于细胞中的染色体外的遗传因子（质粒, Plasmid）上，这些染色体外的遗传因子见图5.2.4。 图5.2.4染色体内和染色体外的遗传因子 质粒（plasmid）是游离于染色体外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状DNA（circular covalently closed DNA ，或cccDNA)，分子量变化较大，在106(108Da范围内。在细胞质中，环状质粒DNA自身卷曲，呈现超螺旋结构，见图5.2.5。只要两条链中的一条链上有个切口，超螺旋就会变成一个开口的环形状态，若两条链上都有一个切口，就会变成线性结构，线性状态的质粒DNA一般更容易整合到宿主DNA中。质粒携带着某些染色体所没有的基因，赋予细菌等原核生物对其生存并非必不可少的某些特殊功能，如：接合、产毒、抗药、固氮、产特殊酶或降解毒物等。质粒是一个复制子(replicon)，它的复制若与核染色体复制同步，称严紧型复制控制(Stringent replication control)，一般细胞内只含1(2个这种质粒；另一类质粒复制与核染色体复制不同步，称松驰型复制控制(Relaxed replication control)，一般细胞内含10(15个甚至更多的这类质粒。少数质粒可以在不同的菌株之间转移，如F因子和R因子等。含质粒的细胞遇丫啶类染料、丝裂霉素C、紫外线、利福平、重金属离子或高温等因素处理时，由于质粒的复制受到抑制，而核染色体的复制仍继续进行，可以使子代细胞中的质粒消除。某些质粒具有与核染色体DNA发生整合的功能，如F因子，这类质粒称为附加体（Episome）。质粒还具有重组的功能，可在质粒之间、质粒与核染色体之间发生重组。 整合（integretion）则是指质粒、温和性噬菌体或转化因子等非染色体DNA并入染色体DNA中的过程。质粒有以下一些常见的类型： （1）F因子（fertility factor） 或称为致育因子或性因子，它决定细菌的性别，与细菌接合作用有关。分子量62(106Da，约等于核染色体DNA的2%，它足以编码94个中等大小的多肽，而其中三分之一的基因与接合作用有关。 （2）R因子（resistance factor）又称抗药性质粒，是分布最广、研究得最充分的质粒之一。它能赋予宿主抵抗各种抗生素或生长抑制剂的功能。研究表明，细菌的耐抗生素的性状主要是由于R因子在菌株之间迅速转移所致。
图5.2.5 DNA 的三种存在形式 多数R因子是由相连的二个DNA片段组成，其一称RTF质粒（resistance transfer factor, 抗性转移因子），它含调节DNA复制和转移的基因；其二是抗性决定质粒（r-determinant），含有抗性基因，如：青霉素抗性（penr），氨苄青霉素抗性（Ampr），氯霉素抗性（Camr），四环素抗性（Strr），卡那霉素抗性（Kanr）及磺胺药物抗性（Sulr）等。由RTF质粒和抗性决定质粒结合而形成R因子的过程见图5.2.6。
图5.2.6 R因子的结构组成（IS因子为转座因子，它可使RTF质粒与r决定质粒结合） 此外，R因子能自行重组，即来自两种不同耐药菌株的R 因子基因整合在一起，构成多重耐药菌株。R因子也是借助性线毛进行接合而传递的，在R因子和F因子之间也能发生重组，但R 因子不能整合到核染色体上，所以它不是附加体而是一种稳定的质粒。 R因子在细胞内的数量可从1至2个到几十个不等，分属严紧型和松弛型复制控制。后者经氯霉素处理后，拷贝数甚至可达2000-3000个。因为R因子对多种抗生素有抗性，因此，可作为菌株筛选时的遗传标记，也可用作基因转移的载体。 （3）Col因子（Colicinogenic factor）又称为产大肠杆菌素因子。许多细菌都能产生使其它原核生物致死的蛋白质类细菌毒素。Col因子是控制这类细菌毒素产生的质粒。大肠杆菌素(colicin)是一种由大肠杆菌的某些菌株所分泌的细菌毒素，它能通过抑制复制、转录、翻译或能量代谢等而专一性地杀死其它肠道细菌, 其分子量约4(104(8(104Da，负责编码大肠杆菌素。Col 因子分两类，分别以ColE1和ColIb为代表。前者分子量小，约为5(106Da，是多拷贝和非转移性的；后者的分子量约为80(106Da，只有1(2个拷贝，可通过性线毛转移。但由于Col因子有较弱的阻遏系统，它不能象F因子或R因子那样在群体中快速传播。 凡带Col因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。 （4）Ti质粒（Tumor inducing plasmid）或称诱癌质粒。细菌侵入植物细胞后，细菌溶解，Ti质粒与植物细胞核染色体发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使植物细胞转变成癌细胞，（双子叶植物的根瘤）。Ti质粒长200kb，是大型质粒，当前Ti质粒已成为植物遗传工程研究的重要载体，一些具重要性状的外源基因可借DNA重组技术插入到Ti质粒中，并进一步使之整合到植物染色体上，以改变植物的遗传性，达到培育植物优良品种的目的。 （5）巨大质粒（mega质粒）为近年来在根瘤菌属（Rhizobium）中发现的一种质粒，分子量为200(300X106Da，比一般的质粒大几十倍至几百倍，故称巨大质粒。质粒上有一系列固氮基因。 （6）降解性质粒 只在假单胞菌属(Pseudomonas)中发现。它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质为碳源。这些质粒以其所分解的底物命名，例如有CAM（分解樟脑）质粒，OCT（辛烷）质粒，XYL（二甲苯）质粒，SAL（水杨酸）质粒，MDL（扁桃酸）质粒，NAP（萘）质粒和TOL（甲苯）质粒等。 有关质粒的起源众说纷纭。它可能是从原噬菌体演化来的，但也可能是一个相反的过程。质粒与噬菌体之间有很多相似之处，见表5.2.2。 表5.2.2. 质粒与噬菌体的特征比较 质粒 噬菌体   F因子 R因子 Col因子 温和性 烈性  独立复制 经细胞间接触而转移 能整合到核染色体 能获得宿主染色体基因 + + + + + + - - + +或- - - + +或- + + + - - -   5.2.2 基因突变 突变（Mutation）指生物的遗传性突然发生变异，并影响生物正常遗传的表型和性状的现象。这种突变是突然发生的，可遗传的。 根据突变造成遗传物质改变的范围，可以将突变分为染色体畸变和基因突变，但它们本质上都造成了基因的突变，所以，都可以广义地理解成基因突变。 5.2.2.1 突变现象 从突变的表现型可将突变分为形态突变、生化突变、致死突变和条件致死突变四类： 1）形态突变型 指突变的菌体发生形态可见的变化。如细胞大小、形状、鞭毛、纤毛、孢子、芽孢、荚膜，以及群体形态结构（菌落和噬菌斑等）的改变。 2）生化突变型 指突变的菌体原有特定的生化功能发生改变或丧失，但在形态上不一定有可见的变化，通过生化方法可以检测到。如菌体对底物（糖、纤维素及烃等）的利用能力、对营养物（氨基酸、维生素及碱基等）的需求、对过量代谢产物或代谢产物结构类似物的耐性以及对抗药性发生的变化。另外，它也包括细胞成分尤其是细胞表面成分（细胞壁、荚膜及鞭毛等）的细微变异而引起抗原性变化的突变。 生化突变对于发酵工业生产具有重大意义。例如：很多氨基酸和核苷酸生产菌就是一些营养缺陷型的突变菌株，或是对某些代谢产物及其结构类似物的抗性菌株；对青霉素或链霉素等药物的抗性菌株，可改善发酵的管理，并可作为遗传标记以便于育种工作中的筛选和鉴别。 3）致死突变型 突变造成菌体死亡或生活能力下降。致死突变若是隐性基因决定的，那么双倍体生物能够以杂合子的形式存活下来，一旦形成纯合子，则发生死亡。 4）条件致死突变型 突变后的菌体在某些条件下，可以生存，但在另一些条件下则发生死亡。温度敏感突变型是最典型的条件致死突变型。有些菌体发生突变后对温度变得敏感了，在较窄的温度范围内才能存活，超出此温度范围则死亡。其原因是有些酶蛋白（DNA聚合酶，氨基酸活化酶等）肽链中的几个氨基酸被更换，从而降低了原有的抗热性。如有些大肠杆菌突变菌株能在37 ℃下生长，但不能在42 ℃下生长；噬菌体T4的几个突变株在25 ℃下有感染力，而在37 ℃下则失去感染力。 以上四种突变类型的划分并不是绝对的，只是关注的角度不同，它们并不彼此排斥，往往会同时出现。营养缺陷型突变是生化突变型，但也是一种条件致死突变型。而且它常伴随着菌体形态的变化，即形态突变型。所有的突变从本质上看都可认为是生化突变型。 如果从研究者能否在巨大的群体中迅速检出和分离出个别的突变体的目的来看，则只有选择性突变和非选择性突变两类。前者具选择性标记，可通过某种环境条件使它们得到生长优势，从而取代原始菌株，例如营养缺陷型和抗性突变型等。后者没有选择性标记，而只是一些数量上的差异，例如菌落大小、颜色深浅、产量高低等。 5.2.2.2 突变的诱发因素 突变是怎样引起的呢？现在认为突变是可以诱发的，即在已知的物理、化学或生物因素的作用下，生物体发生突变。突变也可以是自发的，自发突变是指生物在没有人工参与的条件下所发生的突变，但这并不意味着它的发生是没有原因的，大多数自发突变本质上也是诱发的，只不过它不是人为的，而是自然环境或细胞内环境诱发的。人们将引起突变的因素称为诱发因素，诱发因素是多方面的，主要可以分为细胞外因素、细胞内因素和DNA分子内部因素三个层次。 细胞外的诱发因素 这包括自然环境或人工条件下的物理和化学因素。如自然环境中，宇宙间的短波辐射、宇宙线和紫外线等，虽然在自然条件下，它们对地球上生物的辐射量并不大，但一般认为辐射的诱变作用不存在阈值，任何微弱的辐射均有诱变效应。多因素低剂量长期辐射的综合效应，将会引起生物的自发突变。自然环境中存在低剂量的金属离子、高分子化合物、生物碱药物、染料及微生物产生的H2O2等都能成为引起生物突变的化学因素。 人造的紫外线、γ射线、X射线、快中子、激光以及加热等都能成为基因突变的物理因素。人造的化学诱变因素有碱基类似物、烷化剂及亚硝酸盐等。 细胞内的诱发因素 生物体细胞的代谢活动会产生一些诱变物质，如过氧化氢、咖啡碱和重氮丝氨酸等，它们是引起自发突变的内源诱变剂。在许多微生物的陈旧培养物中易出现自发突变株，可能就是这类原因。

图5.2.7 碱基的互变异构效应 图5.2.8 互变异构效应引起的不正常的碱基配对 DNA分子内部因素 DNA分子中的碱基存在着互变异构效应。如图5.2.7所示，因为A、T、G、C四种碱基的第6位，不是酮基（T，G）就是氨基（A，C），碱基T和G能够以酮式或烯醇式两种互变异构的状态出现，而碱基C和A能够以氨基式或亚氨基式两种互变状态出现。一般生理条件下，碱基互变平衡反应倾向于酮式或氨基式，所以，DNA两条互补链之间总是以A:T和C(G碱基配对。但是T偶尔也会以稀有的烯醇式形式出现，这样在DNA复制到达这一位置的瞬间，新合成链中T对应的不再是A，而是G；同理，若碱基C以稀有的亚氨基形式出现，在DNA复制到达这一位置的瞬间，则它对应的不是G，而是A，见图5.2.8。有人认为这就是造成了菌体自发突变的原因之一。 1） -T-T-G- ( -T-T-G-A-T- -A-A-C-G-T-A- -A-A-C T-A- \/ G 2） -T-T-G- ( -T-T-G-A-T- ( -T-T -G-A-A-T- -A-A-C-G-T-A- -A-A-C T-A- -A-A-C-G-T-A- \/ G 3） -T-T- ( -T-T-A-T- ( -T-T-A-T- A-T- -A-A-C-G-T-A- -A-A T-A- -A-A-C-G-T-A- ( ( C-G 图5.2.9 核苷酸的环出效应 1）核苷酸G环出造成新链缺失对应的C；2）单个核苷酸环出，再经一次DNA复制后，导致C：G (A：T颠换；3）两个核苷酸环出，再经一次DNA复制后，导致C：G (A：T颠换和G：C (A：T 转换 有人提出了另一种造成自发突变的原因——环出效应。在DNA复制的过程中，如果其中某一单链上偶尔产生一小环，则会因环上的基因越过了复制或重复复制而发生遗传缺失或碱基置换，从而也会造成自发突变。图5.2.9就是环出效应的设想机制。当DNA复制到C时，模板链G向外“环出”，故只有C和T等获得复制，从而发生缺失突变，而下链则可继续正常复制；另一种情况是，当DNA复制到C时，模板链G向外“环出”，当复制继续进行时，模板却又恢复了正常。结果在原来应出现C：G碱基对的位置变成了A：G，再经DNA复制，便成为A：T，从而造成C：G (A：T颠换。 若环出的是两个核苷酸，就会导致相邻的两个碱基发生变化。如果这两个碱基分别属于两个密码子，那么一次突变就可能引起两个氨基酸的改变。 总之，诱发因素是普遍存在的，因为所有基因的结构都由四种碱基所组成，所以任何基因都会突变。至于什么基因发生突变，什么时候发生突变，则都是随机的。采用人工的物理或化学诱变可以提高突变发生的机率。 5.2.2.3 基因突变的特点 基因突变的自发性及不对应性 各种性状的突变都可以在没有任何人为诱变因素的作用下自发产生，这就是基因突变的自发性。基因突变的性状与引起突变的因素之间无直接的对应关系。任何诱变因素或通过自发突变过程都能获得任何性状的变异。就是说，在紫外线诱变下可以出现抗紫外线菌株，通过自发或其它诱发因素也可以获得同样的抗紫外线菌株，紫外线诱发的突变菌株也有不抗紫外线的，也可以是抗青霉素的，或是出现其它任何变异性状的突变。基因突变的自发性和不对应性已被波动测验、涂布试验和影印培养实验这三个著名的实验所证实。
5.2.10 变量试验示意图 1943年，鲁里亚(Luria)和德尔波留克(Delbrück)根据统计学原理，设计了变量试验（fluctuation test），又称为波动测验或彷徨试验，见图5.2.10。试验的要点是：取对噬菌体T1敏感的大肠杆菌对数期肉汤培养物，用新鲜培养液稀释成浓度为103/毫升的细菌悬液，然后在甲、乙两试管内各装10毫升。接着把甲管中的菌液先分装在50支小试管中（每管装0.2毫升），保温24-36小时后，即把各小试管的菌液分别倒在50个预先涂有T1的平板上，经培养后计算各皿上所产生的抗噬菌体的菌落数。乙管中10毫升菌液不经分装先整管保温24-36小时，然后分成50份加到同样涂有噬菌体的平板上，适当培养后，分别计算各皿上产生的抗性菌落数。结果指出，来自甲管的50皿中，各皿间抗性菌落数相差悬殊，而来自乙管的则各皿数目基本相等。这说明大肠杆菌抗噬菌体性状突变，不是由于环境因素——噬菌体诱导出来的，而是在它们接触噬菌体前，在某一次细胞分裂过程中随机地自发产生的。噬菌体在这里仅起到淘汰原始的未突变的敏感菌和甄别抗噬菌体突变型的作用。 1949年，纽康布（Newcombe ）曾设计了一种与变量试验相似，但方法更为简便的证实同一观点的实验，这就是涂布试验（Newcombe experiment）。与变量试验不同，他用的是固体平板培养法。先在12只培养皿上各涂以数目相等（5(104）的对T1噬菌体敏感 的大肠杆菌，经过5小时的培养，它们约繁殖了12.3代，于是在皿上长出大量微菌落（这时每个菌落约含5,100个细菌）。取其中6皿直接喷上T1噬菌体，另6皿则先用灭菌玻璃棒把上面得到微菌落重新均匀涂布一次，然后同样喷上相应的T1。培养过夜后，计算这两组培养皿上所形成的抗噬菌体菌落数。结果发现，在涂布过的一组中，共有抗性菌落353个，要比未经涂布过的（仅28个菌落）高得多，见图5.2.11。这也意味着该抗性突变株发生在未接触噬菌体前。噬菌体的加入只起到甄别这类突变是否发生的作用，而不是诱导突变的因素。
图5.2.11 涂布试验示意图 1952年，莱德伯格(Lederberg)夫妇设计了一种更巧妙的影印培养试验，直接证明了微生物抗药性是自发产生的，并与相应的环境因素毫不相干。试验的基本过程是将长有许多菌落（可多达数百个）的母种培养皿倒置于包有灭菌丝绒布的木圆柱（直径小于培养皿）上，木柱如“印章”一样沾满平板上所有的菌落，然后把这一“印章”上的细菌定位接种到不同的选择培养基平板上，待培养后，对各皿相同位置上的菌落作对比后，就可选出特定的突变型菌株，此过程称为影印培养法。这种方法已经广泛用于从在非选择性条件下生长的细菌群体中，分离出各种类型的突变种。 利用影印培养法证明大肠杆菌K12自发产生抗链霉素突变的实验如图5.2.12所示。首先将大量对链霉素敏感的大肠杆菌K12细胞涂布在不含链霉素的平板（1）的表面，待其长出密集的小菌落后，用影印法接种到不含链霉素的培养基平板(2)上，随即再影印到含链霉素的选择性培养基平板（3）上。影印的作用可保证这3个平板上所长出的菌落的亲缘和相对位置保持严格的对应性。经培养后，在平板（3）上出现了个别抗链霉素菌落。经过与培养皿(2)和(3)比较，就可在平板（2）的相应位置上找到平板（3）上的几个抗性菌落的“孪生兄弟”。然后把平板（2）中最明显部位的菌落（实际上有许多菌落）挑至不含链霉素的培养液（4）中，经培养后，再涂布在平板（5）上，并重复以上各步骤。上述过程几经重复后，就只要涂上越来越少的原菌液至相当于平板（1）的培养皿（5）和（9）上，而可出现越来越多的抗性菌落，最后甚至可以得到完全纯的抗性菌群体。由此可知，原始的链霉素敏感菌株只通过（1）(（2）(（4）(（5）(（6）(（8）(（9）(（10）(（12）((的移种和选择序列，就可在根本未接触链霉素的情况下，筛选出大量的抗链霉素的菌株。
图5.2.12 影印培养试验 影印培养法不仅在微生物遗传理论的研究中有重要的影响，而且在育种实践和其它研究中均有应用。 以上三个实验充分说明了抗性突变是菌体接触所抗物质以前就已经自发产生了，药物并不是诱变因素，含药物的环境只起筛选和鉴别抗性菌株的作用。即使不存在链霉素，抗链霉素的突变株仍然存在。 2) 基因突变的稀有性 虽然自发突变随时都可能发生，但自发突变发生的频率是很低的。人们把每个细胞在每一世代中发生某一性状突变的概率称为突变率(Mutation ratio)，自发突变率一般在10–6(10–9之间。突变率为108表示细胞繁殖成2×108细胞时，平均产生一个突变体。 3)基因突变的独立性 突变对每个细胞是随机的，对每个基因也是随机的。每个基因的突变是独立的，既不受其它基因突变的影响，也不会影响其它基因的突变。例如巨大芽孢杆菌（Bac.megaterium）抗异烟肼的突变率是5×10-5，而抗氨基柳酸的突变率是1×10-6，对两者双重抗性突变率是8×10-10，与两者的乘积相近。 基因突变的可诱变性 通过人为的诱变剂作用，可以提高菌体的突变率，一般可以将突变率提高10(105倍。因为诱变剂仅仅是提高突变率，所以自发突变与诱发突变所获得的突变株并没有本质区别。 基因突变的稳定性 因为基因突变的原因是遗传物质的结构发生了变化，所以，突变产生新的变异性状是稳定的，也是可遗传的。 基因突变的可逆性 由原始的野生型基因变异成为突变型基因的过程称为正向突变(Forward mutation)，相反的过程称为回复突变(Back mutation或Reverse mutation)。实验证明，任何遗传性状都可发生正向突变，也可发生回复突变。 5.2.2.4 突变机制 突变一般包括染色体数目变化、染色体结构的变化和染色体局部座位内的变化三种情况。 染色体数目的变化 生物细胞内染色体数目是恒定的，多一条或少一条都可能引起生物表型的变化。原核微生物只有一条DNA，若从外源获得一段DNA，且与细胞的部分DNA同源，则称为部分双倍体。与染色体结构变化同属于染色体畸变(chromosomalaberration)。 染色体结构的变化 这是一种大段DNA变化（损伤）现象，它包括染色体缺失(deletion)、插入（insertion）、重复 (duplication)、倒位(inversion)和易位(translocation)，大段DNA的变化会造成染色体配对时，形成特定的电子显微镜下可见的结构改变，见图5.2.13。
图5.2.13 几种常见染色体畸变 1.缺失；2.重复；3.倒位；4.易位 染色体局部座位内的变化 即基因突变(gene mutation)，因为突变只发生在一个基因座位内，所以，又称点突变(point mutation)。基因突变可分为碱基置换（substitution）、移码突变(frame-shift mutation)、缺失(deletion)和插入(insertion)四种形式。基因突变与染色体畸变的区别在于基因突变仅仅是DNA链中一对或少数几对碱基发生了变化。 正常DNA双链中的某一碱基对转变成另一碱基对的现象称为碱基置换(base substitution)。碱基置换又有两种情况：原来链上是嘧啶（或嘌呤）碱基的位置上置换成另一嘧啶（或嘌呤）碱基则称为转换（transition），若原来链上是嘧啶（或嘌呤）碱基的位置上置换成另一嘌呤（或嘧啶）碱基则称为颠换(transversion), 见图5.2.14。颠换现象较为少见。
双链DNA 单链DNA 图5.2.14 碱基的置换 （实线代表转换；虚线代表颠换） 碱基置换后会出现下列几种情况（见图5.2.15）： 错义突变 使所表达的蛋白质中一种氨基酸的位置上，变成另一种氨基酸； 无义突变 正常翻译为氨基酸的碱基置换后变成UAG（琥珀突变）、UAA（赫石突变）或UGA（乳石突变）等终止密码子，造成多肽链合成的中止； 同义突变，碱基发生了置换，但由于遗传密码子的简并性，而并没有影响原来的氨基酸顺序。如密码子GCU置换成GCC后，它们都是丙氨酸的密码子； 沉默突变 碱基置换造成多肽链中一个氨基酸的改变，但该氨基酸对蛋白质的结构和功能没有多大的影响，并没引起细胞表型变化。 UAC （酪氨酸的密码子） CAC UAG UAU UCC （组氨酸密码子） （终止密码子） （酪氨酸密码子） （丝氨酸密码子） 错误蛋白质 不完整蛋白质 相同蛋白质 结构和功能 基本相同蛋白质 错义突变 无义突变 同义突变 沉默突变 图5.2.15 编码蛋白质基因的碱基置换的可能结果 一对或少数几对邻接的核苷酸的增加或减少，将造成这一位置以后一系列密码子发生移位错误的现象称为移码突变(frame-shift mutation )。 移码突变有二种情况（见图5.2.16）： （1）如果增加或减少的核苷酸数目为3或3的倍数，那么，它只改变某一部位的一个或几个氨基酸，其它氨基酸未变，有可能保持原有的蛋白质性质，这取决于这些氨基酸在蛋白质中的重要性。 （2）如果增加或减少的核苷酸数目不是3或3的倍数，那么，这会改变整个蛋白质的氨基酸顺序，其影响可能很大。 (( ABC( ABC( ABC( ABC( ABC( ABC( ABC( ABC( ABC( ( 2）第三个密码子中增添一个碱基后的三联密码子： ((增添了一个碱基 (( ( (ABC(ABC(AB+(CAB( CAB( CAB( CAB( CAB( CAB(( 3）在第二个密码子上缺失一个A后引起的变化： ( (缺失了一个A (( ( (ABC(BCA( BCA( BCA( BCA( BCA( BCA( BCA( BCA(( 4）增添一个碱基和缺失一个碱基后，其后的密码子又恢复正常： (增添了一个碱基 缺失了一个碱基B. (( ( ( (ABC(ABC(AB+ ( CAB ( CAB ( CAC ( ABC ( ABC ( ABC (( 5）增添三个碱基后，只引起一段密码子不正常： 加进了三个碱基 (( ( ( ( (ABC(AB+(CAB(+CA(B+C(ABC(ABC(ABC(ABC(( 6 如缺失三个碱基，也只引起一段密码子不正常： B C B (( ( ( ( (ABC(ACA(BCA(BAB(CAC(ABC(ABC(ABC(ABC(( 正常DNA链上的三联密码子 图5.2.16 移码突变及其回复突变 （双线部分代表正常密码子，单线部分表示不正常） 如果一次移码突变后，再发生一次移码突变，则有可能会造成回复突变。 基因座位中的缺失或插入与移码突变只是程度不同，基因突变中的缺失或插入涉及到的核苷酸数量比移码突变多，很难用移码突变来回复，但与染色体畸变中的缺失或插入相比，它们所变化的范围要小得多。 染色体数目的变化对生物的影响很大，对于微生物来讲，往往是致命的；染色体畸变对微生物的影响次之。这两种遗传物质的变化都可以通过细胞遗传学的方法，借助显微镜观察到。而基因座位内的变化，无法通过显微镜观察到，很多情况下，它只造成微生物遗传性状发生变化，但不会引起菌体死亡，所以，它是诱变选育高产突变菌株的主要机制。 5.2.3 自发突变与定向培育 早期人们认为微生物可“驯化”或“驯养”，出现一种“定向培育”技术，即在特定环境下长期处理某一微生物培养物，同时不断地移种传代，以达到积累和选择合适的自发突变体的古老的育种方法。 由于自发突变的频率较低，变异程度不大，所以，用该法培育新菌种的过程十分缓慢。与后来的诱变育种、杂交育种、尤其是基因工程等育种技术相比，定向培育是一种守株待兔式的被动育种方法，除某些抗性突变外，其它性状不是无法获得，就是需要相当长时间才能奏效。 定向培育最为成功的例子是目前被广泛使用的卡介苗(BCG vaccine)。法国的卡尔密脱（Calmette）和介林（Guerin）把牛型的结核分枝杆菌接种在牛胆汁、甘油、马铃薯培养基上，连续传代培养230代，前后经历13年时间，终于在1923年获得显著减毒的结核杆菌——卡介苗。 早年，巴斯德曾用42℃去培养炭疽杆菌，经过20天后，该菌丧失产芽孢能力。经2-3月后，菌体进一步失去致病能力，因而可用作活菌苗使用。利用它来接种，在预防牛、羊的炭疽病方面，曾获得良好的成效。巴斯德也曾将疯狗的唾液注入健康兔子脑中长期传代“驯化”，制成疫苗，救治狂犬病患者，开创了人类免疫学。当时，人们只是认为微生物与禽畜一样，长期处在特定环境中是可以被“驯服”的，并没有认识到实际上利用了自发突变。 虽然定向培育作为一种古老而低效的育种方法现已被淘汰，但是人们仍然继续在利用菌体的自发突变现象。例如从污染噬菌体的发酵液中分离得到抗噬菌体的菌株；又如在酒精发酵工业中，曾有过一株分生孢子为白色的糖化菌“上酒白种”，就是在原来孢子为黑色的宇佐美曲霉（Aspergillus usamii）3758发生自发突变后，及时从生产过程中挑选出来的。这一菌株不仅产生丰富的白色分生孢子，而且糖化率比原来菌株强，培养条件也比原菌株粗放。这也就是积极的菌种复壮工作。 诱变育种 诱变育种是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究用。 当前发酵工业和其他生产单位所使用的高产菌株，几乎都是通过诱变育种而大大提高了生产性能的菌株。诱变育种除能提高产量外，还可达到改善产品质量、扩大品种和简化生产工艺等目的。诱变育种具有方法简单、快速和收效显著等特点，故仍是目前被广泛使用的主要育种方法之一。 5.2.4.1 诱变剂及其诱发机理 各种性状的突变都可以在没有人为因素的条件下自发地进行，但自发突变的突变率很低，获得符合要求的突变株的可能性很小。在人工的物理化学诱变因素作用下，菌株的突变率得以大大提高，具有利性状的突变株被筛选到的可能性大大增强。这些物化诱变因素又称为诱变剂。 物理诱变剂 物理诱变主要是采用辐射。如紫外线、X射线、γ射线、激光和快中子等都是常用的物理诱变剂。本节将主要讨论紫外线。 生物中核酸物质的最大紫外线吸收峰值在265nm波长处，该波长也是微生物的最敏感点。紫外线诱变机理是它会造成DNA链的断裂，或使DNA分子内或分子之间发生交联反应。交联是由二聚体引起的，二聚体可以在同一条链相邻的碱基之间产生，也可以是在二条链的碱基之间形成。它会引起DNA复制错误，正常的碱基无法配对，造成错义或缺失。嘧啶比嘌呤对紫外线敏感得多。嘧啶的光化产物主要是二聚体和水化物,见图5.2.17，已经了解得较清楚的是胸腺嘧啶二聚体。
图5.2.17 嘧啶的紫外线光化产物 过量的紫外线照射会造成菌体丢失大段的DNA，或使交联的DNA无法打开，不能进行复制和转录，从而引起菌体死亡。紫外线对生物的效应具积累作用，就是说，只要紫外线处理的总时间相等，分次处理与一次性处理的效果类似。 在正常的微生物细胞中，紫外线造成的DNA损伤是可以得到及时修复的。若将受紫外线照射后的细胞立即暴露在可见光下，菌体的突变率和致死率均会下降，这就是光复活作用(photoreactivation)。 光复活作用是于1949年首先在放线菌中发现的。现在已经知道从原核生物到鸟类都有光复活现象，高等哺乳动物却没有。这说明在生物进化过程中光复活作用逐渐被其它修复系统所取代。光复活作用是因为微生物等生物的细胞内存在光复活酶（photoreactivating enzyme），即光裂合酶（photolyase）。光复活酶会识别胸腺嘧啶二聚体，并与之结合形成复合物，此时的光复活酶没有活性。可见光光能（300-500nm）可以激活光复活酶，使之打开二聚体，将DNA复原。与此同时，光复活酶也从复合物中释放出来，以便重新执行光复活功能，见图5.2.18。有人计算过，每个大肠杆菌细胞中约含有25个光复活酶分子。
图5.2.18 光复活作用修复胸腺嘧啶二聚体的过程（PRE为光复活酶） 因为一般微生物细胞内都具有光复活酶，所以，微生物紫外线诱变育种应在避光或红光条件下操作。但因为在高剂量紫外线诱变处理后，细胞的光复活主要是致死效应的回复，突变效应不回复，所以，有时也可以采用紫外线和可见光交替处理，以增加菌体的突变率；光复活的程度与可见光照射时间、强度和温度（45-50℃温度下光复活作用最强）等因素有关。 细胞内还存在另一种修复体系，它不需要光激活，所以称为暗修复（dark repair）或切除修复作用(excision repair)。它可修复由紫外线、γ射线和烷化剂等对DNA造成的损伤。野生型大肠杆菌细胞的切除修复系统非但可以修复自身的DNA紫外线损伤，还能修复外来的噬菌体T1及T3等的DNA所受到的紫外线损伤。 暗修复体系有四种酶参与反应。其修复过程见图5.2.19。首先由核酸内切酶切开二聚体的5’末端,形成3’-OH和5’-P的单链缺口，然后，核酸外切酶从5’-P到3’-OH方向切除二聚体，并扩大缺口，接着，DNA聚合酶以另一条互补链为模板，从原有链上暴露的3’-OH 端起合成缺失片段，最后，由连接酶将新合成链的3’-OH与原链的5’-P相连接。
图5.2.19 胸腺嘧啶暗修复的过程 大肠杆菌等微生物中至少有三个基因与切除修复中二聚体的切除有关。这三个基因是uvrA、uvrB和uvrC，它们分别编码核酸内切酶的三个亚基。 光复活作用使胸腺嘧啶二聚体复原成两个胸腺嘧啶，暗修复则是将胸腺嘧啶二聚体切除。细胞中还存在另一种在并不改变胸腺嘧啶二聚体的情况下的修复系统，即重组修复（recombination repair）。重组修复必须在DNA进行复制的情况下进行，所以又称为复制后修复(postreplication repair)。实验证明大肠杆菌可以在不切除胸腺嘧啶二聚体的情况下，以带有二聚体的这条链为模板合成互补单链，可是在每个二聚体附近留一空隙。对于重组修复的机制并不象切除修复了解得那样具体，一般认为通过染色体交换，空隙部位就不再面对着胸腺嘧啶二聚体而是面对着正常的单链，在这种条件下DNA聚合酶和连接酶便起作用把空隙部位进行修复，见图5.2.20。重组修复与recA、recB和recC基因有关。recA编码一种分子量为40,000的蛋白质，它具有交换DNA的活力，在重组和重组修复中均起关键作用，recB和recC基因分别编码核酸外切酶V的两个亚基，该酶也是重组和重组修复所必需的。修复合成中需要的DNA聚合酶和连接酶的功能与切除修复相同。 重组修复中DNA损伤并没有除去，当进行下一轮复制时，留在母链上的损伤仍会给复制带来困难，还需要重组修复来弥补，直到损伤被切除修复消除。但是，随着复制的进行，若干代后，即使损伤未从母链中除去，而在后代的细胞群中也已被稀释，事实上消除了损伤的影响。
图5.2.20 重组修复过程 以上三类修复系统都是不经诱导而发生的，然而许多能造成DNA损伤或抑制复制的处理会引发细胞内一系列复杂的诱导反应，称为应急反应（SOS response）。早在50年代，J.Weigle就发现，用紫外线照射过的λ噬菌体感染事先经低剂量紫外线照射的大肠杆菌，存活的噬菌体数大大增加，而且存活的噬菌体中出现较多的突变体。如果感染的是未经照射的大肠杆菌，那么噬菌体的存活率和突变率都较低。这称为 W-复活现象（W reactivation）。如果，将经紫外线照射过的λ噬菌体感染在含氯霉素培养基中的细菌，则不出现W-复活现象，而且一旦除去紫外线等因素，W-复活现象出现后的几十分钟内就会消失。这说明细菌细胞内存在一种应答系统（response system），借用国际紧急呼救信号“SOS”（save our soul），称之为SOS反应。它是紫外线照射诱导产生的效应。它的功能包括修复DNA的损伤使噬菌体存活率增加，但是修复的过程中却带来了基因突变，使噬菌体的突变体数量增加。SOS反应广泛存在于原核生物和真核生物中，它是生物在不利的环境中求得生存的一种功能。在一般环境条件下，突变常常是不利的，可是在DNA受到损伤或复制受到抑制的特殊情况下，生物发生突变将有利于生存。 实验证明SOS反应的修复功能依赖于某些蛋白质的诱导合成，就象细菌中诱导酶的合成机制。这些蛋白质可能是缺乏校正功能的DNA聚合酶及其它一些修复系统中的关键酶。 所有的修复系统都是生物对外界因素可能造成遗传物质损伤所设置的层层自我保护屏障。 化学诱变剂 化学诱变剂的种类有许多，但具有高效诱变作用的并不多，常用的化学诱变剂根据其作用方式不同分为三种类型。 （1）与核酸碱基化学反应的诱变剂 此类型主要有烷化剂、亚硝酸和羟胺等。 烷化剂(alkylating agent) 带有一个或多个活性烷基，带一个活性烷基称单功能烷化剂，带二个或多个的分别称为双功能或多功能烷化剂。它们的烷基可转移至其它分子中电子密度高的位置，它们的诱变作用是其与DNA中的碱基或磷酸作用。常见的烷化剂有硫酸二乙酯（EDS）、甲基磺酸乙酯（EMS）、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍（NTG）、亚硝基甲基脲(NMU)、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙酸等。甲基磺酸甲酯是单功能烷化剂，氮芥是双功能烷化剂。NTG和NMU因为有突出的诱变效果，所以被誉为“超诱变剂”。双功能烷化剂可引起DNA二条链交联，造成菌体死亡，所以其毒性比单功能烷化剂强。 碱基中的鸟嘌呤最易受烷化剂作用，形成6-烷基鸟嘌呤，并与胸腺嘧啶错误配对，造成碱基转换。胸腺嘧啶被烷基化后，可与鸟嘌呤错误配对，见图5.2.21。
图5.2.21 EMS 的烷基化造成的碱基转换 烷基化的嘌呤碱与戊糖连接的N糖苷键很不稳定，若断裂后，核苷酸残基将脱去嘌呤碱基，DNA复制时，任何碱基都能在此对应的位置插入，因此烷化剂既可能造成碱基转换，也可能造成碱基颠换。烷化剂造成的碱基置换同样都能由其回复，即A：T((G：C互变。 此外，烷化剂使核苷酸残基脱嘌呤后，也可造成DNA缺失。由于烷化剂能与辐射一样引起基因突变和染色体畸变，所以也有拟辐射物质之称。 亚硝酸的作用主要是使碱基氧化脱氨基，如使腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)分别脱氨基成为次黄嘌呤(H)、尿嘧啶(U)和黄嘌呤(X)。复制时，次黄嘌呤、尿嘧啶和黄嘌呤分别与胞嘧啶（C）、腺嘌呤（A）和胞嘧啶（C）配对，见图5.2.22。前两者能引起碱基转换，而第三种并没有发生转换。这里仅举其中腺嘌呤(次黄嘌呤后引起的转换反应，见图5.2.23。从图中看出转换有几个环节：（1)腺嘌呤经氧化脱氨后变成烯醇式次黄嘌呤（He）；（2)由烯醇式次黄嘌呤通过互变异构效应而形成酮式次黄嘌呤(Hk)；（3)DNA双链第一次复制，结果Hk因其在6位含有酮基，故只能与6位含氨基的胞嘧啶配对；（4)DNA双链的第二次复制，这时其中的C正常地与G正常地配对，因而最终实现了转换。这种转换必需经历两次复制才能完成。亚硝酸引起的碱基转换也可由其回复。即能使A：T((G：C互变。 此外，亚硝酸也可能引起DNA双链交联。
图5.2.22 亚硝酸引起碱基氧化脱氨基效应 腺嘌呤氧化脱氨基成为次黄嘌呤，与胞嘧啶配对；2. 胞嘧啶氧化脱氨基成为尿嘧啶，与腺嘌呤配对；3. 鸟嘌呤氧化脱氨基成为黄嘌呤，仍与胞嘧啶配对，不能引起碱基转换 羟胺（HA）能专一地与胞嘧啶作用。修饰后的N-4-羟基胞嘧啶只能与腺嘌呤配对，引起C：G(T：A碱基转换，见图5.2.24。羟胺引起的转换是单向的，即无法引起T：A ( C：G的碱基转换。 羟胺是还原剂，在活细胞中，它与各种物质反应产生H2O2及一些非专一性的诱变剂，所以在体外它具较强的专一性，而在活细胞内便丧失了专一性。
图5.2.23 由亚硝酸引起的AT—→GC的转换
图5.2.24 羟胺引起CG—→TA的机制 碱基类似物 这些化合物有5-溴尿嘧啶（5-BU），5-氟尿嘧啶(5-FU)、8氮鸟嘌呤(8-NG)和2-氨基嘌呤（2-AP）等。它们与碱基的结构类似，在DNA复制时，它们可以被错误地掺入DNA，引起诱变效应，所以说它们引起碱基置换的作用是间接的。以下用5-溴尿嘧啶为例来加以说明。 酮式的5-BU结构与胸腺嘧啶相似，烯醇式5-BU结构与胞嘧啶相似，见图5.2.25。当把某一微生物在含5-BU的培养液中培养，DNA复制时，它可取代T。5-BU一般以酮式状态存在于DNA中，因而与A配对。5-BU很容易进行酮式与烯醇式结构的互变异构，当DNA复制时，烯醇式5-BU不与A而与G配对，从而造成A：T(G：C的转换，见图5.2.26(1)；当烯醇式5-BU在DNA复制时掺入DNA，并与G配对，若再从烯醇式转换成酮式，并与A配对，则会造成G：C( A：T转换。见图5.2.26(2)。因为5-BU可使A：T转换成G：C，也可使G：C反向转换成A：T，所以，它引起的突变也可以由它本身来回复。
图5.2.25 酮式和烯醇式5-BU分别与腺嘌呤和鸟嘌呤配对
图5.2.26 5-BU在DNA复制时掺入并引起碱基转换 （BUk为酮式5-BU；BUe为烯醇式5-BU） 2-AP是腺嘌呤的结构类似物，能与胸腺嘧啶配对，但当其质子化后，会与胞嘧啶错误配对，见图5.2.27。
图5.2.27 腺嘌呤类似物2-AP可能的配对形式 1.通常与胸腺嘧啶配对；2.质子化后与胞嘧啶错误配对 从上可知，碱基类似物引起的突变必需经过两代以上才能表现出来，因为引入新碱基的过程需经过三轮DNA复制。另外，它是通过DNA合成来达到诱变效应的，只对正在进行新陈代谢和繁殖的微生物起作用，对于休眠细胞、脱离菌体的DNA或噬菌体，则没有作用。 (3) 移码突变的诱变剂 移码突变是指由一种诱变剂引起DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的插入或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和翻译错误的一类突变。由移码突变产生的突变体称为移码突变体。 吖啶类染料（原黄素、吖啶黄、吖啶橙及(-氨基吖啶等）和一系列称为ICR类的化合物（因由美国的肿瘤研究所“Institute for Cancer Research”合成而得名，它们是一些由烷化剂与吖啶类化合物相结合的化合物）都是移码突变的有效诱变剂，见图5.2.28。 吖啶类化合物的诱变机制并不是很清楚。有人认为，由于它们是一种平面型的三环分子，与嘌呤-嘧啶碱基对的结构十分相似，故能嵌入两个相邻的DNA碱基对之间，造成双螺旋的部分解开（两个碱基对原来相距0.34纳米，当嵌入一个吖啶类分子时，就变成0.68纳米），从而在DNA复制过程中，会使链中增添或缺失一个碱基，结果引起移码突变。 吖啶类化合物可以引起移码突变及其回复突变。在DNA链上增添或缺失一、二、四、或五个碱基时，均会引起移码突变；而增添或缺失三或六个碱基时，则不影响读码，只引起较短的缺失或插入。
图5.2.28 几种移码突变诱变剂及其可能的诱变机制 5.2.4.2 诱变育种方法 从自然界直接分离到的野生型菌株积累产物的能力往往很低，无法满足工业生产的需要，这就要求我们对它们进行菌种改造，即育种。育种的手段很多，从微生物育种发展的历史看，有定向培育、诱变育种、杂交育种、细胞融合和基因工程等育种技术。目前，诱变育种对于微生物工作者来讲仍是一个最有效而实用的方法。 诱变育种的基本过程如下： 选择合适的出发菌株 ( 制备待处理的菌悬液 ( 诱变处理 ( 筛选 ( 保藏和扩大试验 本节主要讨论前三个步骤，筛选工作见本章5.6节，菌种保藏已在第三章中讨论，扩大试验内容可以参考有关微生物发酵工艺的教科书。 出发菌株的选择 用来育种处理的起始菌株或称为出发菌株，合适的出发菌株就是通过育种能有效地提高目标产物产量的菌株。首先应考虑出发菌株是否具有特定生产性状的能力或潜力，即菌株是否具有产生特定代谢产物的催化酶系的基因。出发菌株的来源主要有三方面： (1)自然界直接分离到的野生型菌株 这些菌株的特点是它们的酶系统完整，染色体或DNA未损伤，但它们的生产性能通常很差（这正是它们能在大自然中生存的原因）。通过诱变育种，它们正突变（即产量或质量性状向好的方向改变）的可能性大。 (2)经历过生产条件考验的菌株 这些菌株已有一定的生产性状，对生产环境有较好的适应性，正突变的可能性也很大。 (3)已经历多次育种处理的菌株 这些菌株的染色体已有较大的损伤，某些生理功能或酶系统有缺损，产量性状已经达到了一定水平。它们负突变（即产量或质量性状向差的方向改变）的可能性很大，可以正突变的位点已经被利用了，继续诱变处理很可能导致产量下降甚至死亡。 一般可选择(1)或(2)类菌株，第(2)类较佳，因为已证明它可以向好的方向发展。在抗生素生产菌育种中，最好选择已通过几次诱变并发现每次的效价都有所提高的菌株作出发菌株；在选择产核苷酸或氨基酸的出发菌株时，最好考虑至少能积累少量产品或其前体的菌株。 出发菌株最好已具备一些有利的性状，如生长速度快、营养要求低和产孢子早而多的菌株。 制备菌悬液 待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态、悬液的均一性和环境条件。一般要求菌体处于对数生长期，并采取一定的措施促使细胞处于同步生长。 悬液的均一性可保证诱变剂与每个细胞机会均等并充分地接触，避免细胞团中变异菌株与非变异菌株混杂，出现不纯的菌落，给后续的筛选工作造成困难。为避免细胞团出现，可用玻璃珠振荡打散细胞团，再用脱脂棉花或滤纸过滤，得到分散的菌体。对产孢子或芽孢的微生物最好采用其孢子或芽孢。将经过一定时期培养的斜面上的孢子洗下，用多层擦镜纸过滤。 菌悬液的细胞浓度一般控制为：真菌孢子或酵母细胞106(107个/ml，放线菌或细菌108个/ml。菌悬液一般用生理盐水（0.85%NaCl）稀释。有时，也需用0.1mol/L磷酸缓冲液稀释，因为有些化学诱变剂处理时，常会改变反应液的pH值。 利用孢子进行诱变处理的优点是能使分散状态细胞均匀地接触诱变剂，更重要的是它尽可能地避免了出现表型延迟现象。 所谓的表型延迟(phenotypic lag)就是指某一突变在DNA复制和细胞分裂后，才在细胞表型上显示出来，造成不纯的菌落。表型延迟现象的出现是因为对数期细胞往往是多核的，很可能一个核发生突变，而另一个核未突变，若突变性状是隐性的，在当代并不表现出来，在筛选时就会被淘汰；若突变性状是显性的，那么，在当代就表现出来，但在进一步传代后，就会出现分离现象，造成生产性状衰退。所以应尽可能选择孢子或单倍体的细胞作为诱变对象。但即使如此，也会出现表型延迟现象，这是因为诱变剂往往只作用于DNA分子的一条单链，DNA进一步复制后，同样会出现不纯的菌落。这类表型延迟称为分离性延迟现象，见图5.2.29。 另外，还有一种生理性延迟现象，就是虽然菌体发生了突变，并且突变基因由杂合状态变成了纯合状态，但仍不表现出突变性状。这可以用营养缺陷型和噬菌体抗性突变型来说明。 一个发生营养缺陷型突变的菌株，产某种酶的基因已发生突变，但是由于突变前菌体内所含的酶系仍然存在，仍具有野生型表型。只有通过数次细胞分裂，细胞内正常的酶得以稀释或被分解，营养缺陷型突变的性状才会表现出来。 噬菌体抗性突变型是由于突变引起细菌细胞表面噬菌体受体改变的结果。同样，这些受体也需要通过细胞分裂而稀释，因而从抗噬菌体基因型出现到抗噬菌体表现型的出现之间也有一个生理性延迟。
图5.2.29 突变和分离性表型延迟现象的分子机制 3）诱变处理 通常是根据经验选择恰当的诱变剂,对于已有诱变处理背景的菌株，变换使用其它诱变剂也许会得到较好的效果。一些引起碱基置换的诱变剂（如亚硝酸、硫酸二乙酯等）较易回复突变，而引起的染色体畸变、移码的诱变剂（如紫外线、Co60和吖啶等）不易回复，突变株的性状较稳定。 各种诱变剂有不同的剂量表示方法，如紫外线的强度是尔格，X射线的单位是伦琴（R）或拉得（rad）等，化学诱变剂的剂量则以在一定温度下诱变剂的浓度和处理时间来表示。但是，仅仅采用诱变剂的理化指标控制诱变剂的用量常会造成偏差，不利于重复操作。例如，同样功率的紫外线照射诱变效应还受到紫外灯质量及其预热时间、灯与被照射物的距离、照射时间、菌悬液的浓度、厚度及其均匀程度等诸多因素的影响。另外，不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先做诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。致死率表示诱变剂造成菌悬液中死亡菌体数占菌体总数的比率。它是最好的诱变剂相对剂量的表示方法，因为它不仅反映了诱变剂的物理强度或化学浓度，也反映了诱变剂的生物学效应。 诱变剂的作用一是提高突变的频率，二是扩大产量变异的幅度，三是使产量变异朝正突变或负突变的方向移动，见图5.2.30。凡是在高突变率基础上既能扩大变异幅度，又能促使变异移向正变范围的剂量，就是合适的剂量（如图5.2.29中的c）。
图5.2.29 诱变剂的剂量对产量变异影响的可能结果 a.未经诱变剂处理；b.变异幅度扩大，但正负突变相等；c.正突变占优势；d.负突变占优势 要确定一个合适的剂量，常常需要经过多次试验。就一般微生物而言，突变率随剂量的增大而增高，但达到一定剂量后，再加大剂量反而会使突变率下降。对于诱变剂的具体用量有不同的看法。有人认为应采用高剂量，就是造成菌体致死率在90-99.9%时的剂量是合适的，这样能获得较高的正突变率，并且淘汰了大部分菌体，减轻了筛选工作的负担。许多人倾向于采用低剂量（致死率在70%-80%）,甚至更低剂量（致死率在30-70%），他们认为低剂量处理能提高正突变率，而负突变较多地出现在偏高的剂量中。 诱变育种中还常常采取诱变剂复合处理，使它们产生协同效应。复合处理可以将两种或多种诱变剂分先后或同时使用，也可用同一诱变剂重复使用。因为每种诱变剂有各自的作用方式，引起的变异有局限性，复合处理则可扩大突变的位点范围，使获得正突变菌株的可能性增大，因此，诱变剂复合处理的效果往往好于单独处理，见表5.2.3。 5.3 杂交育种 将二个不同性状个体内的基因转移到一起，经过重新组合后，形成新的遗传型个体的过程称为基因重组(gene recombination)。基因重组是生物体在未发生突变的情况下，产生新的遗传型个体的现象。杂交育种（Hybridization）一般是指人为利用真核微生物的有性生殖或准性生殖，或原核微生物的接合、F因子转导、转导和转化等过程，促使两个具不同遗传性状的菌株发生基因重组，以获得性能优良的生产菌株。这也是一类重要的微生物育种手段。比起诱变育种，它具有更强的方向性和目的性。 杂交是细胞水平的概念，而基因重组是分子水平的概念。杂交育种必然包含着基因重组过程，而基因重组并不仅限于杂交的形式。 表5.2.3 诱变剂复合处理及其协同效应 菌种 单独处理 复合处理   诱变剂 突变率（%） 诱变剂 突变率（%）  土曲霉 紫外线 X射线 21.3 19.7 紫外线+ X射线 42.8  土曲霉 氮芥(0.1%) 紫外线 不明显 4.7 紫外线+氮芥 11.0  链霉菌 紫外线 γ射线 31.0 35.0 紫外线+γ射线 43.6  金色链霉菌 (2U-84) 二乙烯三胺 硫酸二乙酯 紫外线 6.06 1.78 12.5 紫外线+二乙烯三胺 紫外线+硫酸二乙酯 26.6 35.86  灰色链霉菌 （JIC-1） 紫外线 9.8 紫外线+可见光照射1次 紫外线+可见光照射6次 9.7 16.6   5.3.1真核微生物的基因重组 在自然环境中，真核微生物就存在有性生殖和准性生殖等基因重组的形式。利用这些基因重组形式所进行的有性杂交和准性杂交，可以培育出优良的生产菌株。本节主要讨论酵母菌有性杂交和霉菌的准性杂交。 5.3.1.1酵母菌的有性杂交 酵母菌的生活史既包括二倍体、单倍体世代，又包括有性和无性世代。工业上应用甚广的酿酒酵母通常是双倍体酵母菌，并且只进入无性世代。酿酒酵母产子囊孢子的能力已退化，所以，要使这些酵母菌发生基因重组，应先诱使其产生子囊孢子，再使两个不同性状的亲本发生接合，形成二倍体的杂交后代。 酵母有性杂交育种的基本过程包括亲株选择、形成子囊孢子和获得杂合子等步骤： 两个亲株 (((( 形成子囊孢子 (((( 接合 (((( 杂交二倍体的筛选 （具性亲和性，遗传标记） （产孢培养基） （易与单倍体识别） 亲株选择首先应考虑育种的目的性，两亲本的有利性状组合后能培育出高产或高质的菌种，同时还需考虑两亲本间是否有性的亲和性。另外，参与重组的两个亲本一般应具有遗传标记，杂交株和亲本株在形态上或生理上应有较大的差异，以便于快速地筛选出杂交株。 将两株双倍体亲本细胞分别接入含醋酸钠的产孢培养基，可促使其产生子囊，经减数分裂形成子囊孢子。酵母菌的每个子囊中含有四个单倍体的子囊孢子，可用蜗牛酶酶解或机械法（加硅藻土和石蜡油一起研磨）破碎子囊，释放出子囊孢子。经离心得到子囊孢子并在平板上涂布培养，不同亲本的子囊孢子经发芽都形成单倍体细胞；将两个亲本的单倍体细胞密集在一起，就可能发生接合获得各种类型杂合子。再从不同的杂合子中进一步筛选出优良性状的个体。酿酒酵母的双倍体和单倍体细胞有较大的差异，很容易区分，见表5.2.4。 表5.2.4.酿酒酵母的双倍体和单倍体细胞比较 比较项目 双倍体 单倍体  细胞 菌落 液体培养 在产孢培养基上 大，椭圆形 大，形态均一 繁殖较快，细胞较分散 能形成子囊 小，球形 小，形态变化较多 繁殖较慢，细胞常聚集成团 不能形成子囊   在生产实践中利用有性杂交培育优良品种的例子很多。例如，用于酒精发酵的酵母和用于面包发酵的酵母虽都是酿酒酵母，但它们是两个不同的菌株，前者产酒精率高而对麦芽糖和葡萄糖的利用能力较弱，而后者正好相反。通过两者之间的有性杂交，就可得到既能较好地生产酒精，又能较高地利用麦芽糖和葡萄糖的杂交株。 5.3.1.2霉菌的准性生殖（parasexual hybridization） 霉菌的基因重组一般也可以通过有性生殖过程完成，即二个来源不同的孢子发生质配、核配，形成重组体细胞。这是霉菌基因重组的主要方式。而有些霉菌的基因重组则可以采取另一形式——准性生殖。顾名思义，准性生殖是一种类似于有性生殖，但比它更原始的生殖方式，见表5.3.1。准性生殖可发生在同一生物的二个不同来源的体细胞之间，经细胞融合但不发生减数分裂，导致低频率的基因重组。准性生殖常见于某些真菌，尤其是半知菌类。 表5.3.1 准性生殖与有性生殖的比较 比较项目 准性生殖 有性生殖  参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态，生理上有分化的性细胞  独立生活的异核体阶段 有 无  接合后双倍体细胞形态 与单倍体相同 与单倍体不同  双倍本变成单倍体的途径 通过有丝分裂 减数分裂  接合发生频率 偶然，低 正常出现，高   准性生殖主要过程包括菌丝联结、异核体形成、核融合、体细胞交换及单倍体化。见图5.3.1。 菌丝联结(anastomosis)发生在一些形态上无区别，但遗传特性有差别的两个同种亲本的体细胞之间，发生的频率较低。菌丝联结后，细胞核由一根菌丝进入另一根菌丝，从而形成含两种或两种以上基因型的异核菌丝，称异核体(heterocaryon)。异核体能独立生活，而且生活能力往往更强。异核体中的二个核偶尔会发生核融合(nuclear fusion)或核配( caryogamy)，形成杂合双倍体。它较异核体稳定，产生的孢子比单倍体菌丝产生的孢子大一倍。构巢曲霉(Asperigillus nidulan)和米曲霉(Asperigillus oryzae)发生核融合的频率为10-5-10-7，某些理化因素如樟脑蒸汽、紫外线或高温处理等，可以提高核融合的频率。
图5.3.1 半知菌的准性生殖示意图 杂合双倍体在有丝分裂过程中，其中极少数核内染色体会发生交换，这一过程称为体细胞交换（somatic crossing-over），并可能以单倍数量的染色体进入新细胞，即单倍体化，产生具有新性状的单倍体杂合子。若对杂合双倍体进行紫外线、(射线或氮芥等处理，可促进染色体畸变或染色体在子细胞中分配不均，可能产生各种不同性状组合的单倍体杂合子。
图5.3.2 荨麻青霉准性杂交育种示意图（[一]表示基本培养基；[+]表示完全培养基）1. 选择两种互补的营养缺陷型；2.只有异核体才在基本培养基上长出菌落；3.分离单菌落（即获取纯菌株）；4.稳定的杂合二倍体（Ⅰ）和不稳定、未核融合的异核体（Ⅱ）；5.促进变异 准性杂交就是利用半知菌类的准性生殖，在一定的条件下促使不同性状的亲本杂交来获取新品种的过程。对于一些没有有性生殖过程但有重要生产价值的半知菌来说，准性杂交是一条重要的育种途径。例如灰黄霉素产生菌——荨麻青霉(Penicillium urticae)的育种中就曾采用准性杂交的方法，并取得较好的成效，其主要步骤是选择亲本、强制异合和促进变异等（见图5.3.2）。 1）选择亲本 即选择来自不同菌株的营养缺陷型作为准性杂交的亲本。由于在荨麻青霉等不产生孢子的霉菌中，只有极个别的细胞间才会发生联结，而且联结后的细胞在形态上无明显的特征，因此与细菌的接合一样，常需要借助营养缺陷型作为杂交亲本的性状指标，如图中的A-B+与A+B-。 2）强制异合 即人为地强制两菌株形成异核体。将A-B+与A+B-两菌株所产生的分生孢子相互混合后，在基本培养基[—]平板上培养，同时分别将每个亲本的分生孢子在基本培养基[—]培养，作为对照。要求前者培养后只出现几十个菌落,而后者则不长菌落。这时，前者培养出现的菌落就是由A-B+与A+B-两菌株经体细胞联结所形成的异核体或杂合二倍体。 3）移单菌落 将基本培养基[—]上长出的单菌落移种到基本培养基[—]斜面上培养。 4）检验稳定性 先将斜面培养的孢子洗下，用基本培养基倒夹层平板，培养后，加上一层完全培养基[+]。如果在基本培养基上不长或仅出现少量菌落，而加上完全培养基后却出现大量菌落，那么，它便是一个不稳定的异核体菌株，如图中的Ⅱ。如果在基本培养基上出现多数菌落，而加上完全培养基后菌落数没有显著增加，那么，它就是一个稳定的杂合二倍体，如图中的Ⅰ。实际上多数菌株属于不稳定的异核体。 5）促进变异 用紫外线、γ射线或氮芥等理化因素处理以上获得的杂合二倍体所产生的分生孢子，促进其发生染色体交换、染色体在子细胞中分配不均、染色体畸变或点突变，从而使分离后的杂交子代（单倍体杂合子）进一步增加新的性状，加大获取高产菌株的可能性。 5.3.2 原核微生物的基因重组 自然状态下，原核微生物也会发生基因重组。原核微生物基因重组包括接合、F因子转导、转导和转化四种形式。但是，自然条件下，原核微生物基因重组的频率和参与重组的基因是有限的，虽然可以通过人为施加理化影响，以提高基因重组发生的频率，但是，应用这些基因重组形式进行杂交育种来培育高产菌株的成功实例还不多见。 5.3.2.1细菌的接合（Conjugation） 所谓接合，就是指通过供体菌和受体菌的完整细胞经直接接触、传递大段DNA（包括质粒）遗传信息的现象。 接合现象存在于细菌和放线菌中，其中，对大肠杆菌的接合现象已研究得较为清楚，见图5.3.3。根据对接合现象的研究发现大肠杆菌存在性别分化，决定它们性别的是F因子（即致育因子）。F因子是一种染色体外的环状DNA小分子，属细菌质粒。它可自身复制，并可转移至别的细胞。一般每个细胞可有1-4个。它既可脱离染色体在细胞中独立存在，也可插入到细菌染色体上，我们将这种外来DNA片段插入染色体中的过程称为整合。整合态的外来DNA将与染色体同步复制。凡有F因子的菌株，细胞表面会产生1-4个中空、细长的性线毛，性线毛的功能是在细菌接合时帮助转移DNA。有人认为DNA是从性线毛的中间（(2.5nm）穿过，也有人认为性线毛只是连接并收缩使受体细胞和供体细胞相接触，再形成特殊的通道，至于DNA传递过程的细节还不清楚。
图5.3.3 大肠杆菌之间的接合现象 （右侧为细胞表面布满线毛的雄性菌株，箭头所指为其长出的性线毛，性线毛表面经吸附大量的病毒粒子而加粗；左侧为雌性菌株） 由于存在F因子，大肠杆菌可分为四种接合类型： 1）F+（雄性）菌株 细胞内有游离的F因子，有性线毛，可与F–菌株发生接合，从而将F因子转移至F–菌株，使F–菌株成为F+菌株。因为F因子是一边转移，一边复制，所以，接合完成后，F+菌株仍然是F+菌株。DNA是以单链形式转移到F–菌株细胞中的，同时以滚环方式复制并重新连接成双链环状的F因子，见图5.3.4。　　
图5.3.4 在接合中F因子复制和转移的过程 1.F+菌株和F-菌株发生接合后，都成为.F+菌株；2. F因子转移和复制的细节
图5.3.5 Hfr菌株中F因子的整合、断裂和转移 1.环状F因子在1与6位间裂开，以箭头方向进入受体细胞；2.F因子在特定位点（met与thr间）和受体细胞的染色体配对；3.F因子与染色体交叉而成环；4.形成单环；5.在F因子特定位点断裂，产生有一定方向和顺序的线性染色体（F因子与性线毛形成和转移有关的4,5,6基因在其末端） 2）Hfr（高频重组）菌株 含有与染色体特定位点整合的F因子。因该菌株与F–菌株接合后的重组频率比F+菌株高几百倍而得名。Hfr菌株中F因子的整合、断裂和转移的细节见图5.3.5。它与F–接合时，Hfr染色体在F因子处断裂，由环状变成线状，线状染色体通过性线毛帮助进入F–菌株，全过程大约需2小时。F因子在线状DNA的最末端，所以，在整条染色体走完后，F因子才能最终进入F–菌株细胞。由于种种原因DNA转移过程常会被中断，所以越是前端的基因进入F–菌株的机会越大，越后面的基因传递给F–菌株的机会越小。F因子进入F–菌株细胞的机会最小。这就是Hfr菌株与F–菌株接合很难使F–菌株成为F+菌株的原因。 因为转移具有一定顺序性，所以，可通过震荡等手段，在不同时间中断转移过程，根据F–菌株出现Hfr菌株性状的时间，可以知道各基因的排列顺序。选择几种不同整合位点的Hfr菌株进行实验，就可以知道完整的大肠杆菌染色体的基因顺序。原核生物的染色体呈环状也是通过这种方法认识的。 Hfr菌株转移染色体过程与F+ 菌株相似，也是一边复制，一边转移，进入F–菌株细胞的单链DNA复制成双链，然后与染色体同源部位双链交换完成基因重组，见图5.3.6。 3）F–（雌性）菌株 细胞没有F因子，细胞表面无性线毛，可与F+菌株接合，并转变成为F+菌株，也可与Hfr菌株接合，并获得Hfr菌株的一部分或全套染色体。F+菌株和Hfr菌株脱去F因子则成F–菌株。
图5.3.6 Hfr菌株和F-菌株间中断接合试验及形成接合子过程 1.A+性状的Hfr菌株和A-性状的F-菌株细胞配对；2. Hfr的染色体在起始点i开始复制,至F因子插入部位结束。HfrDNA的一条单链经过接合通道，进入F-细胞；3.接合中断，使F-细胞成为一个部分双倍体（在这里单链DNA合成另一条互补链）；4.外来DNA片段与受体DNA在同源处配对并发生两次交换；5. F-菌株成为A+性状的稳定重组子（即接合子） 4）Fˊ菌株 它介于F+菌株与Hfr菌株之间，细胞中有游离的、带小段染色体基因的环状F因子，可与F–菌株接合，使其成为F’菌株。Fˊ菌株的形成见F因子转导。 上述四类型菌株的关系见图5.3.7。
图5.3.7 F+ 菌株、F - 菌株、初生F’菌株和次生F’菌株的相互关系 因为原核生物中出现基因重组现象极为罕见（如大肠杆菌K12约为10-6）,而且，较难找到检出重组子的形态指标，所以，直到1946年开始采用营养缺陷型菌株进行实验后，才确立了方法学基础，从而使细菌杂交工作得以开展，也为此后一系列其它微生物遗传学研究创造了必要条件，这一方法的基本原理见图5.3.8。
图5.3.8细菌杂交方法的基本原理 5.3.2.2 F因子转导(F-mediated transduction) F因子转导又称性导(sexduction)。如前所述，F因子能够以整合态或游离态存在于细胞内，整合态的F因子，可重新成为游离态的F因子，此过程称反整合，见图5.3.7。但在反整合过程中，若发生在非正常配对区域，那么游离出来的F因子将携带部分染色体片段，造成细胞的染色体发生缺失，而F因子也缺失一段DNA，此时的F因子称Fˊ因子。此时的细胞称为初生Fˊ细胞，因为Fˊ因子携带一段染色体DNA，所以，Fˊ因子对初生Fˊ细胞是必需的。当初生Fˊ细胞与F–细胞发生接合，则使F–细胞成为次生Fˊ细胞。次生Fˊ细胞中的F因子可能不完整，因为在反整合时失去了一段DNA，但少数染色体基因有两套，成为部分双倍体，此时的Fˊ因子对次生Fˊ细胞不是必需的。如果次生Fˊ细胞中Fˊ因子发生整合和错误的反整合，就有可能使供体菌的某些基因，重组进入受体菌的染色体中。这个过程类似于细菌转导，但它是以F因子为供体基因携带者，且受体细胞与供体细胞需直接接触，所以，人们将这种基因重组的方式称为F因子转导。 因为F因子可在细菌的染色体多位点整合，所以F因子转导可实现不同基因的转移和重组。 5.3.2.3 转导（Transduction） 借助温和型噬菌体为媒介，把供体细胞中DNA片段携带到受体细胞中，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称转导。获得新遗传性状的受体细胞称为转导子（transductant）。转导过程不需要细胞接触，而是以噬菌体为载体。 转导主要分为普遍性转导和局限性转导两种类型。 普遍性转导（Generalized transduction） 由于温和型噬菌体携带（而非整合）了供体菌染色体片段，当它去感染受体菌时，使后者获得这部分遗传性状的现象称为普遍性转导。 1952年J.Lederberg为验证沙门氏菌属中是否存在着接合现象，把鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的两株营养缺陷型——LA-22(try -) 和LA-2(his-)在基本培养基上混合培养，结果在107细胞中得到约100个原养型菌落。通过U形管实验发现，这一过程并不需要两个菌株间直接接触，而是通过一种“可滤过因子”（FA）为媒介而实现的。经过深入研究，证明这种“可滤过因子”就是一种温和型噬菌体（P22）。
图5.3.9 证实转导现象的U形管实验 U形管实验如图5.3.9所示。U形管的两端与真空泵相连，管的中间用烧结玻璃滤板隔开，它只允许液体和比细菌小的颗粒通过。管的右臂放溶源性细菌LA-22（受体），左臂放敏感菌LA-2（供体）。然后用泵交替抽吸，使两端的液体来回流动。结果在LA-22端出现了原养型的个体（his+,try+）。经研究后发现是溶源性菌株LA-22 中少数细胞在培养过程中自发释放出温和型噬菌体P22，它通过滤板感染另一端的敏感菌株LA-2，当LA-2裂解后，产生大量的“可滤过因子”，其中极少数在成熟过程中包裹了LA-2的DNA片段(含try+基因)，并通过滤板再度感染LA-22的细胞群体，使极少数(10-6(10-8)的LA-22获得新的基因，再经重组后，得到原养型（his+,try+）的转导子。
图 5.3.10鼠伤寒沙门氏菌的普遍性转导 （　(代表野生型性状，即图中的B+；(代表缺陷型的性状，即图中的B--） 因为鼠伤寒沙门氏菌噬菌体P22有可能携带LA-2基因组中任何一部分DNA片段，所以，它属于普遍性转导，该过程的细节见图5.3.10。
图5.3.11 外来DNA片段通过双交换而形成转导子
图5.3.12流产转导的示意图 普遍性转导中，供体染色体片段与受体染色体需经过两次交换，才可能形成稳定的转导子，见图5.3.11。若转导获得的供体染色体片段不发生交换和重组，也不迅速从受体菌体内消失，只是进行转录和翻译，这种现象称为流产转导(abortive transduction)。流产转导后，受体细胞中开始带有供体细胞的遗传性状，但是，随着受体细胞分裂，细胞质稀释，供体菌的性状逐渐消失，见图5.3.12。 局限性转导（Restricted transduction） 局限性转导是指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象。已知当温和噬菌体感染受体菌后，它的DNA会开环，并以线状形式整合到宿主染色体的特定位点上，从而使宿主细胞溶源化，同时获得对相同温和噬菌体的免疫性。若溶源菌被诱导而发生裂解时，就有极少数（约10-5）的原噬菌体发生不正常切离，其结果会将插入位点两侧之一的部分宿主基因（如大肠杆菌(前噬菌体的两侧分别是发酵半乳糖的gal基因和合成生物素的bio基因）连接到噬菌体的DNA上，而噬菌体也将相应的一段DNA留在宿主的染色体上，通过衣壳的“误包”，就形成了一个特殊的噬菌体-缺陷噬菌体（defective phage），见图5.3.13。它们除含大部分自身的DNA外，缺失的基因被几个原来位于前噬菌体整合位点附近的宿主基因取代。在大肠杆菌K12中，可形成(dgal（带有供体菌gal 基因的(缺陷噬菌体，此处d表示缺陷）或(dbio（带有供体菌bio基因的(缺陷噬菌体），它们没有正常(噬菌体所具有的使宿主溶源化和增殖的能力。如果将普遍性转导的噬菌体称为“完全缺陷噬菌体”的话，则可把局限性转导的噬菌体称为“部分缺陷噬菌体”。 普遍性转导与局限性转导的比较见表5.3.2。
图5.3.13 正常(噬菌体和转导半乳糖（gal）的缺陷型噬菌体((dg)的形成过程 1. (前噬菌体经正常切割，形成完整的(噬菌体；2. (前噬菌体经不正常切割，将宿主染色体的gal 基因连在噬菌体DNA上，并相应地将自身一段DNA留在宿主染色体上，形成缺陷型噬菌体 局限性转导又可分为低频转导和高频转导两种情况： （1）低频转导（low frequency transduction LFT）当部分缺陷噬菌体（如(dgal或(dbio）感染另一个宿主（即受体菌）并整合到其核基因组中时，可使受体细胞成为一个局限转导子（即获得了供体菌的gal或bio基因）。即(dgal感染受体菌大肠杆菌K12gal-(不发酵半乳糖的营养缺陷型)群体时，gal+导入了少数受体菌, 通过交换和重组，最终形成少数稳定的gal+转导子。因为宿主染色体发生不正常切离的频率很低，因此，在裂解物中所含的部分缺陷噬菌体的比例极低（10-4(10-6）,在低感染复数情况下感染宿主，可以获得极少量的局限转导子，故称低频转导。 （2）高频转导（high frequency transduction, HFT）当大肠杆菌gal-受体菌用高感染复数的LFT裂解物进行感染，则凡感染有(dgal噬菌体的任一细胞，几乎都同时感染了野生型的正常噬菌体。这时，这两种噬菌体可同时整合到一个受体菌的染色体组上，并使它成为双重溶源菌（double lysogen）。当双重溶源菌被紫外线等诱导时，它所携带的正常噬菌体（称辅助噬菌体，helper phage）基因可补偿缺陷噬菌体所缺失基因的功能，因而两种噬菌体同时获得复制。由此产生的裂解物中，大体含有等量的(和(dgal噬菌体。如果用它去感染受体菌大肠杆菌K12gal-，就可高频率地获得稳定的gal+转导子。故称高频转导。 转导现象在自然界普遍存在。在低等生物的进化过程中，它可能是产生新基因组合的一种途径。 表5.3.2 普遍性转导与局限性转导的比较 转导的基因 噬菌体寄生的位置 寄主染色体组入噬菌体的时间  普遍性转导 供体细胞染色体或染色体 外的任何基因 不结合在寄生染色体 特定位置上 在噬菌体裂解周期的营养期  局限性转导 供体染色体上与原噬菌体紧密联锁的少数特定基因 结合在寄生染色体 特定位置上 在原噬菌体期诱导前插入        获得转导噬菌体的方法 转导子的区别   普遍性转导 通过敏感菌的裂解或溶原菌的诱导 一般稳定，非溶原性（不表现任何噬菌体的性状，包括免疫性）   局限性转导 紫外线诱导溶原菌获得 一般不稳定，呈缺陷溶原性，（对同原噬菌体有免疫性，但不表现其它噬菌体的性状）。    还有一种与转导相似的现象，叫溶原转变(lysogenic conversion)。当温和性噬菌体感染宿主而使它发生溶原化，因噬菌体的基因整合到宿主基因组上，使后者获得除免疫性以外性状的现象称为溶原转变。宿主失去原噬菌体后，所获得的性状就会消失。这里的噬菌体不携带任何供体基因，并且是完整无缺的。以上特点与转导不同，例如：不产毒素的白喉棒杆菌被(噬菌体感染而发生溶原化后，会变成产白喉毒素的菌株。 5.3.2.4转化（transformation） 某一基因型的细胞直接从周围介质中吸收另一基因型细胞的DNA，并将它整合到自己的基因组中，造成基因型和表型发生相应变化的现象称为转化。 转化现象在原核生物中普遍存在，如在前述的Griffith的转化实验中，S-II型肺炎链球菌的DNA转化了R-II型的肺炎链球菌，使后者成为S-II型的肺炎链球菌。在少数真核微生物如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粗糙脉孢霉(Neuraspora crassa)和黑曲霉(Aspergillus niger)中也有转化的报道。 两个菌种的菌株间能否在菌体间发生转化与它们在进化中亲缘关系有关。但即使在转化率极高的那些种中，不同的菌株间也不一定都能发生转化。研究表明能被转化的细胞还必须是感受态（competence）细胞。所谓感受态就是指细胞能从周围环境吸收DNA分子，将其整合入自己的基因组，并保证不被体内DNA酶破坏的生理状态。它与受体细胞的遗传性、生理状态、菌龄和培养条件等因素有关。肺炎链球菌的感受态出现在生长曲线中的对数生长期的后期，而芽孢杆菌的一些菌种大多出现在对数生长期末及稳定期。加入环腺苷酸（cAMP）或Ca++可提高感受态水平。如cAMP可使嗜血杆菌细胞群体的感受态水平提高一万倍。 实现转化所需的DNA浓度是极低的，例如在群体中含有15%感受态细胞的情况下，每毫升细胞悬液只要有0.1微克DNA就能有效地发生转化。 现已分离到感受态因子，它是一种胞外蛋白，可能存在于细胞膜中。它的作用可能是催化外来DNA吸收过程或降解细胞膜中某些成分，让细胞表面的DNA受体成分显露出来。 感受态细胞表面结构等条件更适合吸收外来DNA，其吸附能力比一般的细胞大1000倍以上，而且吸收速度快。 被转化因子一般是分子量107道尔顿的DNA片段，约含50个基因。太短则不能转化。而且单链DNA的转化活性较低，一般应该具有完整的双螺旋结构。据报道，呈质粒形式（双链，共价闭合环状DNA）的转化因子的转化效率最高，因为它进入受体菌后，可不必与受体染色体进行交换、整合即可进行复制和表达。 转化的过程如图5.3.14所示。双链DNA与感受态细胞表面的特定位点吸附，几分钟后，DNA的一条单链被降解，另一条单链进入受体细胞，并与受体细胞染色体DNA的同源部分配对，接着受体染色体上相应单链片段被切除，并被外来的单链DNA交换、整合和取代，形成杂种DNA，见图5.3.15。在复制并发生分离后，一个受体菌成为转化子，另一个受体菌为非转化子。 除DNA单链进入受体细胞而被整合外，有人发现DNA还可以双链形式进入受体细胞，形成部分双倍体转化子。 如果将病毒的DNA（或RNA）人为地抽提分离出来，用它来感染感受态的受体细胞，并进而产生正常病毒的后代，这种特殊的“转化”方式称为“转染”（transfection）。转染过程中温和性病毒带有原宿主的DNA 片段，进入受体细胞后发生重组。转染常在基因工程中被用于以病毒为载体的外源基因导入宿主细胞的过程。 自然环境中，原核生物的基因重组现象发生的频率较低，通过人为施加影响可以促使其提高发生的频率。人为的方法较常用于转化。可以采用细胞壁局部酶解或加入Ca2+和PEG（聚乙二醇）等化学方法促进转化过程；也可以采用一些机械方法，如将细胞置于含有供体DNA片段的脉冲电场中，在电场中细胞膜上出现小孔，DNA随即进入细胞，这一过程称为电穿孔技术（electroporetion）；也有采用微弹枪技术（particle gun），象普通鸟枪一样，将带有供体核酸的微弹，射入受体细胞。这些方法已成功地用于动植物细胞以及不能正常发生转化的细菌转化。
图5.3.14 转化过程的示意图
图5.3.15 转化中单链外基因组片段和双链内基因组间整合过程示意图 1.带abc标记的单链外基因组的DNA片段靠拢带ABCDE标记的双链DNA分子。AB间出现裂口；2.部分；双链解开，单链与双链配对；3.和4.外切核酸酶从DNA的3’末端进行酶解；5.通过聚合酶和连接酶形成重组后的DNA分子，其中有一条链上带有AbcDE新标记 5.4 原生质体融合（Protoplast Fusion） 原生质体融合是通过人工方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程，亦可称为“细胞融合”（cell fusion）。原生质体融合技术始于1976年,最早是在动物细胞实验中发展起来的，后来，在酵母菌、霉菌、高等植物、以及细菌和放线菌中也得到了应用。原生质体融合技术是继转化、转导和接合等微生物基因重组方式之后，又一个极其重要的基因重组技术。应用原生质体融合技术后，细胞间基因重组的频率大大提高了，在某些例子中，原生质体的重组频率已大于10-1(而诱变育种一般仅为10-8)。如今，能借助原生质体融合技术进行基因重组的细胞极其广泛，包括原核微生物、真核微生物以及动植物和人体的细胞。发生基因重组亲本的选择范围也更大了，原来的杂交技术一般只能在同种微生物之间进行，而原生质体融合可以在不同种、属、科，甚至更远缘的微生物之间进行。这为利用基因重组技术培育更多、更优良的生产菌种提供了可能。 微生物原生质体融合的一般原理和过程见图5.4.1。主要步骤为：选择亲株、制备原生质体、原生质体融合、原生质体再生及筛选优良性状的融合子。
图5.4.1 原生质体融合技术示意图 5.4.1选择亲株 为了获得高产优质的融合子，首先应该选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株。同时，为了能明确检测到融合后产生的重组子并计算重组频率，参与融合的亲株一般都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型或抗药性等。可以通过诱变剂对原种进行处理来获得这些遗传标记。在进行原生质体融合前，应先测定菌株各遗传标记的稳定性，如果自发回复突变的频率过高，应考虑该菌株是否适用。 5.4.2原生质体制备 去除细胞壁是制备原生质体的关键。一般都采用酶解法去壁。根据微生物细胞壁组成和结构的不同，需分别采用不同的酶，如溶菌酶，纤维素酶，蜗牛酶等。有时需结合其它一些措施，如在生长培养基中添加甘氨酸、蔗糖或抗生素等，以提高细胞壁对酶解的敏感性。一些微生物的去壁方法见表5.4.1。 革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖组成。溶菌酶是一种内-N-乙酰胞壁酰胺酶，能切开肽聚糖中N-乙酰氨基葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的(-1,4-糖苷键。溶菌酶能溶解微球菌、枯草杆菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰氏阳性菌的细胞壁。而溶菌酶对革兰氏阴性菌不能直接溶壁，只有当乙二胺四乙酸（EDTA）存在时，某些革兰氏阴性菌的细胞壁才能够被溶菌酶溶解。溶菌酶不能溶解金黄色葡萄球菌的细胞壁，而表皮葡萄球菌能产生一种内肽酶——葡萄球菌素（Lysostaphin）可以切开肽聚糖中肽的连键，可以用于溶解葡萄球菌的细胞壁。放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌也可采用溶菌酶。 真菌细胞壁主要由纤维素、几丁质和葡聚糖等组成。青霉菌多用纤维素酶和(-1,3-糖苷酶等溶壁；曲霉用(-1,3-糖苷酶和(-1,4-糖苷酶等。不同菌种往往需要不同的酶或多种酶混合使用才能达到较好的溶壁效果；蜗牛酶能较好地溶解酵母菌细胞壁中的葡聚糖和几丁质等成分。 表5.4.1 一些微生物的去壁方法 微生物 细胞壁主要成分 去壁方法  革兰氏阳性菌 芽孢杆菌 葡萄球菌 链霉菌 小单胞菌 肽聚糖  溶菌酶处理 溶葡萄球菌素处理 溶菌酶处理（菌丝生长时补充0.5~5.0%甘氨酸或10~34%蔗糖） 溶菌酶处理（菌丝生长时补充0.2~0.5%甘氨酸）  革兰氏阴性菌 大肠杆菌 碱性普罗委登斯菌 黄色短杆菌 肽聚糖和脂多糖  溶菌酶和EDTA处理 溶菌酶和EDTA处理 溶菌酶处理（生长时补充0.41M蔗糖及 0.3u/ml青霉素）  霉菌 纤维素和几丁质 纤维素酶或真菌中分离的溶壁酶  酵母菌 葡聚糖和几丁质 蜗牛酶   在菌体生长的培养基中添加甘氨酸，可以使菌体较容易被酶解。甘氨酸的作用机理并不十分清楚，有人认为甘氨酸渗入细胞壁肽聚糖中代替D-丙氨酸的位置，影响细胞壁中各组分间的交联度。不同菌种对甘氨酸的最适需求量各不相同。在菌体生长阶段添加蔗糖也能提高细胞壁对溶菌酶的敏感性。蔗糖的作用可能是扰乱了菌体的代谢，最适的蔗糖添加浓度随不同菌种而变化。因为青霉素能干扰肽聚糖合成中的转肽作用，使多糖部分不能交联，从而影响肽聚糖的网状结构的形成，所以，在菌体生长对数期加入适量青霉素，就能使细胞对溶菌酶更敏感。 菌龄也是影响溶壁的因素之一。一般处于对数生长中期细胞的细胞壁中肽聚糖含量很低，对溶菌酶敏感。 原生质体对渗透压极其敏感，低渗将引起细胞破裂。一般是将原生质体放在高渗的环境中以维持它的稳定性。对于不同微生物，原生质体的高渗稳定液组成也是不同的。如细菌的稳定液常用SMM液（用于芽孢杆菌原生质体制备和融合，其主要成分是蔗糖0.5M, 顺丁烯二酸0.02M, MgCl20.02M）和DF液（用于棒状杆菌原生质体制备和融合，主要成分是蔗糖0.25M, 琥珀酸0.25M, EDTA0.001M, K2HPO40.02M, KH2PO40.11M , MgCl2 0.01M）。在链霉菌中用得较多的是P液（主要成分蔗糖0.3M, MgCl20.01M, CaCl20.25M及少量磷酸盐和无机离子）。真菌中广为使用的是0.7M NaCl或0.6M MgSO4溶液，它们使原生质体内空泡增大，浮力增加，易与菌丝碎片分开。 5.4.3原生质体融合 早期的原生质体融合实验中，曾采用离心力作用使两种细胞的原生质体紧紧挤在一起以帮助融合，或者在冷的渗透稳定剂中使原生质体密集凝聚，但这些方法的效果不佳。后来有人发现聚乙二醇（PEG）能有效地促进原生质体融合。PEG促进原生质体融合的机理并不清楚，有人推测助融作用可能与下列过程有关：开始由于强烈的脱水而使原生质体粘在一起，并形成聚合体。原生质体收缩并高度变形，使原生质体之间的接触面增大，细胞膜结构发生紊乱，从而加大了细胞膜的流动性，膜内的蛋白质和糖蛋白相互作用和混合，使紧密接触的原生质体相互融合。但是，PEG对细胞尤其是原生质体有一定的毒害作用，因此作用的时间一般不宜过长。微生物的原生质体只需要与PEG接触一分钟，就应尽快加入缓冲液进行稀释。PEG有不同的聚合度，在细菌原生质体融合中，多采用高分子量的PEG（如PEG6000）, 对放线菌则可采用各种分子量的PEG。一般PEG的使用浓度范围在25-40%。另外，紫外线照射或脉冲电场等物理因素处理也能促进原生质体融合。 5.4.4原生质体再生 原生质体再生就是使原生质体重新长出细胞壁 ，恢复完整的细胞形态结构。不同微生物的原生质体的最适再生条件不同，甚至一些非常接近的种，最适再生条件也往往有所差别，如再生培养基成分及培养温度等。但最重要的一个共同点是都需要高渗透压。 能再生细胞壁的原生质体只占总量的一部分。细菌一般再生率为3-10%。但有资料报道，在再生培养基中添加牛血清白蛋白，可使枯草杆菌原生质体的再生率达100%。真菌再生率一般在20-80%。链霉菌再生率最高可达50%。 为获得较高的再生率，在实验过程中应避免因强力使原生质体破裂。再生平板培养基在涂布原生质体悬液前，宜预先去除培养基表面的冷凝水。涂布时，原生质体悬液的浓度不宜过高。因为若有残存的菌体存在，它们将会率先在再生培养基中长成菌落，并抑制周围原生质体的再生。另外，菌龄、再生时的温度、溶菌酶用量和溶壁时间等因素都会影响原生质体的再生。 5.4.5 筛选优良性状融合重组子 原生质体融合后，来自两亲代的遗传物质经过交换并发生重组而形成的子代称为融合重组子。这种重组子通过两亲株遗传标记的互补而得以识别。如两亲株的遗传标记分别为营养缺陷型A+B和A-B+，融合重组子应是A+B+或A-B-。重组子的检出方法有两种：直接法和间接法。直接法将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生长因子的高渗再生培养基平板上，直接筛选出原养型重组子；间接法把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，使亲株和重组子都再生成菌落 ，然后用影印法将它们复制到选择培养基上检出重组子。从实际效果来看，直接法虽然方便，但由于选择条件的限制，对某些重组子的生长有影响。虽然间接法操作上要多一步，但不会因营养关系限制某些重组子的再生。特别是对一些有表型延迟现象的遗传标记，宜用间接法。若原生质体融合的两亲株带有抗药性遗传标记，可以用类似的方法筛选重组子。 融合重组的频率可用下式表示： 融合重组子 融合重组频率= ((((((((((( 两亲株原生质体再生菌落的总数 原生质体融合后，两亲株的基因组之间有机会发生多次交换，产生多种多样的基因组合，从而得到多种类型的重组子，而且参与融合的亲株数不限于两个，可以多至三、四个。这些都是常规杂交育种不可能达到的。 以上获得的还仅仅是融合重组子，还需要对它们进行生理生化测定及生产性能的测定，以确定它是否是符合育种要求的优良菌株。 原生质体融合技术也可以改善传统诱变育种的效果。因为去除了细胞壁的障碍，诱变剂的诱变效率将提高，特别对于那些本来对诱变剂反应迟钝的微生物。一些不产孢子的丝状微生物菌丝体呈多核状态，对诱变极为不利，应该去除细胞壁，使它成为单核状态的原生质体。 5.5 基因工程（gene engineering） 基因工程是用人为的方法将所需的某一供体生物的遗传物质DNA分子提取出来，在离体条件下切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，让外来的遗传物质在其中进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。 基因工程的主要过程见图5.5.1。 获得特定的目标基因 载体（质粒或病毒） 核酸内切酶切割 核酸内切酶切割 目标基因片段 质粒DNA片段 ( 细胞外重组 重组DNA ( 转化（质粒）、转导或转染（病毒） 重组DNA进入受体细胞并扩增、表达 (利用遗传标记筛选 具目标基因表达功能的重组体 图5.5.1基因工程的主要过程 目标基因可以从酶切的供体细胞染色体碎片中获得，或首先提取目标产物的mRNA，然后将其反转录合成cDNA而获得，或从目标蛋白的氨基酸顺序推测出基因的碱基顺序，人工合成DNA片段。 将目标基因的两端和载体DNA的两端用特定的核酸内切酶酶切后，让它们连接成环状的重组DNA。因为这是在细胞外进行的基因重组过程，所以，有人将基因工程又称为体外重组DNA技术。 以质粒为载体的重组体DNA可以通过转化进入受体细胞，而用噬菌体为载体的重组DNA可以通过转导或转染进入受体细胞。 重组DNA在受体细胞中将自主复制扩增。多拷贝的重组DNA将有利于积累更多的目标产物。 虽然基因工程的操作有着非常强的方向性，但是，最终获得的并非是目标重组体的纯培养物，因为还有许多其它的细胞存在，如：目标基因可能没有被重组、重组的目标基因可能是反向的、重组DNA无法稳定存在于受体细胞中等。所以，筛选仍然是基因工程育种工作中的重要内容。因为在载体DNA中可以较容易地设置多种特定遗传标记（如药物抗性标记），因此筛选工作的目标性和有效性很高，是其它育种工作所无法比拟的。 目前，基因工程的应用已不是理想，而是现实。已不只是实验室中的研究，而是有大量基因工程产品已经商品化生产。微生物的育种已进入了崭新的革命时代。 回顾微生物育种方式的历史，可发现育种的手段和技术不断发展。最早人们认为微生物可“驯化”，出现一种“定向培育”技术。后来随着对遗传变异现象认识的深入出现了诱变育种，通过诱变剂促进突变频率的提高，但这种方法有很大的盲目性，基因变异的程度也有限，特别是经过长期诱变处理，产量上升变得越来越缓慢，甚至无法继续提高。 几乎与诱变育种在同一时期，由于对微生物有性生殖、准性生殖、转化及转导接合等现象的研究，出现了杂交育种即基因重组技术。因为是在已知不同性状的亲本间杂交，所以方向性和自觉性比诱变育种更进了一步。但杂交育种方法较复杂，而且需要有合适的亲本（亲本间应具有能互补的优良遗传性状及亲本间有性的亲和性）。 1976年开始，原生质体融合进一步发展了杂交育种技术，它可使一些未发现有转化、转导和接合等现象的原核生物之间，及微生物不同种、属、科间甚至更远缘的微生物的细胞间进行融合，获得新物种。但原生质体融合的难度也很大，并非每次都能成功。 70年代出现的基因工程给微生物育种带来了革命。它不同于传统的育种方法，所创造的新物种是自然演化中不可能发生的组合。这是一种自觉的、能象工程一样事先设计和控制的育种技术，可以完成超远缘杂交，是最新最有前途的育种方法。但是，基因工程的应用仍有很大的局限性。基因工程产品主要还是一些较短的多肽和小分子蛋白质（见第十一章）。因为基因工程的实施首先需要对生物的基因结构和顺序有充足的认识，而我们对基因的了解还十分有限，蛋白质类以外的发酵产物（如糖类、有机酸、核苷酸及次级代谢产物）产生往往受到多个基因的控制，尤其是还有许多发酵产物的代谢途径还没有被确证，所以，对于这些产物，基因工程（包括代谢工程）还难以完全取代传统的菌种选育方法。 目前，我们已可以通过基因工程手段，将已知的控制产物的调控基因进行改造，或将有关的调控基因或有关代谢途径中的酶的基因导入菌体，也可以加强代谢途径中有关酶的表达，以提高发酵产量或生产新产品，这就是所谓的代谢工程，见第十一章。 5.6 菌种筛选方法 所有的微生物育种工作都离不开菌种筛选。尤其是在诱变育种工作中，筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤。经诱变处理后，突变细胞只占存活细胞的百分之几，而能使生产状况提高的细胞又只是突变细胞中的少数。要在大量的细胞中寻找真正需要的细胞，就象是大海捞针，工作量很大。简洁而有效的筛选方法无疑是育种工作成功的关键。 为了花费最少的工作量，在最短的时间内取得最大的筛选成效，就要求采用效率较高的科学筛选方案和手段。因为诱变育种中的筛选工作最复杂，所以，本节主要讨论诱变育种的筛选方法，这些方法也为其它育种方法的筛选提供了借鉴。 5.6.1菌种筛选方案 在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。如在工作量限度为200只摇瓶的具体条件下，为了取得最大的效果，有人提出以下的筛选方案： 第一轮： 诱变剂处理 初筛 一个出发菌株(((( 选出200个单孢子菌株 ((((选出50株 （每株1瓶） 复筛 (((( 选出5株 （每株4瓶） 第二轮： 40株 诱变剂处理 40株 初筛 复筛 5个出发菌株(((( 40株 (((( 选出50株((((选出5株 40株 （每株1瓶） （每株4瓶） 40株 第三轮、第四轮…(.(操作同上)。 初筛和复筛工作可以连续进行多轮，直到获得较好的菌株为止。采用这种筛选方案，不仅能以较少的工作量获得良好的效果，而且，还可使某些眼前产量虽不很高，但有发展前途的优良菌株不致于落选。 筛选获得的优良菌株还将进一步做工业生产试验，考察它们对工艺条件和原料等的适应性及遗传稳定性。 5.6.2 菌种筛选的手段 筛选的手段必需配合不同筛选阶段的要求，对于初筛，要力求快速、简便，对于复筛，应该做到精确，测得的数据要能够反映将来的生产水平。 从菌体形态变异分析 有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。当然，这种鉴别方法只能用于初筛。有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)的变异菌落，发现高产菌株的菌落形态有以下特点：菌落直径呈中等大小（8-10毫米），凡过大或过小者均为低产菌株；色泽深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株。又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉(Penicillium urticae)的育种中，曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高，而在赤霉素生产菌藤仓赤霉（Gibberella fujikuroi）中，却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。 平皿快速检测法 平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的“形态”变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，见图5.6.1。这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。
图 5.6.1 平皿快速检测法示意图 平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分分散，形成单菌落，以避免多菌落混杂一起，引起“形态”大小测定的偏差。 1) 纸片培养显色法 将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中，用牛津杯架空，下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。 变色圈法 将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养，或喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面，在菌落周围形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液，使其呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应。变色圈越大，说明菌落产酶的能力越强。而从变色圈的颜色又可粗略判断水解产物的情况。 透明圈法 在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。将待筛选在菌落周围就会形成透明圈，透明圈的大小反映了菌落利用此物质的能力。 在培养基中掺入可溶性淀粉、酪素或CaCO3可以分别用于检测菌株产淀粉酶、产蛋白酶或产酸能力的大小。 生长圈法 利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，若待分离的菌在缺乏上述营养物的条件下，能合成该营养物，或能分泌酶将该营养物的前体转化成营养物，那么，在这些菌的周围就会有工具菌生长，形成环绕菌落生长的生长圈。 该法常用来选育氨基酸、核苷酸和维生素的生产菌。工具菌往往都是对应的营养缺陷型菌株。
图5.6.2 琼脂块培养法操作示意图 抑制圈法 待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质，或能分泌某种酶并将无毒的物质水解成对工具菌有毒的物质，从而在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈。例如：将培养后的单菌落连同周围的小块琼脂用穿孔器取出，以避免其它因素干扰，移入无培养基平皿，继续培养4-5天，使抑制物积累，此时的抑制物难以渗透到其它地方，再将其移入涂布有工具菌的平板，每个琼脂块中心间隔距离为2厘米，培养过夜后，即会出现抑菌圈。抑菌圈的大小反映了琼脂块中积累的抑制物的浓度高低。该法常用于抗生素产生菌的筛选，工具菌常是抗生素敏感菌。由于抗生素分泌处于微生物生长后期，取出琼脂块可以避免各菌落所产生抗生素的相互干扰。典型的例子是春雷霉素生产菌的筛选，见图5.6.2。 5.6.2.3 摇瓶培养法 摇瓶培养法是将待测菌株的单菌落分别接种到三角瓶培养液中，振荡培养，然后，再对培养液进行分析测定。摇瓶与发酵罐的条件较为接近，所测得的数据就更有实际意义。但是摇瓶培养法需要较多的劳力、设备和时间，所以，摇瓶培养法常用于复筛。但若某些突变性状无法用简便的形态观察或平皿快速检测法等方法检测时，摇瓶培养法也可用于初筛。 初筛的摇瓶培养一般是一个菌株只做一次发酵测定，从大量菌株中选出10-20%较好的菌株，淘汰80-90%的菌株；而复筛中摇瓶培养一般是一个菌株培养3瓶，选出3-5个较好的菌株，再做进一步比较，选出最佳的菌株。 5.6.3 特殊变异菌的筛选方法 上述一般的筛选菌株方法的处理量仍是很大的，为了从存活的每毫升106左右细胞的菌悬液中筛选出几株高产菌株，要进行大量的稀释分离、摇瓶和测定工作。虽然平皿快速检测法作为初筛手段可减少摇瓶和测定的工作量，但稀释分离的工作仍然非常繁重。而且有些高产变异的频率很低，在几百个单细胞中并不一定能筛选到，所以，建立特殊的筛选方法是极其重要的。例如营养缺陷型和抗性突变菌株的筛选有它们的特殊性，营养缺陷型或抗性突变的性状就象一个高效分离的“筛子”，以它为筛选的条件，可以大大加快筛选的进程并有效地防止漏筛。在现代的育种中，常有意以它们作为遗传标记选择亲本或在DNA中设置含这些遗传标记的片段，使菌种筛选工作更具方向性和预见性。本节还将简单介绍其它一些特殊变异株的筛选方法。 5.6.3.1营养缺陷型突变株的筛选 经诱变处理后的菌悬液在筛选前一般应先进行诱变后培养，以促使变异细胞发生分离，防止出现表型延迟现象，筛选出不纯的菌株。营养缺陷型的筛选一般包括浓缩、进一步检出和鉴别营养缺陷型等步骤。 1) 浓缩营养缺陷型菌株 诱变后的细胞群体中大部分存活菌是野生型，而营养缺陷型占的比例相当小，这对分离是很不利的，所以，应该淘汰大量的野生型，以达到浓缩营养缺陷型的目的。常用的浓缩方法有抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。 （1）抗生素法 青霉素可抑制细菌细胞壁合成，杀死生长中的细菌。制霉菌素可与真菌细胞膜上固醇反应而改变膜通透性，杀死生长中的酵母菌和霉菌等真菌。这些抗生素对于休止状态的微生物不起作用。将诱变处理后的细菌或真菌培养在含青霉素或制霉菌素的基本培养基中，营养缺陷型不能生长，抗生素对其没有影响，但野生型可以在基本培养基中生长，从而被抗生素杀死。达到淘汰大量野生型的目的。 为了防止营养缺陷型菌株在基本培养基中利用自身体内的营养生长而被“误杀”，应在接入基本培养基前，先洗涤，再用基本培养基或无氮培养基中饥饿培养1-2小时，以耗尽体内养分，然后再加抗生素。为了防止野生型细胞被杀死后细胞破裂自溶给营养缺陷型菌株提供所需养分，在加抗生素的同时，应加入高渗物质，如20%蔗糖，使环境的渗透压提高，避免细胞破裂，抗生素处理的时间也宜短。 (2) 菌丝过滤法 此法适于淘汰丝状菌的野生型。诱变后的孢子悬浮培养在液体基本培养基中，只有野生型才能生长，振荡培养若干小时后，很容易用过滤器过滤除去这些菌丝，营养缺陷型的孢子一般不能萌发，或虽能萌发却不能长成菌丝，从而得到浓缩。振荡培养和过滤应重复几次，每次培养时间不宜过长，这样才能收到充分浓缩的效果。 如果出发菌株不是野生型而是缺陷型或其它性状的菌株，淘汰野生型仍可应用以上方法，但在基本培养基中应补加使出发菌生长的营养物质，例如以苏氨酸营养缺陷型菌株为出发菌株诱变选育其它营养缺陷标记时，采用苏氨酸补充培养基，使出发菌株正常生长而遭淘汰。 (3) 差别杀菌法 细菌的芽孢远比营养体耐热。使经诱变剂处理的细菌形成芽孢，把芽孢在基本培养液中培养一段时间，然后加热（例如80℃，15分钟）杀死营养体。由于野生型芽孢能萌发，所以被杀死，营养缺陷型芽孢不能萌发，因此得以存活并被浓缩。 酵母菌的孢子虽不象细菌芽孢那样耐热，但比起它们的营养体来也比较耐热，能够用同样方法（58℃，4分钟）浓缩营养缺陷型。 (4) 饥饿法 一些营养缺陷型在某些培养条件下，会自行死亡，可是如果该细胞又发生另一营养缺陷型突变，细胞反而避免了死亡，从而得到浓缩。如胸腺嘧啶缺陷型细菌在不给胸腺嘧啶的情况下短时间内就会大量死亡，在残留下来的细菌中有许多营养缺陷型，胸腺嘧啶缺陷型丧失了合成DNA的能力，但仍具有合成蛋白质的能力，这种代谢不平衡状态可能是死亡的原因。发生另一个氨基酸缺陷型突变就使它们丧失了合成蛋白质的能力，这种代谢上的平衡状态可以使它避免死亡。 另一个例子是大肠杆菌的二氨基庚二酸缺陷型。二氨基庚二酸是大肠杆菌合成赖氨酸和细胞壁物质的前体。该缺陷型在不给以赖氨酸的情况下不生长也不死亡，这是因为它既不能合成细胞壁物质、也不能合成蛋白质的缘故。可是在给以赖氨酸的情况下，这时它能合成蛋白质，可是仍然不能合成细胞壁物质，它反而在短时间内大量死亡。这种情况正象细菌在含有青霉素的培养基中生长一样。 如果二氨基庚二酸缺陷型细胞中发生另一个氨基酸缺陷型突变，那么它又丧失了合成蛋白质的能力，代谢作用又恢复到平衡状态，这时即使给以赖氨酸也不会死亡。所以在赖氨酸的培养基中可以分离到各种氨基酸缺陷型。在粗糙脉孢菌和酵母菌中利用肌醇缺陷型及在构巢曲霉中利用生物素缺陷型，都可以通过饥饿法筛选到许多营养缺陷型。 2)进一步检出所需缺陷型 浓缩后的菌液中营养缺陷型的比例较大，但并非全部都是。并且营养缺陷型中也有不同的类型，还需要进一步检出所需要的营养缺陷型。这样就需要采用逐个检出法、夹层培养法和限量补给法等方法进一步检出所需要的营养缺陷型。 (1) 逐个检出法 先将菌液稀释涂布于完全培养基上，培养长成单菌落，然后将它们分别定位点种于完全培养基，补充培养基和基本培养基上培养后观察同一菌株在不同培养基中的生长情况。在基本培养基上能长的是野生型；基本培养基上不生长，而在某补充培养基上生长，那是补充物的营养缺陷型。在基本培养基和设定的补充培养基上不生长，而在完全培养基上生长，则是未确定的营养缺陷型，需进一步检测。在基本培养基、补充培养基和完全培养基上都不长，则应检查是否诱变成功。见图5.6.3。
图5.6.3 逐个检出法示意图 影印培养法 基本原理同上。利用影印培养法也可代替逐个检出法中的定位点种，其操作更方便，但每个平皿上的菌落不宜过多，见图5.6.4。
图5.6.4影印培养法 (2)夹层培养法 将基本培养基铺为底层，凝固后加含待分离菌液的基本培养基为中层，培养一段时间，可长出的菌落是野生型的，在平板背面作记号后，再铺一层完全培养基作为上层，培养一段时间后新长出的则是营养缺陷型。一般从菌落大小也可以判断，新长出的菌落较小，即是营养缺陷型。见图5.6.5。
图5.6.5 夹层培养法示意图 (3)限量补给法 将处理后的菌液涂布在含微量（0.01%或更少）蛋白胨的基本培养基上培养，营养缺陷型长得缓慢，呈小菌落；野生型长得较快，呈大菌落。从菌落大小可筛去野生型。 以上这些方法都可以应用于除细菌以外微生物的营养缺陷型检出，不过具体方法往往应随着所研究的对象而改变。例如：在霉菌的营养缺陷型检出中，首先碰到的是菌落的扩散生长问题。在培养基中添加脱氧胆酸钠(0.5%左右)往往可以防止菌丝的蔓延。在合成培养基中用山梨糖作为主要碳源略补充一些蔗糖也可以使菌落长得密而小。另一个困难是影印法检出霉菌的营养缺陷型时，必须等到完全培养基上的菌落产生了孢子才行，可是这时又容易造成污染。因此可在完全培养基上菌落还未产生孢子时，用灭过菌的薄纸贴附在平皿上，等菌丝在纸上生长后，将薄纸移到另一培养皿中，这时菌丝又伸入培养基中，达到复印菌落的目的。 3)营养缺陷型的鉴定 获得的营养缺陷型菌株还应进一步确认其生长的所需物。菌株较少时，可用生长谱法， 若菌株较多时，常采用组合补充培养基法。 (1) 生长谱法 将待测菌接到斜面扩增培养，经离心洗涤除去细胞外吸附的营养物质，再涂布在基本培养基平板，每块平板涂布105个以上的细胞。也可将待测菌与融化的固体基本培养基混合均匀后倒入培养皿，待培养基凝固后，在平板上分区域放置少量不同的营养物或蘸有不同营养物的无菌滤纸片并保温培养。从每种营养物区域内该菌的生长情况，判断其对营养的需求。 测定一般应分两阶段。第一阶段应确定是哪类物质的缺陷型。将滤纸分别蘸取酪素水解液（氨基酸混合液）、水溶性维生素、核酸水解液和酵母浸出汁，等距离地放入平板中。这样形成的生长谱以及由此确定的营养缺陷型类别见图5.6.6。酪素水解液、水溶性维生素、核酸水解液分别对应于氨基酸缺陷型、维生素缺陷型和碱基缺陷型。无论哪种类型的营养缺陷型都能在酵母浸出汁周围生长。
图5.6.6确定缺陷型营养类别示意图 纸片1:氨基酸混合液;纸片2:维生素混合液;纸片3:核酸水解液;纸片4:酵母水解液
图5.6.7 组合营养物生长谱示意图 第二阶段应根据第一阶段确定的范围，再进一步确定是那种具体化合物的缺陷型。如果第一阶段确定是氨基酸缺陷型，那就需要确定是哪一种氨基酸缺陷型。 如果不是有针对性地筛选某几种营养物的缺陷型，那需要做较多的测定。采用组合营养物法可以事半功倍。如已确定是15种营养物质中某一物质的缺陷型，可以将15种物质分成5组（也可将21种物质分6组），见表5.6.1。以五张滤纸分别蘸取该5个组合的混合物，放在涂布受检菌的基本培养基平板上，培养后观察可发现如图5.6.7所示的各种生长谱的可能形式。根据生长谱和营养物组合可以判断菌株的营养缺陷型, 见表5.6.2。例如，根据图中的（1）查表可知，它是营养物13的缺陷型；图中的(2)是营养物2的缺陷型；图中的(3)表明单独的组合A或B均不能满足生长需要，必然是组合A和B中不同的两种或更多种营养物质的缺陷型；图中的(4)显示，纸片上的营养物浓度过高而抑制了纸片A附近菌体的生长，降低营养物浓度，会出现类似(1)、(2)中的生长圈。这是营养物1的营养缺陷型。 表 5.6.1 15种营养物质的组合营养表 组号 组合的营养成分  A B C D E 2 3 4 5 6 7 8 9 7 10 11 12 8 11 13 14 9 12 14 15   如果是多种营养物的营养缺陷型，那就无法用上述的组合营养物法。 (2) 组合补充培养基法 上述的生长谱法一次只能检测某一菌株。若待测菌株较多，则可按上述的营养物质组合，将它们直接添加在培养基中，组成5组补充培养基，将待测的菌点种在各种补充培养基上，逐个分析各菌的缺陷类型。 也可以根据需要，配制一组补充培养基，每一种补充培养基中只缺一种营养物。那么，所有的营养缺陷型都可用它一次性检测，尤其是对于多种营养物质的营养缺陷型。 表5.6.2 生长谱及其对应的营养缺陷因子 生长谱形式 营养缺陷因子 生长谱形式 营养缺陷因子  A B C D E B C A、D 1 6 10 13 15 2 3 4 E B、C B、D B、E C、D C、E D、E 5 7 8 9 11 12 14   5.6.3.2 抗性突变菌株的筛选 抗性突变株的筛选相对比较容易，只要有10–6频率的突变体存在，就容易筛选出来。抗性突变株的筛选常用的有一次性筛选法和阶梯性筛选法两种手段。 1) 一次性筛选法 一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株。 噬菌体抗性菌株常用此方法筛选。将对噬菌体敏感的出发菌株经变异处理后的菌悬液大量接入含有噬菌体的培养液中，为了保证敏感菌不能存活，可使噬菌体数大于菌体细胞数。此时出发菌株全部死亡，只有变异产生的抗噬菌体突变株能在这样的环境中不被裂解而继续生长繁殖。通过平板分离即可得到纯的抗性变异株。 耐高温菌株在工业发酵中的应用意义在于它可以节约冷却水的用量，尤其是在夏季，并能减少染菌的机会。耐高温菌株所产生酶的热稳定性较高，适用于一些特殊的工艺过程。耐高温菌株也常采用此法筛选。将处理过的菌悬液在一定高温下处理一段时间后再分离。对此温度敏感的细胞被大量杀死，残存的细胞则对高温有较好的耐受性。 耐高浓度酒精的酵母菌的酒精发酵能力较高，也适宜提高发酵醪浓度，提高醪液酒精浓度。而耐高渗透压的酵母菌株具有积累甘油的性能，可用于甘油发酵。耐高酒精度、高渗透压的菌株也可分别在高浓度酒精或加蔗糖等造成的高渗环境下一次性筛选获得。 2)阶梯性筛选法 药物抗性即抗药性突变株可在培养基中加入一定量的药物或对菌体生长有抑制作用的代谢物结构类似物来一次性筛选，大量细胞中少数抗性菌在这种培养基平板上能长出菌落。但是在相当多的情况下，无法知道微生物究竟能耐受多少高浓度的药物，这时，药物抗性突变株的筛选需要应用阶梯性筛选法。 因为药物抗性常受多位点基因的控制，所以药物的抗性变异也是逐步发展的，时间上是渐进的，先是可以抗较低浓度的药物，而对高浓度药物敏感，经“驯化”或诱变处理后，可能成为抗较高浓度药物的突变株。阶梯筛选法由梯度平板或纸片扩散在培养皿的空间中造成药物的浓度梯度，可以筛选到耐药浓度不等的抗性变异菌株，使暂时耐药性不高，但有发展前途的菌株不致于被遗漏，所以说，阶梯性筛选法较适合于药物抗性菌株的筛选，特别是在暂时无法确定微生物可以接受的药物浓度情况下。 （1）梯度平板法(Gradient plate) 先将10ml左右的一般固体培养基倒入培养皿中，将皿底斜放，使培养基凝结成斜面，然后将皿底放平，再倒入7-10ml含适当浓度（通过实验来确定）的药物的培养基，凝固后放置过夜。由于药物的扩散，上层培养基越薄的部位，其药物浓度越稀，造成一由稀到浓的药物浓度渐增的梯度，见图5.6.8。再将菌液涂布在梯度平板上，药物低浓度区域菌落密度大，大都为敏感菌，药物高浓度区域菌落稀疏甚至不长，浓度越高的区域里长出的菌抗性越强。在同一个平板上可以得到耐药浓度不等的抗性变异菌株。如果菌体对药物有个耐受临界浓度，则会形成的明显界线。
图5.6.8 梯度平板法示意图 梯度平板法也常用于抗代谢拮抗物突变株的筛选，以提高相应代谢产物的产量。如异烟肼是吡哆醇的代谢拮抗物，两者的分子结构类似，见图5.6.9。根据微生物产生抗药性原理，异烟肼抗性突变有可能是产生了分解异烟肼的酶类，也有可能通过合成更高浓度的吡哆醇来克服异烟肼的竞争性抑制。实验证明多数菌株是发生了后一性质的变异才获得抗性的。这样，通过梯度培养法就可以达到定向培育生产吡哆醇的高产菌株。同样原理，还获得过许多其它有关代谢产物的高产菌株，见表5.6.3。
图5.6.9吡哆醇与代谢拮抗物异烟肼的分子结构 表5.6.3 梯度培养法培育若干代谢产物的生产菌 代谢产物 生产菌 代谢拮抗物  肌苷 肌苷 腺嘌呤 烟碱酸 色氨酸 甲硫氨酸 酪氨酸 亮氨酸 吡咯叠氮 短小芽孢杆菌 棒杆菌 鼠伤寒沙门氏杆菌 衣藻 伤寒沙门氏杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌 伤寒沙门氏杆菌 金色假单胞菌 8-氮鸟嘌呤 6-巯鸟嘌呤 2,6-二氨基嘌呤 3-乙酰吡啶 6-甲基色氨酸 乙硫氨酸 对氟苯丙氨酸 三氯-DL-亮氨酸 6-氟色氨酸   (2) 纸片扩散法 与梯度平板法的原理类似，用打孔器将较厚的滤纸（如新华六号）打成小圆片，并使纸片吸收一定浓度的药物，经干燥或不经干燥，放入涂布了菌悬液的平板上，一般9厘米的培养皿中等距放置三片为宜。经培养后观察围绕纸片的抑菌圈，抑菌圈内出现的可能就是抗性菌。 阶梯性筛选法也有一定的缺点，它们只有在抑制区域才能挑选抗性菌，而低浓度区域面积较大，优良的抗性突变株若被分散在低浓度区域或远离纸片的区域，则可能没有被检出，因此，漏检的几率较大。 组成酶变异株的筛选 许多水解酶是诱导酶，只有在含有底物或底物类似物的培养环境中，微生物才会合成这些酶类，所以，诱导酶的生产不仅需要诱导物，而且受到诱导物的种类、数量以及分解产物的影响。能迅速利用的碳源（如葡萄糖）往往会引起酶合成的减少，诱导物有时又比较昂贵。这些都可能造成这些水解酶工业生产的波动以及生产成本提高。如果控制这些酶合成的调节基因发生了变异，诱导酶就可能转变成组成酶，它的合成与细胞的其它组织蛋白一样，不再需要诱导物的存在。由诱导型的出发菌株诱变筛选出组成型变异株对于水解酶的工业生产具有重要的现实意义。具体的筛选方法有恒化器法、循环培养法和诱导抑制物法。 恒化器法 恒化器常被用于微生物的“驯化”。在培养基中添加不能起诱导作用的低浓度底物，接入处理后的菌悬液进行培养，此时出发菌株由于不能被诱导，无法合成有关的诱导酶而不能分解该底物，从而生长速率极慢，而群体中少数组成型变异株则可合成有关的酶，分解利用该底物，生长速率较快。为了提高组成酶变异株的优势，即它在群体中的比例，可以应用恒化器培养技术。随着恒化器培养中不断加入新鲜基质而逐渐增大组成酶变异株的优势，这样就能够比较容易地做进一步的纯化分离。 循环培养法 利用不含诱导物的培养环境和含有诱导物的培养环境进行交替循环培养待分离的菌悬液，从而使组成酶变异株得到富集。当接种到不含诱导物而含有其它可利用碳源的培养基中时，两种类型菌株同样能较好地生长，但在此环境中组成型突变株已能合成有关的水解酶，而诱导型菌株就不能合成。 进而将它们转接入含诱导物的培养基中时，变异株能迅速利用诱导底物进行生长繁殖，而诱导型出发菌株需经历一个诱导合成酶的阶段，两类菌株的生长就不同步了，随着循环交替培养的继续，组成酶变异株所占的比例将逐渐增大。 诱导抑制剂法 有些化合物能阻止某些诱导酶的合成，如α-硝基苯基-β-岩藻糖苷对大肠杆菌的β-半乳糖苷酶的诱导合成有抑制作用，称为诱导抑制剂。当在诱导物和诱导抑制剂同时存在的培养环境中培养待分离菌群时，诱导型菌株不能产生诱导酶，无法正常生长，只有组成型变异株能够利用底物进行生长繁殖。 5.6.3.4高分子废弃物分解菌的筛选 随着石油化工和塑料工业的发展，各种高分子包装废弃物日益增多，这些“白色污染”在自然界很难被消化而进入物质循环。设法选育能分解利用这些高分子材料的微生物对于环境保护至关重要。这些高分子材料大多是不溶于水的，直接分离具有分解功能的微生物很困难。为此，有人设计了阶段式筛选法，首先寻找能在与聚乙二醇结构相似的含两个醚键的三甘醇上生长的微生物，接着，诱变筛选能分解聚乙二醇的变异株；或者筛选能以乙二醇、丙二醇为碳源的菌株，继而诱变筛选出能利用聚乙二醇等物质的变异株。这种由简单的聚合物单体入手逐级筛选高分子废弃物分解菌也许是一条有效的筛选思路。 5.6.3.5无泡沫菌株及高凝聚性菌株的筛选 有些菌在发酵过程中会产生大量的泡沫，从而造成发酵液满溢，增大了染菌的机会，使发酵体系反应不均匀，也有可能引起某些发酵产物的生物活性丧失，如蛋白酶变性失活。为了避免泡沫的产生，常常需通过牺牲发酵液的装量或加入大量的消泡剂来消除泡沫的不利影响。发酵过程产生泡沫是菌体代谢、培养基和发酵工艺等方面的原因造成的，而菌种是产生泡沫的关键，选育无泡沫或少泡沫菌株可以从根本上解决泡沫问题。 有人用气泡上浮法筛选出了无泡沫的酒精酵母。将变异处理后的菌悬液接种入生长培养基中，培养器皿的底部放置无菌压缩空气喷口，培养过程中不断通入无菌空气，形成鼓泡，易产生泡沫的酵母菌会随泡沫而除去，留下的是不易产生泡沫的变异菌株；也有人用苯胺蓝染色法进行筛选，将经过变异处理的菌悬液经培养后涂布在含葡萄糖3%、酵母膏0.5%、苯胺蓝0.005%的平板上培养4天，出发菌株呈浅蓝色，变异菌株因细胞壁成分和结构改变造成与染料结合力改变，少泡沫的变异菌株呈深蓝色。 啤酒发酵和单细胞蛋白培养都希望由凝聚性较好的酵母菌株担任发酵菌种，以便于啤酒的澄清和保持良好的风味，以及单细胞蛋白的收集。采用上述的泡沫上浮法也可以除去不易凝聚的细胞，通过改变鼓泡速度的调节，可以获得具不同凝聚性的菌株。