第十章 微生物发酵生产抗生素 10.1 概述 微生物在其生命活动中会产生种类繁多的小分子代谢产物，这些代谢产物一般可以分为两类：初级代谢产物和次级代谢产物。初级代谢产物一般属于能量代谢或分解代谢的产物，如乙醇、有机酸、氨基酸等。因此初级代谢产物往往与细胞的生长代谢有着密切的关系。次级代谢产物是在微生物细胞分化过程中产生的，往往不是细胞生长所必须的代谢产物，对细胞生长并不具有明显的作用，而且通常以一簇结构相似的化合物组成。次级代谢产物的概念由Bu’Lock于六十年代初提出，至今已被广泛接受。抗生素就属于次级代谢产物。 10.1.1微生物次级代谢产物 并非所有的次级代谢产物都符合上述特点，对细胞生长不具有明显的作用也并不等于完全没有作用，已经证明抗生素Pamacycin能够诱导放线菌产生气生菌丝就是一个例子。微生物次级代谢产物是微生物生理、生化状态的体现，通常在细胞生长受到限制的情况下产生。 次级代谢产物虽然对细胞的生长影响不大，但是具有重要的工业应用价值。抗生素、色素、蛋白抑制剂及毒素等都是次级代谢产物，近年来还发现了具有特殊生理活性的次级代谢产物，如：免疫调节剂（Bestatin, Cyclosporin A, FK506等），具有临床药理活性的物质（Acarbose, Lovastatin, Asperlicin等）以及农用和动物饲养业用的生物活性物质（Avermectin, Phosphinothricin等）。在次级代谢产物中，最重要的是抗生素。 10.1.2抗生素的定义和分类 抗生素是人类使用得最多的一类药物，自从第二次世界大战期间青霉素正式投入工业化生产以来，已经有一百多种抗生素进行商品化生产，为人类的防病治病作出了重要的贡献。虽然抗生素已被广泛使用，但是由于抗生素的多样性，关于抗生素的定义在专家中一直存在着分歧。目前，一个为大多数专家所接受的定义是：抗生素是低分子量的微生物代谢产物，能够在很低的浓度下抑制其它微生物的生长。这里所指的低分子量代谢产物是指抗生素的分子量一般不会超过几千道尔顿。如溶菌酶（Lysozyme）这类酶及其它复杂的蛋白质分子虽然也具有抗菌活性，但由于它们的分子量很大，因而在习惯上不将它们归入抗生素一类。只有微生物的天然代谢产物才能称为抗生素，通过化学修饰的只能称为半合成抗生素，根据天然抗生素的结构完全采用化学合成方法制造的则称为全合成抗生素。所谓抑制其它微生物生长是指抑制细胞的再生繁殖，因此是针对微生物群体而不是个别细胞而言的。这种抑制作用一类是永久性的，例如杀细菌剂（Bactericidal）和杀霉菌剂(Fungicidal)等可以将微生物杀死；另一类抗生素只能起到抑制微生物繁殖生长的作用，但不能将它们杀死。在抗生素的定义中还包含一个很重要的限制条件：低浓度。因为在高浓度下，即使是正常的细胞组分，如甘氨酸和亮氨酸，也会对某些细菌的生长产生抑制作用。基于同样的理由，一些厌氧发酵的产物， 如乙醇和丁醇，虽然在高浓度下也有杀菌或抑菌作用，也不属于抗生素。典型的抗生素的抗菌活性非常高，只要在微摩尔甚至纳摩尔浓度时就会有显著的抗菌活性。 抗生素的抗菌活性用最小抑制浓度（Minimal Inhibitory Concentration, MIC）表示， 单位是微克/毫升。MIC可以在液体试管或固体平板上测量，在一系列含有培养基和试验微生物的试管或平板中，分别加入浓度不断减少的抗生素，能够抑制微生物生长的最低抗生素浓度即为MIC值。显然，MIC值反映的是抗生素和特定微生物菌株之间的对应关系，即使是同一种微生物的不同菌株，也可能具有不同的MIC值。 抗生素对各种微生物的抗菌活性称为抗生素的抗菌谱。一些抗生素只对Gram阳性或阴性微生物具有抗菌活性，抗菌谱很窄；另一些则称为广谱抗生素，其中有些不但能抑制细菌、还能抑制霉菌的生长。还有一类称为抗肿瘤抗生素，这类抗生素也是根据其抗菌活性筛选的，然后再检验它们杀肿瘤细胞的能力。 抗生素研究中最吸引人的课题是抗生素抗菌的作用机理。经过生物化学家和药理学家多年的共同努力，已经证明的抗菌机理有：抑制细胞壁合成、抑制DNA复制或转录、抑制蛋白质合成及破坏细胞膜的正常功能等。抗生素抗菌作用机理的专一性，决定了其抗菌谱，例如若某种抗生素是几丁质酶的强抑制剂，而几丁质是霉菌细胞壁的主要成分之一，这样该抗生素就具有抑制霉菌生长的功能，但对细菌就没有抗菌效果。理想的抗生素应该只与微生物细胞中的某一目标分子起作用，而且在哺乳动物细胞中不存在该目标分子。这样，这种抗生素就不会对高等生物产生毒性，即没有副作用。 已经发现并鉴别结构的抗生素有几千种之多，从化学的观点看，结构多样性是抗生素的一个显著特点。Bérdy于1974年提出了一个抗生素的正式分类方法并为大家所接受，见表10.1.1。 表10.1.1 抗生素的分类 编号 抗生素类别 编号 抗生素类别   1. 碳水化合物类抗生素  5.1  非缩聚（单）杂环   1.1  纯多糖  5.2  缩聚（聚并）杂环   1.2  氨基糖苷类抗生素  6. 含氧多环抗生素   1.3  其它（N-或C-）糖苷类  6.1  呋喃衍生物   1.4  各种糖的衍生物  6.2  吡喃衍生物   2. 大环内酯类抗生素  6.3  苯基吡喃衍生物   2.1  大环内酯类抗生素  6.4  小内脂类   2.2  多烯类抗生素  6.5  聚醚类抗生素   2.3  其它大环内酯类抗生素  7. 脂环类抗生素   2.4  大环内酰胺类抗生素  7.1  环烷烃衍生物   3. 醌类和其它抗生素  7.2  小的萜烯类化合物   3.1  线性缩聚多环化合物  7.3  低聚萜烯类化合物   3.2  萘醌衍生物  8. 芳香族抗生素   3.3  苯醌衍生物  8.1  苯类化合物   3.4  各种醌类似物  8.2  缩环芳香族化合物   4. 氨基酸、多肽类抗生素  8.3  非苯型芳香族化合物   4.1  氨基酸衍生物  8.4  芳香族化合物的各种衍生物   4.2  均肽类  9. 脂族抗生素   4.3  非均肽类  9.1  烷烃衍生物   4.4  肽脂类  9.2  脂族羧酸衍生物   4.5  高分子量肽类  9.3  含S或P的脂族化合物   5. 含氮多环抗生素  0 其它（含未知结构）   从表中可以看到，与蛋白质、核酸等不同，抗生素的化学结构具有多样性，没有一般规律可循。除了表10.1.1的分类方法外，还有一种常用的非正式分类方法将抗生素分为若干类。分类的依据是具有类似的结构特点、类似的作用机理和生物活性。下面将对一些常见的抗生素进行简要讨论。 1、-内酰胺（-lactam）类抗生素（图10.1.1）。这类抗生素分子的结构特点是都有一个-内酰胺的四元环，它们的共同功能是抑制细菌细胞壁主要成分肽聚糖的合成。-内酰胺类抗生素又可以根据其化学特性分成几个子类，如青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类及单环内酰胺类等。 2、氨基糖苷（Aminoglycosides）类抗生素（图10.1.2）。它们的结构特点是都含有一个六元脂环，环上有羟基及氨基取代物，分子中还会有若干个糖基或氨基糖基。氨基糖苷类抗生素都具有抑制核糖体的功能。链霉素和庆大霉素属于这类抗生素。 3、四环素（Tetracyclines）类抗生素（图10.1.3）。四环素类抗生素分子结构中都有一个由四个缩聚环呈线性排列的核，其共同的功能是在核糖体水平抑制蛋白质合成。这类抗生素的典型例子是四环素。 4、蒽环（Anthracyclines）类抗生素（图10.1.3）。它们的结构特点与四环素类抗生素类似，也有四个缩聚环，但是它们的作用是在DNA水平，干扰拓扑异构酶(Topoisomerase)的功能，因此常用作抗肿瘤药，如道诺红霉素（Daunorubicin）。 5、抗细菌大环内酯类抗生素（图10.1.4）。这类抗生素的结构特点是含有一个很大的内酯环，通过与细菌核糖体的亚基结合以抑制蛋白质的合成，如红霉素（Erythromycin）。 6、抗霉菌大环内酯类抗生素、或聚烯类抗生素（图10.1.5）。它们的分子结构中也有一个很大的内酯环，环上有一系列的共轭双键。这类抗生素的作用是干扰真核细胞膜中甾醇的合成，如两性霉素B（Amphotericin B）。 图10.1.1 -内酰胺类抗生素示例 图10.1.2 氨基糖苷类抗生素示例 a: 青霉素G； b: 头胞菌素 a: 链霉素，含链霉胍的氨基糖苷 c: 噻烯霉素； d: 棒酸 b: 庆大霉素C1a, 含脱氧链霉胺 图10.1.3 四环素和蒽环类抗生素 a: 四环素(R1=R2=H)(Tetracycline); 金霉素（R1=C1，R2=H）(Chlorotetracycline)；土霉素（R1=H， R2=OH）(Oxytetracycline)；b: 道诺红霉素（R1=H）(Daunorubicin)；阿霉素（R1=OH）(Doxorubicin) 图10.1.4 大环内脂类抗生素示例 a: 红霉素(Erythromycin)；b: 泰乐霉素(Tyrosin)  图10.1.5 聚烯类抗生素两性霉素B 图10.1.6 安沙霉素类抗生素 （两性霉素B Amphotericin B） 利福霉素B（R1=CH2COOH） 利福霉素SV（R1=H） 7、安沙霉素（Ansamycin）类抗生素（图10.1.6）。安沙霉素类抗生素中有一个被脂链扩展的芳香环，该环通过一个酰胺键闭合。它们又可以分成几个子类，其中利福霉素（Rifamycin）是RNA聚合酶的抑制剂。 某些抗生素除了抗菌性能外还具有其它生物活性。例如，利福霉素具有降低胆固醇的功能；红霉素能诱导胃的运动性；瑞斯托霉素（Ristocetin）能够促进血小板凝固等。这些生物活性与它们的抗菌能力没有直接联系。 10.2抗生素生产菌的生物学基础 10.2.1芽孢杆菌属(Bacillus) 芽孢杆菌属微生物是一类单细胞、杆状菌的总称，好氧或兼性厌氧。它们的共同特点是当环境条件不利时会形成内生孢子。芽孢杆菌属于Gram阳性菌，一般可以借助于侧生或有缘毛的鞭毛运动。芽孢杆菌通常作为腐生菌生活在土壤中，但是也有例外，如：B. anthracis 是人类病原菌，而B. thuringiensis是昆虫的病原菌等。 芽孢杆菌在工业发酵中主要用于胞外水解酶类生产，而苏云金杆菌B. thuringiensis芽孢中的毒蛋白晶体则可用作为生物杀虫剂，是一种广泛使用的生物农药。 由芽孢杆菌产生的抗生素一般都属于多肽类抗生素。多肽类抗生素的分子量小于蛋白质，它们的分子结构中往往含有一些不同于蛋白质的特殊组分，如：D-氨基酸、脂肪酸及环状氨基酸等。多肽类抗生素与蛋白质的另一个不同点是生物合成途径存在显著的差别，杆菌产生的多肽通常不是通过核糖体进行转录和翻译，而是由复杂的多酶体系催化合成。芽孢杆菌合成的多肽类抗生素与链霉菌合成的多肽也有显著的差别，芽孢杆菌合成的多肽不含缩酚肽键（Depsipeptides），肽链的起始是一个酰基，而且肽链中没有甲基化的氨基酸残基。 芽孢杆菌产生的多肽类抗生素的抗菌谱差别很大，多数对Gram 阳性菌有抑制作用，但多粘菌素Polymyxins能抑制Gram阴性菌生长，芽胞菌霉素Iturins则是抗霉菌剂。它们的作用机理也各不相同，如：伊短菌素Edeins 有抑制聚核苷酸酶的功能；杆菌肽Bacitracin会阻碍肽聚糖合成；短杆菌肽Gramicidins则起着干扰细胞质膜的作用。 在抗生素生产的发展历史中，杆菌产生的多肽抗生素曾经起过重要的作用。早在1939年就从B. brevis培养液中分离得到了短杆菌肽，至今仍用于外用抗菌剂的配制；杆菌肽是1945年从B. licheniformis分离得到的，曾用于治疗链球菌的严重感染，现在则限于外用抗菌剂及饲料添加剂；多粘菌素 B和E曾经是治疗严重的假单胞菌感染用药，但由于毒性较大，现在已停止使用。 芽孢杆菌也能够产生非肽类的抗生素，如：B. circulans 产生氨基糖苷类抗生素丁苷菌素Butirocin，B. megaterium能够产生安沙霉素类的Lucomycotrienin。虽然丁苷菌素并不用于医药，但是其结构特点却引起了人们的重视，受其启发而产生了各种氨基糖苷类抗生素的化学改性方法，在对付细菌对抗生素耐药性方面开辟了新的途径。 10.2.2假单胞菌属Pseudomonas 假单胞菌属细菌是Gram阴性菌，杆状，直径约1m，长度1.5-5m，能够借助于鞭毛运动，好氧生长。许多菌株都能积累聚羟基丁酸（PHB），具有很强的降解有机物能力。假单胞菌一般从土壤中分离得到，也有一些生活在植物的根系和叶子上。 假单胞菌的许多性质都与它所携带的大量质粒有关，这些质粒可以分为13类，每一类都有类似的表观特征、尺寸和DNA结构。在这些质粒中广泛分布着编码抗生素抗性的基因及降解芳香化合物的基因。假单胞菌产生的次级代谢产物有许多不能算是抗生素，而是色素（如绿脓菌荧光素Fluorescent pyoverdines）及植物毒素（如丁香霉素Syringomycins）等。 真正能产抗生素的假单胞菌只有P. aeruginosa和P. fluorescens两个种。所产生的抗生素一般是含氮的杂环化合物，在氨基酸分解代谢的过程中被生物合成，如吩嗪衍生物碘菌素(Iodinin)和绿脓菌素(Pyocyanine)。从假单胞菌中分离得到的抗生素在其它微生物中也曾获得过，如环丝氨酸、磷霉素及氨霉素等。真正首次从假单胞菌分离得到并已经用于医药的只有两种抗生素：吡咯菌素(Pyrrolnitrin)和拟摩尼酸A(Pseudomonic acid A)。 吡咯菌素原来也由P. fluorescens或P. pyrrolnitrica生产，属于天然的含氮化合物，有广泛的抗真菌作用，常用于治疗皮肤感染，但现在这种药已经改用化学合成方法生产。拟摩尼酸A也是由P. fluorescens产生的，它的抗菌谱很广，包括大部分Gram阳性菌和部分Gram阴性菌，能有效地在健康载体上杀死葡萄球菌。但是拟摩尼酸A在人体内会迅速降解为摩尼酸而失去活性，因此也只能外用。 单环内酰胺磺胺净素和异胺磺胺净素分别从P. acidophila和P. mesoacidophila中首先分离获得，它们的抗菌活性并不高，但是在它们的分子结构启发下，已经合成了具有临床应用价值的药物Azthreonam。 10.2.3链霉菌(Streptomyces)和链轮丝菌(Streptoverticillium) 链霉菌和链轮丝菌都属于放线菌，两者很难从生物学的角度进行区分，只是在气生菌丝的形态上稍有区别。它们都属于Gram阳性菌、专性好氧、化学异养型、以菌丝状生长。一般只需要一种碳源（如葡萄糖、淀粉或甘油）、一种无机氮源和少数无机盐就能够生长，但在复合培养基中会生长得更好些。大部分链霉菌都属于中性、中温菌，最佳生长条件的范围为：pH 6.8-7.5、温度22-37oC，通常为28oC，但也有例外。链霉菌的分布非常广泛，主要寄居在土壤中，而且与土壤中的有机大分子，如几丁质、淀粉和纤维素等的降解有着十分密切的关系。链霉菌也是几种重要的工业用酶的生产菌，如葡萄糖异构酶、链霉蛋白酶（Pronase）及胆固醇氧化酶等。 链霉菌产生的次级代谢产物数以千计，大多数都具有抗菌能力，这些次级代谢产物的化学结构千差万别，反映了各种链霉菌代谢途径的多样性。链霉菌是抗生素生产的主要菌种，它们产生的抗生素主要有以下类型。 10.2.3.1氨基环多醇类抗生素 氨基环多醇类抗生素又称为氨基糖苷类抗生素，是一类拟多糖，有一个含羟基、氨基或呱基的六碳环和若干个糖分子（主要是氨基糖）构成。链霉菌产生的氨基环多醇类抗生素主要有： 链霉素（Streptomycin）抗Gram阴性菌和结核分枝杆菌，最初从S. griseus获得，是一种重要的医用抗生素。与链霉素结构类似的抗生素还有：Hydrostreptomycin和Mannosidostreptomycin，但目前尚无实际应用。 新霉素（Neomycins）是一种抗菌抗生素，结构特点是氨基环多醇2-脱氧链霉胺的4及5位上分别被糖取代，由两种结构类似物新霉素B和C组成，生产菌是S. fradiae。其它具有类似结构的抗生素有：Paromomycins(S. rimosus); Lividomycins(S. lividus)及Ribostamycin(S. ribosidificus)。这类抗生素的毒性比较大，除了最后一种用于治疗感染外，其余都只能用于外用药。 卡那霉素（Kanamycins）和妥布拉霉素(Tobramycin) 其结构特点是2-脱氧链霉胺的4和6位被糖取代。卡那霉素A由S. kanamyceticus生产，具有抗Gram阴性菌和抗分枝杆菌的能力，是一种常用抗生素；妥布拉霉素由S. Tenebrarius产生，是一些雷布霉素（Nebramycins）的复合物，具有抗P. aeruginosa和其它病原体的能力。 越霉素(Destomycins) 也是2-脱氧链霉胺的衍生物，从S. rimofaciens发酵获得，另一种类似的抗生素Hygromycin B从S. hygroscopicus发酵得到。它们具有驱肠虫活性，因此用于家禽和猪的驱虫药。 春雷霉素(Kasugamycin)和有效霉素(Validamycins)分别由S. kasugaensis和S. hygroscopicus产生，它们的环多醇结构与上述抗生素不同。这两种抗生素都用于农业上防治霉菌引起的水稻病害。 10.2.3.2含聚酮链(Polyketide chain)结构的抗生素 从链霉菌合成的聚酮化合物次级代谢产物的数量很多，它们都是通过乙酸和丙二酸的缩合生物合成的。其中最重要的两类医用抗生素是抗肿瘤的蒽环类（Anthracyclines）和抗菌的四环素类(Tetracyclines)。 蒽环类抗肿瘤剂的化学结构特点是含有一个或多个糖取代的羟基蒽醌。它们最先是根据其抗菌活性而分离得到的，然后发现它们还具有抗肿瘤活性，如从S. peucetius分离得到了具有抗白血病的道诺红霉素(Daunorubicin 或Daunomycin)，从S. peucetius变异株发现了其羟基衍生物阿霉素(Doxorubicin或Adiamycin)，阿霉素对白血病和几种恶性肿瘤都有活性。最近又从S. galilaeus发现了一种新的抗肿瘤抗生素Aclarubicin。这些抗肿瘤抗生素都已经用于临床治疗。 四环素(Tetracycline)类抗生素具有广谱抗菌能力。它们与蒽环类抗生素的主要区别是环上没有糖基取代，但是有二甲基胺取代。这类抗生素中首先发现的是从S. aureofaciens产生的金霉素(Chlortetracycline)和从S. rimosus产生的土霉素(Oxytetracycline)，然后从S. aureofaciens的突变株获得了四环素，四环素的副作用是使牙齿变黑。去甲基金霉素Demethyltetracycline)也是由S. aureofaciens的另一突变株生产的。现在，金霉素已只用于动物饲养业；四环素的半合成衍生物，如强力霉素(Doxycycline)及二甲胺四环素(Minocycline)仍可用于人类疾病的治疗。 10.2.3.3聚酮链经取代、还原后的次级代谢产物 聚酮链类抗生素是放线菌典型的代谢产物，但当构成聚酮链的丙二酸被甲基丙二酸取代或聚酮链上的羧基被部分或全部还原时就会形成一系列其它次级代谢产物，主要有以下六类：抗菌大环内酯类、安沙霉素类、聚烯类、聚醚类、阿尔法霉素及抗寄生虫大环内酯等。 抗菌大环内酯类抗生素 它们属于有支链的大环内酯，环上有一个或两个糖基。环的大小不等，一般由12-26个原子构成。具有工业重要性的这类化合物大约有100个以上，有些直接用于药物，有些是半合成抗生素的前体，其中最重要的抗生素及生产菌株有：红霉素(Erythromycin, S. erythraeus)、竹桃霉素(Oleandomycin, S. antibioticus)、柱晶白霉素(Leucomycin, S. kitasatoensis)、交沙霉素(Josamycin, S. narbonensis)、螺旋霉素(Spiramycin, S. ambofaciens)、麦迪霉素(Medecamycin, S. mycarofaciens)、麦里多霉素(Maridomycin, S. hygroscopicus)及泰乐霉素(Tylosin, S. fradiae)等。上述抗生素中除泰乐霉素用于兽药及兽用生长促进剂外，其它都是人用药。有些生产菌的分类最近已经改变，如：红霉素生产菌已经重新命名为糖多孢菌（Saccharopolyspora）；柱晶白霉素生产菌的现用名是链轮丝菌（Streptoverticillium）。 安沙霉素类抗生素的结构与大环内酯不同，属于大环内酰胺类，大环通过形成一个内酰胺键闭合，而不是酯键。根据生物活性、环的大小、及芳香侧链的差别，安沙霉素类抗生素可进一步分为四类，但是只有利福霉素B(Rifamycin B)是工业化生产的产品，它的结构中有一个萘环，是合成抗结核药利福平的前体。利福霉素B由S. mediterranei生产，该菌种后来被重新分类为Nocardia mediterranei，最近又有人建议命名为Amycolatopsis mediterranei。 聚烯类抗生素有一个含26-38个原子的内酯环，环上有一系列的共轭双键，与此相对的环上则有一系列的羟基。聚烯类抗生素可根据双键的数目进一步细分为若干类。这类抗生素主要有：抗真菌剂两性霉素Amphotericin B由S. Nodosus产生，用于致命的真菌病治疗；由S. nursei产生的制霉菌素Nystatin和由S. griseus产生的杀假丝菌素Candicidin都能用于表皮感染的治疗。 聚醚类抗生素属于被甲基和乙基高度取代的线性脂族分子，沿着分子链有一系列的四氢吡喃环和四氢呋喃环。从链霉菌中已经分离出上百种聚醚，从其它放线菌还分离出许多类似代谢产物。聚醚类抗生素具有抗好氧和厌氧微生物的能力，但主要的商业用途是作为抗球虫剂用于兽药，也用于饲料添加剂以增加饲料转化率。主要品种有：由S. cinnamonensis生产的Momensin、由S. lasaliensis生产的拉沙菌素Lasalocid、由S. albus生产的盐霉素Salinomycin及由S. aureofaciens生产的奈良菌素Narasin等。 阿尔法霉素Elfamycin也属于线性脂链分子，与聚醚类不同的是分子中的醚键较少，但存在共轭双键，而且在分子中至少有一个氮原子。Elfamycin的作用机理是抑制伸长因子Tu。主要用途是作为兽药和饲料添加剂，如： 由S. goldiniensis生产的Aurodox及由S. ramosissimus生产的摩雪霉素Mocimycin(Kirromycin)等。 抗寄生虫大环内酯的基本结构是一个由16个原子组成的环状内酯，而抗菌大环内酯一般有含氧的杂环与大环内酯结合而成。抗寄生虫大环内酯没有抗菌活性，但具有驱肠虫(anthelmintic)、杀昆虫及杀螨虫活性。已知的这类抗生素为由S. hydroscopicus产生的密比霉素(Milbemycins) 和由S. avermitilis产生的阿福霉素Avermectins。阿福霉素中的B1组分是生产依维菌素Ivermectin的前体，阿福霉素和依维菌素目前广泛用于农药和兽药，并正在往人用驱虫药的方向发展。 10.2.3.4多肽类抗生素 链霉菌产生的多肽类抗生素一般通过硫模板多酶催化机理合成，它们的结构单元变化很大，而且在最初的链形成后还要经过各种修饰。由于结构的不同，它们的生物活性也有很大变化。有些多肽类抗生素具有重要的临床应用价值。 抗肿瘤多肽(Antitumor peptides) 这类多肽中，从S. antibioticus分离得到的放线菌素(Actinomycins)具有历史重要性，因为它是第一个从链霉菌分离得到的抗生素。其结构中含有噻酚嗪酮稠环发色基和两个环形肽。放线菌素D一直用于临床治疗肿瘤。另一种多肽博莱霉素(Bleomycin)从S. verticillus发酵得到，有复杂糖基化的线性肽链，还含有杂环基团，用于治疗淋巴肿瘤和皮肤癌。 糖肽类(Glycopeptides or Dalbaheptides)抗生素 有一个含7个氨基酸组成的多环核，其芳香残基形成了一个三苯醚和一个二苯基团，糖基可以接在环上的不同位置。这类抗生素中的阿沃菌素Avoparcin由S. Candidus产生，用于饲料添加剂，有促进动物生长的作用；万古霉素Vancomycin是一种重要的临床用广谱抗生素，从S. orientalis发酵得到，现在该菌种已经重新分类为Amycolatopsis orientalis；游壁菌素（替考拉宁）Teicoplanin则是Actinoplanes的代谢产物，也已开始应用于临床。 内酰胺(Lactams)类抗生素 这类抗生素主要由低等真菌生产，但是有些链霉菌也能生产，如S. lipmanii能够产生青霉素N和7-甲氧基头胞菌素C；在3位取代的甲氧基头胞菌素Cephamycin则由S. clavuligerus产生。这些都是半合成抗生素的前体。碳青霉烯Carpapenems也有一个内酰胺结构，但它不是从三肽衍生的，其内酰胺环由不含硫原子的五元环组成，其中最重要的是噻烯霉素Thienamycin，是合成具有广谱抗菌活性的亚胺青霉烯Imipenem的前体，从S. cattleya发酵获得。棒酸Clavulanic acid的环上含有氧原子，首先是从S. clavulgerus分离得到的，棒酸本身几乎没有抗菌活性，但与其它抗生素结合使用时具有抑制细菌内酰胺酶的作用。 肽酶抑制剂(Peptidase inhibitors)和免疫调节剂(Immunomodifier) 由于Umezawa实验室的出色工作，从链霉菌中分离出了一系列的蛋白酶抑制剂。亮抑蛋白酶肽Leupeptin和 MAPI分别是末端的羧基已经还原为醛基的三肽和四肽，是丝氨酸蛋白酶的抑制剂。有些抑制剂能与细胞表面上的蛋白酶作用，具有免疫强化作用。如佳制霉素 Bestatin是一种由 S. olivoreticili产生的二肽，在白血病和黑色素瘤的治疗中正在进行临床试验。用于农业和饲养业的多肽类抗生素有维吉尼亚霉素S和M1(Virginiamycin S & M1)，前者是一个环六肽，后者则具有肽内酯结构。另一种作为饲料添加剂的硫链丝菌肽(Thiostrepton)分子结构中有多个噻唑和杂环基团。在基因工程和分子生物学中常用作硫链丝菌肽抗性标记。由S. viridochromogenes分离得到的Bialaphose是一个含两个丙氨酸分子和磷丝菌素(phosphinotricin)的三肽类似物，其结构中的磷丝菌素部分能抑制谷氨酰胺合成酶，因此具有抗菌和杀虫活性。 10.2.3.5核苷类抗生素(Nucleosides) 已经从链霉菌分离得到的核苷类抗生素有200多种，它们的活性和作用方式各不相同，只有少数已应用于农业上。如杀稻瘟素(Blasticidin) S可以防止水稻稻瘟病的发生，由S. griseochromogenes产生；多氧菌素(Polyoxins)对植物病原体具有广谱抗真菌功能，由S. cacaoi产生。 不属于以上类型但由链霉菌生产的其它重要抗生素及生物活性物质还有：氯霉素(Chloramphenicol)，属于芳香胺-醇化合物，是少数几种含硝基的天然化合物之一。氯霉素具有广谱抗菌活性，特别是对Gram阴性菌的抗菌效果更好，由S. venezuelae产生。林可霉素(Lincomycin)分子由一个脯氨酸衍生物与一个改性的糖分子结合而成，其生物活性与红霉素类似，由S. lincolnesis发酵生产。新生霉素(Novobiocin)的分子结构很复杂，含有一个香豆素、一个糖基和一个苯甲酸衍生物，临床上用作抗葡萄球菌，但主要用于兽药。新生霉素由S. niveus生产。磷霉素(Posfomycin)是肽葡聚糖合成的抑制剂，对Gram阳性和阴性菌都有抗菌活性，有好几种链霉菌都能用于生产磷霉素，典型的有S. fradiae。FK506的分子结构中含有一个23元的内脂环，结构复杂，是一种免疫抑制剂，由S. tsukubaensis产生。 12.2.4 其它放线菌生产的抗生素 其它对抗生素生产有重要意义的放线菌有：诺卡氏菌形放线菌(Nocardioform Actinomycetes)、游动放线菌(Actinoplanetes)及足分枝菌(Maduromycetes)。 12.2.4.1诺卡氏菌形放线菌 诺卡氏菌形放线菌中最重要的是诺卡菌(Nocardia)。它既有营养菌丝、又有气生菌丝，有时不发育的菌丝还会断裂成不会运动的碎片，进一步形成不运动的孢子链。这是一种中温菌，在简单培养基中就能够生长，但生长速度慢，分裂时间要5小时，能够利用长链脂肪烃及气态烃作为碳源。诺卡菌生产的最重要的抗生素有：利福霉素(Rifamycins)、万古霉素(Vancomycin)及瑞斯托菌素(Ristocetin)。另外一些由诺卡菌生产的抗生素包括：诺卡杀菌素（Nocardicins, S. uniformis），这是一种单环内酰胺抗生素；间型霉素（Formycin）和助间型霉素(Coformycin)，两者都是核苷类抗生素，由N. interforma生产。后者虽然没有抗菌活性，但对腺苷脱氨酶有抑制作用，类似的还有2-脱氧助间型霉素(2-deoxycoformycin, S. antibioticus)。 拟无分枝酸菌(Amycolatopsis)属于诺卡氏菌形放线菌。这些菌本来也分类为诺卡菌，但由于它们的细胞膜不含支链脂肪酸而被重新分类。有许多拟无分枝酸菌能合成糖肽类抗生素，如万古霉素(A. orientalis)和瑞斯托菌素(A. orientalis subsp. Lurida)。也能产生Elfamycin 和胞壁菌素(Muraceins)，胞壁菌素是血管紧张肽转化酶(Angiotensin-converting enzyme)的抑制剂，是胞壁酰的肽衍生物。A. mediterranei也是利福霉素的重要生产菌种，它的基因图谱已经经过了细致的研究，因此常用于基因工程的宿主细胞。 糖多孢菌(Saccharopolyspora)也属于诺卡氏菌形放线菌，它们的营养菌丝容易断裂，细胞壁的组成含有阿拉伯糖、乳糖和内消旋二氨基庚二酸。这一属微生物只有两个种，其中S. erythrea是生产红霉素的优良菌种。 10.2.4.2游动放线菌 游动放线菌因形成包在孢子囊中的游动孢子而命名，属于Gram阳性菌，好氧生长，属中温菌，最适温度20-30oC、pH7.0。能长成有分枝和分隔的菌丝，气生菌丝则非常少见。细胞壁的肽葡聚糖中含有内消旋二氨基庚二酸或3-羟基二氨基庚二酸和甘氨酸。游动放线菌的菌斑比较小，说明生长缓慢，菌斑呈黄色，也有棕色、蓝色及红色等颜色的菌斑。 从游动放线菌分离的抗生素有120余种，包括氨基酸衍生物、聚烯、核苷及氯代杂环化合物等种类。游壁菌素(Teicoplanin, A. teichomyceticus)属于脂糖肽类抗生素，用于治疗Gram阳性菌感染；Ramoplanin是一种大环肽类抗生素，环上有多个糖和脂肪酸取代基，具有临床应用的前景。由Actinoplanes SE 50菌株产生的一种四聚假糖是糖化酶的抑制剂，已经用于治疗代谢紊乱疾病，商品名为Acarbose。 指孢囊菌(Dactylosporangium)也属于游动放线菌，因指状的胞子囊而得名，每根营养菌丝上有3-4个运动孢子。从指孢囊菌分离得到的抗生素有30种左右，其中属于氨基环多醇类的有：紫素霉素(Sisomicin, D. thailandense)、N-甲酰基紫素霉素(N-Formylsisomicin, D. thailandense) 、指孢囊霉素(Dactimicin, D. matsuzakiense)、抗分枝杆菌的多肽类卷曲霉素(Capreomycin, D. variesporum)及聚烯类的尼日菌素(Nigericin, D. aurantiacum)等。 另一类游动放线菌是小单胞菌(Micromonospora)，其菌落与游动放线菌类似，并有同样的橘黄色，但小单胞菌不形成孢子囊，而是在子实体中。从小单胞菌分离得到的抗生素有300多种，其覆盖范围几乎与放线菌一样广，抗生素的品种也类似，如庆大霉素（M. purpurea, M. echinospora）、健霉素(Fortimicin, M. olivoasterospora)；大环内酯类的蔷薇霉素(Rosamicin, M. rosaria)、霉素霉素(mycinamicins, M. griseorubida)及闰年霉素(Lipiarmycin, M. echinospora)等；另外还有利福霉素及多糖类的扁枝衣霉素(Everninomycin, M. carbonacea)等。 12.2.4.3足分枝菌 足分枝菌(Maduromycetes)是一类性质差别很大的放线菌，带有气生菌丝的营养菌丝分化时形成短链孢子或者孢子囊，孢子有些能运动，有些则不能。整细胞水解后可以检测到马杜拉糖，细胞壁含有内消旋二氨基庚二酸。属于足分枝菌的马杜拉放线菌的孢子链比链霉菌短，孢子直径要超过菌丝，生长周期长达14-15天。马杜拉放线菌产生的抗生素有250种以上，最常见的是离子型聚醚，如马杜拉霉素(Madurimicin, A. yumaensis)和阳离子霉素(Cationomycin, A. azurea)。此外，经常可以在足分枝菌分离得到蒽环类的抗肿瘤抗生素，如洋红霉素(Carminomycin, A. roseoviolacea)、A-40926(Actinomadura ATCC39727)和血管紧张肽转化酶抑制剂I-5 B(A. spiculosoapora)。 10.2.5 粘细菌（Myxobacteria） 粘细菌是一类能滑动的Gram阴性杆菌，在饥饿条件下会形成称之为孢子果的复杂结构，成千上万个细胞聚集在一起，内中的营养细胞处于休眠期，并转化为粘孢子。粘细菌广泛分布于土壤、腐烂的植物和素食动物的粪便中。 七十年代开始，对粘细菌进行了普遍的筛选以期获得新的抗生素生产菌。人们发现，粘细菌次级代谢产物中抗菌活性物质的检出率非常高，而且许多都是新发现的抗生素。如纤维素堆囊菌(Sorangium cellulosum)产生的大环内酯类抗生素堆囊菌素(Sorangicin)、M. coralloides产生的珊瑚粘菌素(Corallopyronin)等。具有抗真菌能力的琥苍菌素(Ambruticin)也是由纤维素堆囊菌产生的。 12.2.6 曲霉(Aspergillus) 曲霉主要用于有机酸和酶制剂的生产。由曲霉生产的最重要的次级代谢产物是洛伐他汀（Lovastatin），由A. terreus生产，它的功能是抑制胆固醇生物合成途径中的第一个酶（甲基羟基谷氨酸还原酶）的活性，从而达到降低胆固醇的目的。洛伐他汀及其半合成产物新伐他汀已经成了医治心血管疾病的常用药。 曲霉中，A. nidulans虽然能够产生青霉素，但活力不高，不能用于工业生产。A. alliaceus 能产生葱曲霉素（Asperlicin），这是一种非肽类的氨基酸衍生物，是一种正在研究中的缩胆囊肽的拮抗物。从A. oryzae和其它霉菌中分离的小肽Aspergillomarasmine对血管紧张肽转化酶有一定的生物活性。从A. nidulans或A. rugulosus分离得到的脂肽棘白菌素Echinocandins具有抗霉菌活性，其中Echinocandin B经化学改性后得到的Cilofungin抗霉菌剂有较好的临床应用前景。 12.2.7 青霉属(Penicillum) Penicillium来源于拉丁文Penicillus，意义为小刷子，形象地说明了青霉菌的形态特征：分叉的菌丝上长着许多的分生孢子。大多数青霉属于腐生菌，广泛生存于土壤和腐败的水果和蔬菜中。 由于人类第一个工业化生产的抗生素青霉素是由青霉属中的Penicillium notatum中发现的，至今青霉素及其半合成抗生素仍是产量最大、用途最广的抗生素，因此青霉在抗生素工业中具有特别重要的地位。 1928年9月在伦敦圣玛利医院工作的Alexander Fleming医生在分离金黄色葡萄球菌时，发现其中一个平板受到了污染，在污染菌斑附近，其它细菌不能生长。一般情况下，这种受污染的平板立即就会被丢掉，但Fleming却没有这样做，而是对这一现象进行了深入研究，最终导致了具有强大抗菌作用的抗生素——青霉素的发现。但是Fleming重要的发现当时并未受到重视，被搁置了十几年。第二次世界大战为青霉素的工业化提供了机会。牛津大学的Howard Flory和Ernst Chain重新对青霉素进行了研究并获得了一定数量的青霉素，他们将青霉素用于一位血液受到感染的病人，病情出现了明显的好转迹象。令人遗憾的是宝贵的青霉素用完了，病人最后还是没有治愈。二战的发展使青霉素的研究工作不得不从英国转移到了美国，在美国战时生产局的领导下，许多政府部门和制药公司共同协作，终于实现了青霉素的工业化生产。到二战末，已经具备了生产每年治疗十万个病人的青霉素生产能力。今天，青霉素仍然是主要的抗生素品种之一，而且以它为基础，开发出了一系列更有效、毒性更低的半合成抗生素品种，为人类的健康作出了重要的贡献。青霉素的发酵水平也从刚开始时的0.001g/L提高到了目前超过50g/L，这一成就是微生物学家和生物化工工程师多年辛勤研究和共同合作的成果。 青霉属中分离得到的其它抗生素不多，比较重要的是由A. janczewskii和P. griseofulvin生产的七肽类化合物灰黄霉素，临床用于外用抗霉菌剂。 10.2.8生产抗生素和次级代谢产物的其它微生物 除了上面讨论的能够生产抗生素的主要微生物种属外，其它微生物也能够产生一些重要的抗生素。在细菌中，从葡萄糖杆菌Gluconobacter SQ26445分离得到了磺胺净素(Sulfazecin)，属于磺酰基单环内酰胺类抗生素。以后发现农杆菌Agrobacterium、色杆菌Chromobacterium、纤维粘细菌Cytophage和曲挠杆菌Flexibacter的一些种也能产生磺胺净素。黄杆菌Flavobacterium和黄单胞菌Zanthomonas的某些菌株则能够产生头孢菌素C。 霉菌中的头孢霉Cephalosporium chrysogenum是最重要的头孢类抗生素生产菌种。头胞霉在分类学上有一些不同看法，它们的共同特点是分生孢子的结构简单，在一小部分分生孢子的顶上有一个单茎或分枝很少的茎，其菌丝分化形成节孢子。Cephalosporium chrysogenum的营养要求与青霉类似，一些糖类、甲基油酸或甘油都能作为碳源，无机氮、氨基酸或复合的多肽作为氮源。除头孢类抗生素外，Cephalosporium生产的其它重要抗生素都属于聚酮类或萜类化合物，如六酮类的浅蓝菌素Cerulenin(C. caerulens)是脂肪酸生物合成的抑制剂；梭链孢酸Fusidic acid(Acremonium fusidioides)则是抗葡萄球菌剂。 木霉属的Trichoderma inflatum是环孢A的生产菌，环孢A具有抗霉菌活性，更重要的用途是作为器官移植的免疫抑制剂。 10.3 新抗生素生产菌种的筛选 微生物的次级代谢产物是发现新抗生素和其它生物活性物质的巨大宝库。许多国家和大制药公司都投入了大量的人力和物力从事这项工作，发现了数以万计的新化合物，从中进一步筛选出了具有临床应用价值的抗生素和生物活性物质等，其中许多产物已经形成了知识产权，在创造了巨大经济利益的同时，也为人类的健康和工农业生产的发展作出了贡献。今天，虽然基因工程和组合化学的发展为新药的开发提供了新的思路和方法，但是持之以恒地对各种微生物的次级代谢产物进行分析鉴别，从中发现新的化合物、筛选出新的抗生素仍然具有重要意义。 10.3.1 抗生素的基本筛选方法 自从发现青霉素后，各国科学家已经对发现新抗生素建立了一套比较系统的方法，可以在短时间内从微生物的次级代谢产物中发现数以千计的活性分子，从中又能够进一步筛选出几个具有临床应用价值的抗生素。这种筛选方法最初是由美国Rutgers大学的Waksman教授于1940年建立起来的，至今仍然被工业界和学术界广泛采用。 在上一节中我们已经介绍了许多抗生素生产菌都是来自于有机物在自然界的循环过程，因此筛选的第一步是收集各种环境条件下的土壤和腐败植物样品，从中进行筛选。最常用的筛选过程包括如下步骤：1）将土壤样品加水后充分搅拌或震荡；2）离心取上清液并稀释后涂在事先准备好的琼脂平板上；3）在平板上挑选一些菌落接种于液体培养基进行培养；4）吸取培养液检验其抗菌或其它生物活性。 当某一菌落的生物活性得到确证后，就必须将生物活性物质进行分离和部分提纯，以确定该物质是否具有新颖性，并进行一系列初步的生物试验以评价其应用前景。这一步骤的关键是要避免与前人工作的重复。一般而言，培养液中生物活性物质的浓度很低，而且存在许多结构类似物，若要完全将它们分别予以提纯将需要消耗大量的人力和物力。因此对代谢产物的提纯要适度，粗产物的纯度应该在5-10%以上。在分离前应该确定活性物质是在发酵液中还是菌体中。 确定活性物质的新颖性是筛选工作的重点，为此要对活性物质进行一系列的生物学性质和物理化学性质检验。主要的生物学性质有：1）对活性物质的抗菌谱进行评价，包括交叉抗菌谱，血清、pH、接种量及离子等因素对抗菌谱的影响；2）活性物质对实验动物的影响，特别是对已受到感染的动物鼠的ED50（50%有效剂量）和LD50（50%致死剂量）的测定，除了确定其绝对值外，有效剂量和致死剂量的相对比值具有更重要的意义，因为经初步提纯的活性物质中，虽然纯度不高，但如果活性物质只有一种，该比值就与样品的纯度无关；3）如果产物是某一特定代谢途经中某一种酶的抑制剂，鉴别其新颖性就比较容易，因为需要比较的对象只是具有同样功能的数量有限的几种化合物，当然也要注意该化合物是否在过去已经根据它的其它活性而被分离、鉴别过。 由于产物只经过初步的分离提纯，还不可能进行纯物质物性的测定，如熔点、红外及NMR谱等，但是可以进行紫外和可见光谱的测量，从中可以获得许多有用的信息。样品虽然不纯，但活性物质的含量往往是最多的，因此利用质谱可以测定其正确的分子量，这对于新颖性的鉴别非常有用。在各种溶剂系统中进行纸层析和薄层层析能获得该物质的酸碱性、亲水或亲脂性等性质，斑点的迁移值可以用来与已知数据比较。现代HPLC技术既可以用于分离也可以鉴定有关物质，如：毛细管色谱可以达到很高的理论板数，因此有很好的分离效果。从紫外扫描得到的谱图可以与已知谱图比较以确定其新颖性，半制备色谱能提供一定数量的纯物质供进一步的生物活性鉴定。 为了确定新发现的生物活性物质是否具有新颖性，需要建立一个所有已知抗生素的数据库，如Bioactive Natural Product Database(BNPD)。如果确实发现了一个具有特殊结构又具有特殊生物活性的新化合物，就需要将它提纯并精确测定其物理化学性质和化学结构。与此同时，可以考虑申请专利以保护知识产权。 10.3.2 改进筛选效率 发现新的微生物是发现新抗生素的基础。经过四十年代和五十年代大规模的抗生素生产菌筛选以后，人们发现要筛选得到新的抗生素已经变得越来越难了，筛选得到的活性物质与以前已经发现的抗生素相同的频率越来越高。为了解决这一问题，人们一方面采取了从不同的地域和生态环境的土壤样品中进行筛选的方法，如：从海洋沉积物、特殊气候条件地区的土样或特殊土壤成分的土样等；另一方面则采用了一些特殊的筛选方法从普通的土样中筛选出新的微生物及新的抗生素。事实证明，后一种方法也取得了许多意想不到的成果。 10.3.2.1改进筛选方法 新筛选方法的目标是尽可能地提高某一类微生物的富集度。例如，如果要从土样中分离杆菌，可以首先将土样加热到70oC或在50%乙醇溶液中浸泡一小时。经过这种条件的处理，只有杆菌的孢子才能存活，这样就使杆菌的富集度大大提高。再与选择性培养基相结合，就能得到性能更特殊的微生物，如嗜酸菌或Gram阴性菌等。 对于除链霉菌以外的其它放线菌，一种很有用的筛选方法是先将土样在空气中干燥，然后加热到100~120oC，并保温一小时。虽然这种方法的选择性不是很理想，但是能大大减少细菌和链霉菌的数量，结合应用选择性培养基往往能起到很好的筛选效果。如：利用含溶菌酶或土霉素的培养基能筛选到链轮丝菌Streptoverticillium；含脱甲基金霉素或甲烯土霉素的培养基则用于诺卡氏菌Nocardia的筛选；指孢囊菌Dactylosporangium 会在含几丁质的培养基中选择性地生长，等等。 在筛选霉菌时，可以在培养基中加入四环素等抗生素以抑制细菌的生长，同时可选择在20 oC的温度下培养，在较低温度下，放线菌基本上不会生长。另外，生长在极端气候条件下及与高等生物共同生活的霉菌中筛选出新抗生素的概率也比较大。 10.3.2.2试验方法的改进 除了改进微生物的筛选技术外，发展新的生物活性试验方法对于提高新抗生素的筛选效率也非常重要。 对于抗细菌剂的筛选，可以采用两种策略。一种是以获得新化合物为目标，可以应用与传统概念不同的方法进行试验。传统筛选方法往往根据是否能杀死或抑制金黄色葡萄球菌S. aureus和枯草芽孢杆菌B. subtilis的生长来试验抗生素的抗性。因为对这两种细菌有抗性的物质已被广泛研究，取而代之的是筛选对其它细菌，如梭状芽孢杆菌（Clostridium）等有抗性的物质，黄色霉素Kirromycin就是这样筛选得到的。又如：将传统的以是否抑制细菌的生长作为筛选目标，改变为根据是否抑制细菌的某些功能，如运动性或夹膜形成等作为目标进行筛选。另外也可以筛选那些具有特殊基团或结构的化合物，如含硝基、含氯的化合物，然后再测定其抗菌活性。另一种策略是以寻找已知抗生素的类似物为目标。一种比较简单的方法是将两种同基因菌株的发酵液活性进行比较，其中一个菌株是对所筛选的抗生素具有抗性的突变株，另一菌株则是对该类抗生素十分敏感而对其它抗生素不敏感的菌株。这种策略在筛选新的-内酰胺类抗生素时取得了成功，如诺卡杀菌素的发现就是用这种方法筛选成功的一个典型例子。 一个更先进而且有效的方法是根据事先确定的目标去筛选新的抗生素。例如，若目标是要筛选对细菌细胞膜的合成起抑制作用的新抗生素，就可以采用比较发酵液对正常金黄色葡萄球菌S. aureus和缺少细胞壁突变株的作用差别来确定其是否具有所需的活性；也可以利用细菌代谢途经中任意一个必需酶的抑制剂作为筛选目标，或者利用生物活性物质是否能与细菌中的特定受体形成复合物的方法进行筛选。 抗霉菌生物活性物质的筛选比较困难，主要原因是霉菌是真核生物，与哺乳动物细胞的性质比较接近，许多具有杀霉菌功能的抗生素对人体也具有毒性。因此必须根据霉菌的特点进行筛选。例如霉菌的细胞壁含有大量的几丁质，而哺乳动物细胞则不含几丁质。虽然直接筛选霉菌细胞壁合成抑制剂的工作没有取得成功，但是以后采用了在无细胞体系中对几丁质合成酶的抑制剂进行筛选，却成功地筛选到了多氧菌素(Polyoxin)和三国霉素(Nikkomycin)这两种抗生素；另外通过对葡聚糖（霉菌细胞壁的另一种主要成分）合成酶抑制剂的筛选，发现了一种辣白霉素的衍生物，具有抑制霉菌生长的良好效果。麦角固醇也是霉菌细胞膜的特有成分，因此有人提出通过活性物质和麦角固醇的亲和性来筛选新抗生素。在霉菌的蛋白质合成系统中有一种必需的物质称为伸长因子EF—3，该蛋白质的抑制剂已经显示出是一种新的、对人体无毒的抗生素。其它筛选抗霉菌的新抗生素的方法也引起了人们的重视，如天冬氨酸蛋白酶抑制剂等。 抗病毒抗生素的经典筛选方法基于是否能够抑制受病毒粒子感染的细胞单层上形成裂解噬菌斑。具体方法如下：将受新城（New castle）病病毒感染的鸡胚胎成纤维细胞悬浮液涂在琼脂平板上，上面覆盖一张浸渍了试验样品的滤纸，将平板进行培养并用中性红染色，如果细胞被染色，说明具有抗病毒活性。抗微生物病毒的抗生素也用类似的方法筛选，只是用细菌和DNA或RNA噬菌体作为试验体系。随着病毒酶的发现，现在已开始应用目标更明确的筛选方法。一个典型的例子是日本国立健康研究所筛选逆转录病毒的逆转录酶抑制剂时所采用的方法，他们利用poly(dT)poly(A)共聚物作为模板，测定被鼠白血病病毒蛋白催化的DNA合成，用这种方法他们筛选得到了逆转录酶的抑制剂——制逆转录酶素Revistin。在进行这类筛选工作时，需要注意的是必须避免体系中存在蛋白酶，否则会得到错误的信息，因此在试验前要加热到100oC使蛋白酶失活。重组DNA技术的发展为将病毒蛋白克隆到细菌细胞并大量表达提供了方便，这对于抗病毒抗生素的筛选创造了有利条件。抗逆转录酶抑制剂、HIV病毒蛋白酶抑制剂及病毒蛋白与细胞受体的竞争键合剂等都是筛选的目标。 抗肿瘤抗生素可以通过微生物评价的方法筛选，这些方法基本上都基于原噬菌体诱导方法以评价抗生素与DNA键合或干扰DNA合成的能力。通过观察在敏感细菌培养平板上裂解噬菌斑的形成，或基于受到原噬菌体启动子控制的细菌酶的诱导进行生化方法测量，都可以评价其抗肿瘤活性。另一类抗肿瘤抗生素属于辅酶或氨基酸的拮抗物，因此需要设计能检测抗代谢物活性的方法。最常用的抗肿瘤抗生素筛选方法是基于对肿瘤细胞的细胞毒性直接进行评价，通过直接观察抗生素对肿瘤细胞的生长抑制和死亡率的影响以确定其抗肿瘤效果。染色法、放射化学法等有助于大量样品的快速筛选。 至于其它具有临床应用价值的次级代谢产物筛选，必须根据筛选的目标确定筛选的方法和程序。近年来，在筛选引起代谢紊乱的酶抑制剂、各种不同类型的配体和受体及细胞和细胞相互关系的调节剂等方面的研究进展很快，每年都有几十种新药面市，在心血管疾病、糖尿病及某些癌症的治疗中正在起着越来越大的作用。典型的有：免疫调节剂佳制霉素Bestatin、免疫阻遏剂FK506、引起炎症的弹性蛋白酶抑制剂Elasinin和Elastinal、胰淀粉酶和蔗糖酶的抑制剂低聚糖Acarbose、胆固醇生物合成抑制剂密实菌素Compactin和Mevinolin。最近的新趋势是筛选能干扰控制细胞分裂的酶，如抑制胳氨酸激酶和蛋白激酶C的生物活性物质及激素的拮抗物，这些药物对于控制恶性肿瘤的发展和代谢紊乱型疾病的治疗有着良好的应用前景。 在早期的抗生素筛选工作中，一般不考虑抗原生动物的活性。以后，抗原生动物的抗生素引起了人们的重视，采用了以能够降低试验原生动物的运动性作为判断标准进行筛选的方法；抗昆虫活性的抗生素也可以用类似的方法筛选得到。近年来提出了采用生化试验方法进行筛选的新方法，筛选的原理是基于昆虫的几丁质含量很高，可以根据抗生素对几丁合成酶和几丁酶的抑制能力进行筛选。抗虫抗生素筛选的一个成功例子是Merck公司生产的阿福霉素Avermectin，该抗生素首先由日本的Kitasato研究所分离得到，但由于它没有抗菌活性而得不到重视。Merck公司的专家根据对受蠕虫感染鼠的体内试验，证实了它的抗寄生虫功能。作为除草剂的抗生素可以根据其对谷氨酰胺合成酶的抑制作用进行筛选，例如若某种发酵液能使B. subtilis在最低培养基中的生长受到抑制，而当加入谷氨酰胺后抑制消失，就可以判断该发酵液中可能含有具有除草功能的化合物，除草剂Bialaphos就是用这种方法筛选得到的。另外还可以根据是否能抑制纤维素生物合成进行筛选，例如若能对细胞壁中含纤维素的霉菌Phytophthora parasitica有抑制功能，就有希望筛选到具有除草功能的次级代谢产物。 总之，随着筛选技术的发展，新抗生素的筛选速度已经大大提高。由于生物化学的研究进展及人类基因组计划的接近完成，人们对疾病起因的认识已经提高到酶水平和基因水平，因此能够发现更科学的筛选基准，从而提高筛选的效率和抗生素类药物的治疗效果。可以预料，许多新的抗生素和次级代谢产物将被筛选出来，而且它们将具有更强的对症治疗功能、更低的副作用。 10.4 抗生素的生物合成机理 对抗生素生物合成机理的研究包括：细胞内将一种或几种初级代谢产物转化为最终次级代谢产物的反应顺序以及该反应系统的调节机制。本节将讨论反应顺序问题，而将调节放在下一节。 与抗生素品种的多样性不同，描述微生物合成次级代谢产物的生化反应却可以归纳为数目有限的若干条生物合成途经。论证生物合成途经的步骤一般包括：1）确定构成最终产物分子的初级代谢产物“建筑构件”来源；2）确定生物合成途经中的关键中间产物，通过该中间产物，就能够合理地推断反应顺序；3）分离和鉴别催化每一反应的酶。在实际应用时，这三个步骤并不完全按上述次序进行，有时首先发现的是关键中间产物或关键酶。 10.4.1研究抗生素生物合成途径的方法 10.4.1.1 示踪剂技术 为了确定构成最终产物分子的初级代谢产物“建筑构件”的来源，一种最有用的技术是应用放射性同位素标记的示踪剂。将具有放射性同位素14C、3H或13C标记的抗生素生物合成前体物质加入生产该抗生素的微生物培养基中，最佳加入时间是微生物生长阶段的末期，当培养结束后，将抗生素分离、提纯，然后测定结合到抗生素分子中的同位素，从放射性同位素的计数就可以获得前体物质结合到抗生素分子的程度。在分析数据时应该注意两点：一是示踪物质虽然是抗生素合成的前体物质，但由于不能通过微生物的细胞壁吸收而得出不是前体物质的错误结论，事实上如果该物质能够进入细胞内就可以结合到抗生素分子中；二是在抗生素分子中虽然检测出了示踪物质，但示踪物质已经在细胞中通过其它代谢途径降解，真正结合到抗生素分子的是示踪物的降解产物。为了避免上述误差，可以采用双重标记的示踪物，如前体分子同时有14C和3H的标记。 在确定了抗生素分子中结合进去了某一前体物后，下一个任务是确定该前体在抗生素分子结构中的位置，这样就要将抗生素分子降解为一定的小片段，然后确定标记物在哪一个片段中，这是一个困难而又耗时的工作。一个比较有效的替代方法是用13C标记的前体物。13C在自然界的丰度有1.1%，表面看来似乎会干扰测定结果，但它的优点是能够合成13C的含量高达99%的化合物，因此自然丰度的干扰可以忽略不计。将用13C合成的前体加入培养基中进行抗生素发酵，得到的产物可以直接用核磁共振（NMR）谱峰的高度增加值判断抗生素分子的每个碳原子中13C所占的分数。如能采用双重标记的前体物，则可以根据谱峰多重性的高分辩分析和偶合常数来判断两个原来相连的原子在经过复杂的代谢过程后是否还继续相连，或连结键虽然已经断裂但经不同的途径结合到了抗生素分子中。 如果不能确定合理的前体物，则可以采用放射性标记的更普通的底物分子，如葡萄糖或甘油，同时结合中间代谢产物的确定，也能对研究抗生素代谢途径提供有用的信息。此外，用氘标记的前体物产生的抗生素用NMR谱进行研究也很有用，氘在质子共振谱中不出现谱峰，很容易鉴别。 4.4.1.2 利用阻断突变(Blocked Mutation)技术确定中间代谢产物 将抗生素生产菌经诱变处理后筛选出失去生产能力的突变株，如果生产能力的丧失是一次突变的结果，往往意味着抗生素生物合成途径中的某一种酶已经失活，这样的突变株称为阻断突变株。由于酶失活，使生物合成不能继续，中间代谢产物就会积累并被分离提纯。关键问题是要确认它的确是抗生素合成的中间代谢产物，为此也必须借助于放射性标记技术。在培养阻断突变株的培养基中加入放射性标记的前体，就可以得到有放射性标记的中间代谢产物，然后将它加到抗生素生产菌种的培养基中，如果结合到抗生素分子中的带有放射性标记中间产物的比例很高，就可以证明该物质是抗生素代谢途径的中间产物。另外一种方法是在不加营养物质的悬浮细胞培养时，如果加入了中间产物后能够提高抗生素产量，也可以间接证明该物质确实是中间代谢产物。 那么，怎样确定突变株只经过一次突变呢？如果将两个突变株放在一个摇瓶中进行混合培养并与它们的单独培养进行比较，如果其中的一个突变株单独培养时不产中间代谢产物而混合培养时能检测到，则说明该菌株可能经历了两次突变；而一起培养的另一菌株则具有积累中间代谢产物的能力，从而证明它只经历了一次突变。如果混合培养时一个突变株产生的中间代谢产物被另一个突变株消耗，则可以通过将其中一个突变株单独培养的培养液加到另一突变株的培养液，看该突变株是否能恢复抗生素生产，如果是的话，就可证实后者具有积累中间代谢产物的能力。 4.4.1.3酶的鉴别 一般来说，通过示踪剂技术和代谢中间产物的鉴别足以确定抗生素的生物合成途径，但是只有证实微生物中确实存在催化这些反应的酶时，研究工作才能算完成。酶的鉴别可以采用一般的生物化学方法，需要先将酶分离提纯，在无细胞体系中研究酶的催化活性和酶学性质。如果微生物产生的是一组结构类似的抗生素，则有必要搞清楚不同代谢产物的前体——产物关系。 随着基因重组技术的进展，不需要任何有关酶的知识就可以确定合成抗生素的基因。因为基因序列的确定比蛋白质中氨基酸序列的测定要容易得多，因此从基因序列及已知的初级和次级代谢产物基因的基础上，可以确定酶的结构和性质。 4.4.2抗生素生物合成反应和途径 虽然抗生素的分子结构要比初级代谢产物复杂得多，而且有些抗生素分子中还含有初级代谢产物所没有的基团，如氯或硝基基团，但是在初级和次级代谢产物的生物合成之间却存在着紧密的联系。催化特殊次级代谢产物合成反应的酶可以从那些普通代谢途径的酶演化而来。即使是能催化生物分子氯代反应的酶也与催化普通反应的酶密切相关。例如催化氯霉素合成途径中氯代反应的酶是血红素蛋白，具有溴过氧化物酶和催化酶的活性，与从Micrococcus luteus获得的细菌催化酶具有许多共同的性质。 抗生素生物合成反应一般可根据形成抗生素的初级代谢产物进行分类，例如从糖、氨基酸、乙酸或核苷酸等合成的抗生素。这种方法虽然实用，但不够科学，因为从同样的起始物质可以发生互相间没有关系的一系列反应，最后获得不同的抗生素，而且许多抗生素是由各种初级代谢产物所形成的中间产物组成的，事实上很难区分那一个初级代谢产物是主要的。一种更合理的分类方法是既考虑开始合成的分子，又根据初级代谢的经典生化途径对抗生素的合成反应进行分类。主要的有以下三类反应。 4.4.2.1 类型I反应：初级代谢产物转化为生物合成的中间产物 这类反应与初级代谢产物本身的代谢途径有关，如氨基酸的合成和分解、核苷酸代谢、糖转化及辅酶合成等。所获得生物合成中间产物的功能是：1）通过进一步的修饰从单一初级代谢产物合成抗生素；2）与其它中间产物缩合形成复杂分子，合成方法与某些辅酶（如叶酸、辅酶A或醌蛋白的辅基等）合成类似；3）通过类型II反应与几个类似的代谢物缩合。 1)与氨基酸代谢有关的反应 缩酚酸肽类抗生素的羟基和酮酸取代基来源于几种氨基酸的转氨反应，得到相应的酮酸，然后再经过氧化脱羧反应产生碳链缩短了一个碳原子的羧酸。离子载体缬氨霉素(Ionophore valinomycin)和蒽镰霉素B(Enniantin B)的((酮基((异缬草酸基反应和吡啶霉素的((酮基((甲基缬草酸基反应就属于这一类。从色氨酸开始，通过类似的一系列反应可以得到咔唑霉素(Carbazomycin)A和B的吲哚环。苏氨酸通过氨基丙酮和酮丙醇路线代谢为乳酸，缬氨霉素的乳酸基团就来源于此。多肽类抗生素宜他霉素(Etamycin)分子中的3-羟基吡啶甲酸则是赖氨酸分解代谢生成乙酰乙酸的中间产物哌啶-2-羧酸的脱氢产物。 图10.4.1 从酪氨酸合成P-羟基苯甘氨酸 图10.4.2 链丝氨酸合成的代谢途径 的代谢途径 图10.4.3 氯霉素生物合成途径 图10.4.4 林可霉素和组成恩霉素的烷基脱氢脯氨酸的生物合成 在次级代谢产物的合成途径中，第一个反应往往是氨基酸的((羟基化反应，这在初级代谢反应中只见于有机酸，典型例子有：1）p-羟基苯甘氨酸的合成，这是所有dalbaheptide抗生素和诺卡杀菌素的一个组成部分，是从酪氨酸((羟基化或经一系列的反应得到的，见图10.4.1；2）链丝菌素F(Streptothricin F)的Streptolidine结构是精氨酸经((羟基化再氧化为((酮精氨酸后成环得到的多环衍生物，反应历程见图10.4.2；3）p-氨基苯丙氨酸的((羟基化是氯霉素生物合成的第一步反应，见图10.4.3；4）((羟基亮氨酸是远霉素(Telomycin)和亮可他汀(leucostatins)的结构成分。事实上，其它抗生素生物合成的第一步也可以用((羟基化解释，只是细胞很难吸收外源性的((羟基化氨基酸，因而难以通过实验方法证实。 另外，在黑色素(Melanin)的生物合成途径中，酪氨酸的芳香环上羟基化生成二羟基苯丙氨酸，随后将氮结合到环上形成吡咯环。林可霉素和恩霉素分子结构中的烷基脯氨酸则是按图10.4.4的途径从酪氨酸反应得到的，吡咯烷环是从丙氨酰链环化而成，而芳香环开环降解后形成了脂肪烃侧链。 2)与核苷酸代谢有关的反应 一个有趣的现象是：脱氧核苷抗生素PA 399（5，6-二氢-5-氮胸苷）的生物合成与嘧啶类核苷酸的合成平行进行。从氨甲酰基和乙醛酸尿素缩合开始，其后续反应，如核糖基化、脱羧等反应都与嘧啶的合成类似。 图10.4.5 放线菌素D和烟酸的芳香烃单元生物合成途径 核糖核苷通过还原反应转化为脱氧核糖核苷，催化该反应的是核糖核苷还原酶，反应位点是2’位的羟基。抗生素Cordicepin(3’-脱氧腺苷)的合成只是对上述过程略有改变而已，反应位点在3’ 位的羟基，还原机理与2’ 脱氧核糖核苷形成机理十分类似。 微生物也能通过补救(Salvage)途径合成核苷，通过外源嘌呤或嘧啶的核糖基化实现。狭霉素C(Psicofuranine)就是通过类似的反应，由腺苷与阿洛酮糖的糖基化反应生物合成的。 上述现象表明许多抗生素的合成途径都与核苷酸代谢存在着密切的关系。 3)与辅酶合成有关的反应 烟酸是辅酶NADH的前体，在哺乳动物和链孢霉中是由色氨酸通过3-羟基邻氨基苯甲酸途径合成的，而在植物和细菌中则通过天冬氨酸和三碳单元（甘油或与其密切相关的三碳化合物）的缩合得到。这两种机理在抗生素前体合成中都能看到。在多肽类抗生素吡啶霉素中有两个嘧啶环就是由天冬氨酸和甘油醛缩合而成的；放线菌素和恩霉素的前体3-羟基-4-甲基-邻氨基苯甲酸则从色氨酸经3-羟基犬尿氨酸（链孢霉中合成烟酸的另一中间产物）途径合成，见图10.4.5。 蝶啶(Pteridine)是核黄素和叶酸的前体，由三磷酸鸟苷合成，生物合成的第一个反应是除去GTP中的C-8，形成甲酸。该反应由GTP-环化水解酶I和II催化。在抗生素杀结核菌素(Tubercidin)、东洋霉素(Toyocamycin)和桑霉素(Sangivamycin)的结构中都有一个核糖基吡咯嘧啶环，它的嘧啶部分都来自于ATP，生物合成的第一个反应是在GTP-8-甲酰羧化酶的催化下除去C-8；吡咯环上的碳原子来自核糖，生物合成途径与叶酸合成平行，核糖用于构成蝶啶环。其中东洋霉素的生物合成途径见图10.4.6。 图10.4.6 从腺苷合成东洋(丰加)霉素的代谢途径 图10.4.7 碳霉糖的生物合成 4)糖转化 在抗生素分子结构中，经常可以见到各种糖结构单元，低聚糖和氨基环多醇类抗生素更是完全由糖的衍生物所构成。这些糖单元中，有些是非常常见的，如氨基葡萄糖及甘露糖等，有些则只能在次级代谢产物中才能看到，具有特殊结构，生物合成的途径与O-抗原合成类似。 许多实验事实已经证明抗生素中的糖单元一般直接从葡萄糖或其它常见的糖类转化而来，不发生碳原子的重排。在初级代谢中，糖的相互转化一般发生在其端部碳原子形成二磷酸核苷酯而活化后，在抗生素的糖苷合成中有时也能观察到这种现象，下面是一些具体例子。 碳霉糖(Mycarose)是存在于泰乐霉素和大环内酯类抗生素中的一种脱氧糖，其生物合成途径中的两种酶已经鉴别，其中第一种酶脱水酶将脱氧胸苷二磷酸（dTDP）-葡萄糖转化为dTDP-4-酮-6-脱氧葡萄糖；第二种酶差向异构酶进一步将其转化为dTDP-4-酮-L-鼠李糖，但以后的合成途经尚不清楚，图10.4.7显示了碳霉碳的合成途径。链霉糖是链霉素的结构单元，其合成途径的头两步反应与碳霉糖一样，然后dTDP-4-酮-L-鼠李糖被重排为dTDP-二氢链霉糖，在dTDP-二氢链霉糖装配到抗生素分子上以后发生最终氧化为链霉糖的反应。链霉素中还含有甲基-L-氨基葡萄糖，是D-氨基葡萄糖的衍生物，合成途径包括四个手性中心的转化，但还不清楚具体的反应是怎样进行的。 在有些氨基糖苷类抗生素中，链霉胍和2-脱氧链霉胺是必须的结构单元，虽然它们都从葡萄糖合成，而且结构上具有类似性，但合成途径却并不相同。链霉胍合成途径的关键中间产物是D-myo-肌醇，而2-脱氧链霉胺的中间产物是2-脱氧-scyllo-肌糖。两者的生物合成途经都已经研究清楚。 10.4.4.2 类型II反应：小分子代谢产物的聚合 1）聚酮化合物的合成 脂肪酸合成由脂肪酸合成酶（FAS）催化，属于聚合过程。在脊椎动物中脂肪酸合成酶（FAS I型）是一种多功能聚肽，而在细菌和高等植物中（FAS II型）则是多酶复合物。关于聚合过程的研究已很详尽，基本步骤是： a) 出发分子乙酸和延伸单元丙二酸分别连接到酶分子； b) 乙酸的羧基碳原子与丙二酸的甲叉基缩合，同时其自由端羧基生成CO2脱去，产物乙酰乙酸则以硫酯键结合到酶的乙酰基载体蛋白（ACP）； c) 乙酰乙酸的羰基还原为羟基，再通过脱水反应形成双键，经第二次还原后生成丁酸； d) 链的增长在缩合酶上完成，另一个丙二酸分子结合到ACP。重复上述过程，直至达到所需链长后在硫酯酶的作用下被释放。 图10.4.8 以聚酮链为基本结构的抗生素的生物合成途径 如果上述过程中第三步的还原被删去，聚合产物就会变成聚酮甲烯链，由羰基和甲烯基相间排列。这种结构是放线菌和霉菌产生的很多抗生素所共有的结构。聚酮链有折叠的倾向，而且具有高度的反应性。由于折叠（有些折叠须在酶催化下进行）的方法及链长不同，就会形成多种不同的结构。在空间和能量的作用下，有些还形成了芳香环。由于聚酮链的反应性很好，因此不稳定，很难进行分离。但是根据示踪剂实验及合成前几步反应的中间产物，还是能够分析出这类抗生素合成可用如图10.4.8所示的代谢途径描述。 这类抗生素的典型代表是四环素、灰黄霉素和阿霉素。值得指出的是它们的起始物可能不相同，如四环素和阿霉素链增长的起始物质分别为丙二酰胺和丙酸，这是造成这类抗生素多样性的一个重要原因；多样性的另一个原因是链延伸分子的变化，当用甲基丙二酸或乙基丙二酸代替丙二酸作为链延伸分子时，就会形成带有甲基或乙基取代基的链；在上面讨论的脂肪酸合成途径中如果失去了一步还原反应或脱水反应也是抗生素多样性的重要原因，这样链上将分别含有羰基、羟基或双键。如果链上没有反应性很强的甲烯基，就不会通过简单的脱水反应形成芳环。这些抗生素的最终结构要么是线性分子、要么形成终端由酰胺键闭合（大环内酰胺）或酯键闭合（大环内酯）的大环分子。泰乐霉素和利福霉素B的生物合成途径如图10.4.9所示，它们的聚酮链上经历了取代、还原等反应。 图10.4.9 聚酮链经取代、还原等反应后得到的抗生素 聚烯类抗生素是线性分子，由丙二酸、甲基丙二酸、乙基丙二酸单元构成，通过聚酮链上氧原子的缩合形成吡喃和呋喃环，反应途径见图10.4.10。 在抗生素生物合成中，链的每次延伸插入的分子并不完全相同，有烷基取代的、部分还原的等，因此链的装配必需十分精确、按一定的顺序进行。对红霉素生物合成基因的研究已经证明了这一点。 多肽合成的硫模板机理 氨基酸缩合形成多肽次级代谢产物有三种不同的机理: 氨基酸活化生成磷酸酯，然后被一种特定的酶催化缩合。谷胱甘肽就是在初级代谢阶段合成的，一些小肽通常也都用这种方法合成，如蛋白酶抑制剂亮抑蛋白酶肽(Leupeptin)； 大分子聚肽链通过蛋白质合成的常规途径经转录-翻译系统合成； 经多酶复合物将氨基酸活化后按硫模板机理缩合。 本节将要介绍的是第三种机理。 图10.4.10 聚烯类抗生素生物合成途径 图10.4.11短杆菌肽S通过硫模板机理进行生物合成的途径 多肽合成的硫模板机理包括以下步骤：1）氨基酸与ATP反应在羧基上形成腺苷单磷酸酯而被活化；2）氨基酸转移到酶的巯基，根据多酶复合物确定的次序形成巯酯键；3）由巯酯键的断裂提供能量，在第一个氨基酸的羧基和第二个氨基酸的氨基间形成一个肽键；4）类似地，二肽的巯酯键断裂，与第三个氨基酸的氨基形成肽键。重复这一过程直至完成多肽抗生素肽链的合成。催化该过程的酶复合物最多可以有四个多酶体系组成，每个多酶体系独立完成一些氨基酸的活化、硫酯化和肽键形成过程，有时这些酶系还具有一些额外的功能，如L-氨基酸转化为D-氨基酸及为S-腺苷基蛋氨酸提供甲基的酰胺氮原子上的甲基化反应等。缩肽类抗生素的生物合成中，氨基酸和羧酸都是抗生素的建筑构件，最终形成酯键和酰胺键交替的链。 下面将以短杆菌肽S的生物合成为例进行说明，合成途径见图10.4.11。 短杆菌肽S是一个环状多肽抗生素，由两条相同的五肽链头尾连接而成。它的合成由两个可溶性酶GS1和GS2催化，两者的分子量分别为130,000和500,000。GS1酶负责苯丙氨酸的活化、消旋、D-氨基酸的硫酯化；GS2酶则负责另外四个氨基酸的活化并作为它们的载体。然后按照图10.4.11中所示的次序合成五肽链，最后首尾相接形成短杆菌肽S。 近年来的研究工作已经证明，青霉素和头孢霉素类抗生素也是由多酶体系通过硫模板机理开始合成的，而且从Aspergillus nidulans, Cephalosporium acremonium和Streptomyces clavuligerus分离提纯了ACV合成酶，该酶的功能是活化((氨基己二酸（在((羧基基团处）、胱氨酸和缬氨酸，然后将活化的氨基酸与酶结合形成硫酯并将L-缬氨酸转化为D-缬氨酸，将上述氨基酸聚合成三肽((氨基己二酸基胱氨酸基D-缬氨酸。在青霉素和头孢霉素类抗生素的生物合成中，该三肽在异青霉素N合成酶的催化下成环形成异青霉素N，这是((内酰胺类抗生素生物合成的最后一个中间产物。((内酰胺类抗生素生物合成途径示于图10.4.12和图10.4.13。 图10.4.12 异青霉素N的生物合成途径 10.4.13 β-内酰胺类抗生素生物合成的最后几步反应 类异戊二烯的合成 许多霉菌的次级代谢产物是从初级代谢产物异戊二烯缩合而成的，常见的衍生物有：三单元缩合产物倍半萜(Sesquiterpenes)、由四聚物分解的二萜及固醇。类异戊二烯类抗生素的碳架构与类似初级代谢产物的已知结构基本一致，但是由于碳链的成环、各种重排及其它反应，这类抗生素的结构变化很多。唯一的一种临床应用的抗生素梭链孢酸的生物合成途径与霉菌膜的固醇合成类似。 低聚糖的装配 已经详细研究了氨基糖苷类抗生素的生物合成过程，从分离得到的中间产物证明糖单元是逐个连接上去的，其过程与细菌和霉菌细胞壁中发现的低聚糖合成途径十分类似。在氨基糖苷分子中常常会有一些特殊的糖单元，这些特殊的糖分子往往在低聚糖装配前就已经合成。 链霉素分子的装配从磷酸链霉胺与二氢链霉糖的结合开始，并被活化为脱氧胸苷二磷酸，而N-甲基-L-葡萄糖氨在被活化为尿苷二磷酸后与二氢链霉糖的2’-羟基结合，再经过将二氢链霉糖环上的甲醇基氧化为醛基及脱去磷酸基团后就完成了链霉素的合成。  图10.4.14 红霉素生物合成的最后几步反应  图10.4.15 四环素生物合成的最后几步反应 通过核糖体合成的多肽抗生素 仅有少数多肽抗生素是通过正常的蛋白质合成系统经转录和翻译得到的。一般由细菌产生，但也有少数是放线菌产生的。它们的结构中含有羊毛硫氨酸(Lanthionine)，因此又称为Lantibiotics。核糖体合成的抗生素分子比较大，如含19个氨基酸残基的血管紧张肽转化酶抑制肽(Ancovenin)和含34个氨基酸残基的乳链菌肽(Nisin)。新制癌菌素(Neocarzistatin)有100多个氨基酸残基，而且与一个复杂的发色基团结合，实际上是一种蛋白质类抗生素。这些多肽类抗生素的前体有一段导肽，须在翻译后加工时切除，然后再经过对氨基酸残基的修饰反应而获得最终产物。 10.4.4.3类型III反应：基本结构的修饰 从一个中间产物或几个不同结构单元装配而成的抗生素基本结构还需要经过酶催化反应的修饰才会具有活性。这些反应包括：糖基化、酰基化、甲基化、羟基化、氨基化反应及还原反应。图10.4.14 和图10.4.15分别显示了红霉素和四环素生物合成途径的最后几步反应。在四环素生物合成途径中，从甲基预四环酰胺(Methylpretetramide)出发，经过一系列的氧化、氨化和甲基化反应最终得到四环素。也正是由于这些反应的变化，使抗生素生产中往往存在一系列同系物，这些同系物具有类似的结构和或多或少的生物活性，形成了抗生素的多样性。在抗生素的菌种筛选中，也就需要筛选出那些含高活性组分最高的突变株。 10.5抗生素生物合成的调节 与初级代谢产物的生物合成一样，抗生素的合成也受到酶合成的阻遏和酶活力的抑制等调节和控制。同时抗生素等次级代谢产物又是微生物分化阶段的产物，因此凡是调节和控制分化过程的因素都会对抗生素的生物合成产生影响，分化时的一些现象，如孢子形成和气生菌丝的产生等都会影响抗生素的产量。 10.5.1反馈调节 抗生素生物合成的反馈调节已经从两个方面得到证明。直接的实验事实是：如果在培养基中加入产物，抗生素的合成将会停止；间接证据是：若将产生的抗生素不断地从发酵液中分离，将增加抗生素的产量。但是这些实验却无法区分引起这种现象的原因究竟是酶合成的阻遏还是酶活力的抑制。只有对那些生物合成途经中的酶系已经了解得比较清楚的体系，才有可能进行深入的研究。 在Streptomyces venezuelae发酵生产氯霉素的发酵液中加入氯霉素或其p-甲硫基类似物会抑制抗生素生产。研究工作已经证实产物对芳胺合成酶有阻遏作用，该酶的作用是将分枝酸转化为p-氨基苯丙酮酸，这是氯霉素生物合成过程中第一个特殊的中间代谢产物。 在嘌呤霉素发酵中，生物合成途径最后一个酶是O-甲基转移酶，其活性受到终产物的抑制。在泰乐霉素和霉酚酸发酵中，同样存在着产物对O-甲基转移酶的抑制现象。 抗生素的生产也会受到初级代谢产物反馈抑制的间接调节。例如在Penicillium chrysogenium发酵生产青霉素时，赖氨酸积累会抑制其本身合成途径中的第一个酶（单柠檬酸合成酶），该酶催化反应的产物是((氨基己二酸，是青霉素合成的前体。因此赖氨酸的反馈抑制虽然存在于初级代谢途径，但对青霉素的生产也会有影响。另一个例子发生在用Stretomyces griseus发酵生产杀假丝菌素的过程中，由于芳香属氨基酸色氨酸在莽草酸途径中的反馈抑制作用，使通过该途径合成的杀假丝菌素前体p-氨基苯甲酸的合成受到影响，从而也抑制了抗生素的生产。可以看到，通过对反馈抑制机理的研究对抗生素生产菌种的选育具有指导意义。 10.5.2营养物浓度的调节 对于极大多数抗生素生产菌而言，若在营养丰富的培养基中培养，只有当生长完全停止时才会开始积累次级代谢产物，发酵过程可以区分为生长阶段和抗生素生产阶段。但当营养物的浓度受到限制时，这两个阶段也会互相覆盖。氯霉素、宜他霉素和利福霉素等抗生素的情况比较特殊，它们与微生物的生长过程耦联，在微生物的指数生长阶段就能积累。营养物的浓度不但会影响微生物的生长速率，而且还会对结构基因的表达产生影响，因此在抗生素发酵中具有举足轻重的地位。 10.5.2.1碳源阻遏 葡萄糖是微生物生长的优质碳源，但在抗生素生产中却会抑制产物的合成。抗生素生产的实践已经证明用缓慢代谢的碳源代替葡萄糖往往能够显著提高抗生素的产量。葡萄糖的阻遏机理已经在不少抗生素的生物合成途径中得到了合理的解释。 在放线菌素生产菌Streptomyces antibioticus中，吩恶嗪酮合成酶受到葡萄糖的阻遏。正常情况下，该酶在细胞生长停止后合成、葡萄糖耗尽后活力增加，菌体内特定的mRNA的水平变化与此十分相似，因此有理由认为葡萄糖的遏制作用发生在转录水平。事实上，放线菌素生物合成过程中的所有酶都受到葡萄糖的阻遏。在Norcardia lactamdurans合成头霉素途径中，最后两个酶：ACV合成酶和扩展酶（Expandase）也受到葡萄糖的阻遏。 葡萄糖不抑制Penicillium chrysogenium中青霉素合成酶系的活性，但阻遏异青霉素N合成酶和ACV合成酶的生物合成。在C. acremonium中的异青霉素N合成酶也会受到葡萄糖或甘油的一定程度的阻遏，而扩展酶则会受到严重阻遏。扩展酶是一种不稳定酶，因此如果葡萄糖的浓度较高时头孢菌素的产量很低而异青霉素N则会大量积累。在C. acremonium中葡萄糖虽然不会阻遏ACV合成酶的合成，但该酶的活性却受到葡萄糖或糖酵解中间产物的抑制。 一般都将抗生素的碳源调节归因于与大肠杆菌中诱导酶阻遏机理类似的碳源分解代谢阻遏，但实际上两者的机理并不等同，在E. coli中，调节的对象是cAMP，而在放线菌和霉菌中则可以排除cAMP参与代谢的问题。 10.5.2.2氮源调节 抗生素生产受到高浓度氨离子的抑制是一个普遍存在的现象。事实上，抗生素只有在介质中的大部分氨已被消耗后才会开始合成，因此用缓慢利用的氮源代替氨可以显著增加抗生素产量。在链霉素发酵中用脯氨酸代替氨作为氮源使链霉素的产量提高了约三倍；在大环内酯类抗生素发酵中如在发酵液中加入能固定氨离子的磷酸镁，可以大大提高这类抗生素的产量。 根据对S. clavuligerus生产头孢菌素过程的研究，氨离子的作用不是抑制酶的活性，而是直接阻遏酶的合成，但阻遏的机理尚不十分清楚。在霉菌中，氨离子会抑制许多与氮源利用有关的酶，特别是在曲霉中，氨离子会抑制基因are A的表达，而该基因编码的蛋白质对转录有正调节作用。同样，霉菌中氨离子的阻遏作用和抗生素生物合成的内在联系还有待于进一步研究。 有人对氨离子抑制大环内酯类抗生素合成的机理提出了一种解释。构成大环内酯链的丙酸单元是分枝氨基酸的降解产物，降解的第一步是将氨基酸转化为酮酸，由缬氨酸脱氢酶或缬氨酸转氨酶催化。已经证明氨离子会阻遏和抑制缬氨酸脱氢酶，因此可以将氨基酸对抗生素合成的阻遏归因于缺少足够的前体物质。 10.5.2.3磷酸盐控制 在细菌、霉菌和植物中次级代谢产物的生物合成常常受到磷酸盐的控制。实际上，在高浓度磷酸盐的培养条件下所有次级代谢产物都将受到抑制，但是对磷酸盐抑制的敏感性却存在很大的差别。不同的产物之间、甚至同一细胞产生的不同次级代谢产物也会有不同的表现。S. clavuligerus发酵生产棒酸或头霉素就是一个典型例子，棒酸的合成受到磷酸盐的抑制，而头霉素的生产则基本上不受影响。因此只要调节磷酸盐的浓度进行培养就可以得到不同的产物。一般而言，如果抗生素的生物合成直接由氨基酸装配而成，它们对磷酸盐浓度的敏感性就比较小，如聚酮类和氨基糖苷类抗生素就是如此。 磷酸盐控制的机理一般是通过对酶合成的阻遏影响抗生素的生物合成，主要受阻遏的酶类是磷酸酶和合成酶。 磷酸酶 磷酸转移酶参与氨基糖苷的形成。在抗生素的生物合成途径中，首先合成的是磷酸化的无活性中间产物，然后经过酶催化脱去磷酸基团而生成最终的活性产物。 在S. glancescens 和S. griseus中，编码链霉素-6-磷酸磷酸转移酶的基因与其它生物合成基因相连接，而且受到磷酸盐的阻遏。在S. griseus培养时，过量的磷酸盐会造成链霉素-6-磷酸的积累，而在正常情况下，特殊的磷酸转移酶应该将链霉素-6-磷酸转化为有活性的抗生素。在S. fradiae培养时，新霉素生物合成的磷酸化中间产物转化为最终活性产物的过程也受到磷酸盐的抑制和阻遏。各种氨基糖苷类抗生素生物合成途径中都存在类似的磷酸化—脱磷酸反应。除氨基糖苷类外，其它抗生素合成中也可能存在这类反应，虽然磷酸盐所阻遏的究竟是什么酶还不是很清楚，但磷酸盐的阻遏作用是抗生素生产中普遍存在的现象。 合成酶类 许多反应中正磷酸既不是底物，也不是反应产物，但是催化该反应的酶仍有可能受到磷酸盐的阻遏。与放线菌生产抗生素的代谢途径中，有关的这类酶有：脱水四环素（ATC）氧化酶、p-氨基苯甲酸（PABA）合成酶和泰乐霉素发酵中的某些合成酶。 在S. aureofaciens中，ATC合成酶催化四环素合成途径中最后第二个反应，这种酶在细胞内的比活对培养基中的磷酸盐非常敏感，但经过提纯的酶活却不受磷酸盐的影响，说明是细胞内这种酶的合成受到了磷酸盐的阻遏而不是简单的抑制作用。与杀假丝菌素合成有关的PABA合成酶也受到磷酸盐的强烈阻遏，虽然磷酸盐的存在会激发RNA合成，但与PABA合成酶有关的基因pabS却受到了抑制。事实上已经鉴别出了pabS结构基因的启动子，该启动子受磷酸盐调节。在S. fradiae发酵生产泰乐霉素的生物合成途径中，已经发现至少有三种酶受到磷酸盐的阻遏，值得一提的是催化泰乐霉素合成最后一步反应的大菌素（Macrocin）O-甲基转移酶，该酶由基因tylF编码，也受到磷酸盐的阻遏。 在霉菌生产((内酰胺类抗生素的合成途径中也有一些酶受到磷酸盐的阻遏，如头孢菌素C合成途径中的几种酶，包括ACV合成酶、环化酶及扩展酶等都受到磷酸盐的阻遏，而且磷酸盐还起到了部分抑制酶活性的作用。 10.5.3自调节因子和多效应影响因子 细胞内存在的各种效应因子控制着微生物生命循环的必需步骤，如孢子和气生菌丝的形成及次级代谢产物的生物合成等。在许多菌株中已经鉴别出了能在非常低的浓度下作用于次级代谢的多效应影响因子，其中研究得最多的是A-因子，对B-因子及C-因子也开展了一些研究工作。 将少量的链霉素生产菌S. griseus的培养液加入非生产菌的培养液后，人们发现非生产菌也具有了产生链霉素的能力，并进而分离鉴定了造成这种变化的活性物质，将其命名为A-因子。A-因子的结构式如图10.5.1所示，它的学名是2-异辛酰基-3-R-羟甲基-(-丁酸内酯。 图10、5、1 A-因子的结构式 在S. griseus 和S.bikiniensis中，A-因子与某种蛋白质结合后，会对若干个基因的转录产生负效应，而对链霉素的合成和微生物对链霉素的抗性产生正效应。在其它放线菌中也分离得到了A-因子，同时发现，在不同的微生物中A-因子的功能有所差别。在某些菌种中，A-因子不是抗生素生产和孢子形成的必须物质。在S. bikiniensis和S. coelicolor中还分别克隆了控制生成A-因子的基因afsA和afsB。基因afsB的功能是编码对A-因子和几种色素有正调节作用的蛋白质，该蛋白质所引起的一系列表达能够解释由该基因引发的次级代谢和细胞分化的控制机理。 B-因子的结构与A-因子不同，它的学名是丁基-磷酰基腺苷。B-因子最早从酵母提取物中分离得到，它能使对抗生素和孢子形成均是阴性的Nocardia mediterranei突变株恢复利福霉素B的生产，但是不会形成气生菌丝，然后在同样是Nocardia mediterranei的抗生素生产菌种中也分离到了B-因子，因此一般认为它是一个自调节因子。 C-因子是一个分子量为34.5kDa的调节蛋白质，可释放到胞外。C-因子广泛分布于放线菌和真核细胞中，是细胞分化的指示剂，主要与分生孢子的形成有关，对抗生素的生产影响不大。 10.6微生物对抗生素的自抗性 抗生素具有杀死或抑制微生物生长的功能，因此抗生素的积累对产生抗生素的微生物本身当然也是不利的。如果能够提高产抗生素菌种的自抗性，显然能够大大提高抗生素的产量。因此有必要从基因水平了解自抗性的机理。 与抗生素生物合成有关基因的研究还刚刚开始，除了杆菌外，只有链霉菌的基因结构已经比较清楚，它们一般具有环状DNA，基因中G+C的比例为70~74%，每个基因约有6~9百万对碱基。链霉菌的基因不能被外源DNA转化，而且由于基因组经常发生重排而高度不稳定。霉菌的基因更复杂，约有2~4千万对碱基，霉菌巨大的线性DNA分子位于细胞核。 了解抗生素生物合成、调节和抗性机理并不需要知道基因组的全部结构。只要应用分子生物学技术将有关的基因克隆、鉴别出来就能满足要求。人们发现与抗生素生物合成、调节和抗性有关的基因常常聚集在一起，因此只要鉴别分离出其中的一个基因，就可以利用该基因作为“探针”进入染色体并分离出与它相连的其它基因。具体的方法有如下几种： 将生产抗生素的链霉菌DNA文库转移到另一个对抗生素敏感的链霉菌，选择抗性株，就能够得到自抗性的基因编码； 在抗生素生物合成途径被截断的互补突变株之间，根据其合成最终产物的能力是否恢复就可以知道生物合成基因是否转移； 与DNA探针杂交。该探针应来源于有类似生物合成途径的基因； 与合成探针杂交，合成探针应根据生物合成酶的氨基酸序列构建； 将抗生素的全部生物合成基因都克隆到宿主细胞，使一个原本不生产抗生素的宿主细胞能积累抗生素。 对抗生素生产而言，影响抗生素产量最关键的问题是产物的抑制作用。为了避免产物抑制微生物生长和抗生素合成，抗生素发酵只能在产物浓度很低的水平操作，从而降低了生产效率、提高了生产成本。为此许多人对于使生产抗生素的微生物产生对抗生素具有自抗性的机理进行了深入研究，获得了提高对抗生素产生自抗性的方法，主要有以下三种： 通过抗生素的化学改性或物理结合降低抗性； 通过改变抗生素在其生产菌中合成的目标位置以减少抗性； 通过改变抗生素在细胞膜中的通透性及通量降低抗性。 最常用的对抗生素结构的化学修饰是通过乙酰CoA使氨基N-乙酰化和在ATP的参与下使羟基磷酰化，经过修饰的抗生素将失去抗菌活性，从而降低了对微生物的抗性。许多抗生素生产菌的N-乙酰化酶和O-磷酰化酶的基因已经编码，大多数生产菌中只有编码一种酶的基因，只有少数例外，如新霉素的生产菌(S. fradiae, M. chalcea, S. albogriseolus)中编码两种酶的基因都存在。在抗生素生物合成途径中这些酶起到了胞内减毒剂的功能，如嘌呤霉素生产菌S. alboniger中，通过基因pac的作用解除了抗生素的N-乙酰基中间产物对生产菌核糖体的遏制作用。 值得注意的是一些抗性基因在异源宿主中表现出对药物的抗性，但在其原来的菌体中却有着不同的功能。例如从卡那霉素生产菌中分离得到的aac基因编码氨基糖苷乙酰转移酶，只是在卡那霉素生物合成中催化中间产物的转化，但若在抗生素敏感菌S. lividans中表达后却成了抗性因子。 另一类使抗生素失活的酶是((内酰胺酶。链霉菌在生产((内酰胺时有三种方法产生对该化合物的抗性：产生((内酰胺酶、产生与青霉素键合的蛋白及渗透性控制。其中起主要作用的是青霉素键合蛋白对抗生素的低亲和性结合。抗生素键合蛋白与药物结合后，可以避免与目标分子的接触，但这种抗性的能力有限，当抗生素浓度超过一定程度后就会影响到细胞的成活。 抗生素特定作用目标的改变可以使微生物对抗生素不敏感或降低敏感性。有些生产菌的抗生素作用目标对内源抗生素具有耐药性，如S. lactamdurans和S. cinnamoneus中含有改进型的EF-TU分子，伸长因子TU本来是敏感菌株的目标分子，但改进后的EF-TU分子对这两个菌种产生的埃福霉素(Efrotomycin)和黄丝链菌素(Kirrothricin)都具有抗性。有些报道发现高产菌株对目标分子的抗性比野生菌株要高得多。也有一些生产菌能够在抗生素生物合成的同时“诱导”耐药性目标分子的表达，而在微生物的其它生长阶段产生的则是敏感分子。新生霉素生产菌S. sphaeroides就是一个典型例子，它有两个DNA回旋酶，其中的一个在营养菌丝生长阶段产生，对抗生素敏感，另一种在抗生素生产阶段表达，对抗生素有明显的抗性。另一类抗生素生产菌的目标分子会被某种酶修饰后变成具有抗性的分子。例如S. azurens 产生的Thiostrepton能与核糖体子单元（50S）结合，是蛋白质合成的抑制剂。但生产菌能够表达一种甲基化酶，能在rRNA的23S腺苷残基的核糖上引入甲基，这样避免了抗生素与核糖体结合，这是第一个发现的核糖体抗性机理。此后的研究表明rRNA转录后甲基化是一种非常普遍的抗性机理，只是不同菌的甲基化位置有所差别，有些在23S，另一些在16S。 使抗生素生产菌对其本身产生的抗生素产生抗性的另一个因素是将所产生的抗生素及时释放到胞外而且防止它们重新进入胞内。大环内酯类和四环素类抗生素的释放机理已经比较清楚，抗生素输送蛋白的基因已经鉴别，该基因的编码依赖于ATP。 10.7抗生素生产菌种的选育 新筛选出来的能够产生抗生素的野生菌生产水平很低，一般每升发酵液只含有几毫克的抗生素，这样的水平当然满足不了生产要求。即使用于新抗生素的结构鉴定、动物试验及临床试验，也需要提供足够数量的抗生素样品。因此当筛选得到一种新抗生素后就要同时开展菌种的改进工作。提高抗生素产量并不是育种的唯一目标，改进抗生素生产菌的传代（基因）稳定性、筛选出能在价格低廉的培养基中生长而且低耗氧的菌种也是重要的目标。选育的主要方法有：菌种的提纯、诱变育种及基因重组。 10.7.1菌种的提纯 无论是新分离得到的还是经过诱变处理的菌株，菌种的提纯都十分重要。一个菌落往往是由几个基因型的菌种组成的群体，由于基因型的不同，它们生产抗生素的能力也存在很大的差异，因此必须将它们分离才能获得真正的高产菌种。提纯菌种的方法一般采用在不同的平板上进行稀释培养，注意观察它们的形态差异和遗传稳定性，并进一步测定它们的抗生素生产能力和生产稳定性，为以后的菌种选育和培养条件优化打下坚实的基础。 10.7.2诱变和筛选 经验证明，提高菌种抗生素生产能力最有效的方法是通过诱变和筛选的方法。一些抗生素产生菌种通过诱变和筛选使生产能力提高了几千倍的例子很多。通过诱变育种提高抗生素产量不完全是由于生物合成效率的提高，主要还是因为控制抗生素生物合成的调节机理被破坏，使得生物合成向有利于抗生素合成的方向进行。一般而言，通过诱变产生正突变的概率很低，筛选的工作量非常大，因此必须合理设计诱变和筛选过程并采用推理育种的方法以提高突变株中高产菌株的比例。 理想的诱变处理应该利用单核细胞，对于菌丝类微生物最好利用休眠或发芽的孢子，但是对放线菌而言，高产菌种往往会丧失形成孢子的能力，因此要选择菌丝片段作为诱变和筛选的对象，菌丝要预先经超声破碎以获得单核或多核的片段，然后再进行诱变处理。 传统的诱变剂是氮芥、紫外线和亚硝基胍等。为了提高诱变的效率，几种不同的诱变剂及不同的诱变剂量常交替使用。经诱变处理后得到的大量菌落需要进行筛选和鉴别，这是一项工作量很大的任务，因此有必要研究一种高效率的筛选方法，最好能有选择性标记，如抗生素的抗性标记。诱变处理的目标应该是每个核只经受一次突变，因为若一个核经受了两次或多次诱变，可能会产生相反的结果而互相抵消。 经诱变处理后，一般情况下DNA分子的双螺旋结构中只有其中的一股发生了突变，或两股分别发生了不同的突变。如果是菌丝的多核片段进行诱变处理，还有可能出现同一片段中有些核发生了突变，而有些没有发生突变或发生了不同的突变，因此必须将发生突变的核提纯。可以将菌丝片段在营养丰富的培养基中传代几次后，经过均质、超声振荡及稀释后在平板上进行分离提纯。 诱变处理使突变株的抗生素生产能力已经很大提高后，要进一步提高产量就比较困难。新的诱变可能会引起抗生素产量的小幅增加，但由于摇瓶发酵时的误差，有时会忽略这种小幅度的产量增加，这时就应该应用循环筛选的方法以保证即使抗生素的产量增加幅度不大的突变株也不会被忽略。 与任意筛选方法相比，推理筛选获得高产菌种的可能性要大得多。推理育种的主要原则是： 筛选对抗生素具有抗性的突变株。如前一节所讨论的，许多抗生素生产菌都对其所产生的抗生素敏感。通过逐步提高培养基中抗生素的浓度，可以筛选到对高浓度抗生素具有抗性的突变株，这说明突变株的抗生素生物合成调节机制已经发生了变化。这种突变株可能就是抗生素的高产菌，如果暂时还不是，则可以作为进一步诱变育种的出发菌。 筛选菌体形态变异的菌株。经验表明，高产菌株的菌落形态往往与出发菌有明显不同。当然菌落形态变化的菌株不一定就是高产菌，有些还可能是非产生菌。但即使是非产生菌，也不要轻易丢掉，它们可以用于抗生素代谢机理的研究或作为进一步诱变育种的出发菌。 非生产突变菌的回复突变。经诱变处理后，非生产突变株的鉴别和分离比较容易，如果该突变株产生抗生素能力的丢失是由于调节机理的改变而引起的，则经过再次诱变处理后，很可能会发生回复突变而成为抗生素高产菌。 选择性脱毒。某些化学试剂，主要是铜、铝、汞等金属离子，这些金属离子对抗生素产生菌有毒，会抑制菌的生长。但它们能够与抗生素结合形成稳定的络合物，络合物无毒，因此不会影响菌体的生长和代谢。根据以上原理，如果将诱变处理后的菌种接种到含金属离子培养基的平板上进行筛选，那些不产生抗生素或产量不高的突变株的生长将受到抑制，而抗生素高产菌由于能大量生产抗生素，而抗生素又能与培养基中的金属离子形成无毒的络合物，就能够在该平板上生长良好。 筛选出添加生物合成前体后能提高抗生素产量的突变株。有时，抗生素产生速率的限制步骤是其生物合成前体的生产，这种前体往往是一种初级代谢产物，因此在培养基中添加这种前体物质就能大大提高抗生素的产量，在此基础上还能进一步筛选到对该前体的类似物具有抗性的突变株，或解除前体生物合成途经中反馈抑制的突变株以提高前体的生成速率，满足抗生素生物合成的需要。 以上介绍的抗生素推理育种方法已经广泛用于抗生素高产菌种的选育，并有许多成功的例子。下面将以维吉尼亚霉素生产菌种的选育为例介绍抗生素菌种的育种过程。 例10.7.1维吉尼亚霉素(Virginiamycins)生产菌种的选育 图10.7.1 维吉尼亚霉素的两个组分M和S 维吉尼亚霉素由两个具有协同作用的组分（组分M和组分S，见图10.7.1）组成，是环状的聚肽酯内酯，可溶于有机溶剂，难溶于水，是蛋白质合成的抑制剂，对Gram阳性菌有抑制作用，但是不能被肠吸收。常用作外科用药及饲料添加剂，有促进动物生长的作用。维吉尼亚霉素的生产菌是1954年从比利时的一个土壤样品中筛选得到的，命名为S. virginiae，原菌种编号为899，对自身产的抗生素和噬菌体敏感，因此野生菌种899的维吉尼亚霉素产量很低。维吉尼亚霉素高产菌种选育种的关键问题是要解除产物的抑制作用和增加对噬菌体的抗性，主要采用了如下的诱变育种方法： 物理和化学诱变。利用紫外线或氮芥处理的方法筛选维吉尼亚霉素产量高、菌丝形态好及遗传性能稳定的突变菌株。原菌株899只能在菌丝的生长阶段产弗吉尼亚霉素，随着抗生素的积累，由于它对蛋白质合成有抑制作用，菌体生长和抗生素生产迅速停止。经过诱变处理后，维吉尼亚霉素产量达到了250(g/mL，于1958年获得了第一个能用于工业生产的菌株PDT30。 维吉尼亚霉素抗性菌株。通过在液体或固体培养基中或在连续培养过程中不断提高维吉尼亚霉素的浓度，筛选抗性菌株，获得了维吉尼亚霉素产量达到1000(g/mL的PDT1830菌株（1961年），该菌株能形成红棕色色素。 去除两种噬菌体和类大肠菌素物质的影响。人们发现菌丝的生长在液体深层培养30小时就会停止，并随着发生菌丝的裂解，裂解因子能够通过孔径0.45(m的过滤器、在80oC时稳定、pH大于8.0或小于2.0时不稳定，同时确定了该裂解因子是噬菌体(S1。通过诱变在固体培养基上选育出了即使该噬菌体浓度高达108个/ mL时菌丝也不会裂解的抗性突变株。但是问题并未完全解决，在培养30小时后菌丝再次发生了裂解，人们认识到菌种对噬菌体的抗性还不完全，从而进一步发现了存在第二种噬菌体(S2，并从生长在裂解圈内的菌斑中筛选得到了对两种噬菌体都有抗性的突变株。解决了噬菌体问题后，发现弗吉尼亚霉素的深层液体发酵还受到另一种物质的抑制，并鉴别出是一种大肠菌素的类似物质。它不能用透析方法除去，能被硫酸胺沉淀，被蛋白水解酶失活，能吸附到对其敏感的活细胞上，而且在紫外线诱变后能提高其产量。在含有高浓度类大肠菌素的培养基中可以筛选到抗性突变株，从几百个突变株中获得到了两株完全不产类大肠菌素的突变株，最终获得了稳定、高产的维吉尼亚霉素生产菌种R81。 降低维吉尼亚霉素S组分的抑制作用。通过深入研究，人们发现在发酵的早期加入S组分将会大大降低S组分维吉尼亚霉素的产量，但对微生物的生长却影响不大；在发酵20小时后添加则对产量也没有影响。而M组分的存在对产量和生长都没有明显的影响。为此，在添加了S组分的固体平板上筛选了S组分抗性、但保持了M组分生产能力的突变株，从8,000个菌株中筛选到了R341菌株，它的维吉尼亚霉素生产能力比R81又提高了60%。一个有趣的现象是：在培养基中添加10-4M硫酸镍也能消除S组分的抑制作用，因为S组分能与镍离子经可逆反应形成络合物。 全面优化菌种、培养基组成和发酵条件。R341菌种经进一步的诱变处理和培养条件的优化后得到了R1081菌株，但是发现在正常培养的R1081中有2%的白色变种，再经口丫啶黄素或溴化乙锭处理后白色变种增加到了20%，但不会影响维吉尼亚霉素的产量。于是在含低浓度蛋白质和碳水化合物的培养基中对这些变种进行了分离，获得了SV32菌株，它对维吉尼亚霉素具有高度抗性，而且即使在较差的种子培养基中也能保持稳定。 营养缺陷型和氨基酸类似物抗性菌株的选育。氨基酸是维吉尼亚霉素合成的前体，前体合成的速率也会影响到抗生素的产量，因此应该解除前体合成时的反馈抑制和阻遏。采用了化学诱变(N-甲基-N’硝基-N-亚硝基胍, 100~500(g)、热处理（100~130oC处理1~45分钟）及近紫外线(365nm, 90min)处理，并添加100(g/mL的8-氧化补骨脂素，获得了多重营养缺陷型菌株和氨基酸类似物抗性菌株，并结合转导、原生质体融合等手段，最终获得的最好菌株是苯丙氨酸类似物抗性菌株SV3582及蛋氨酸类似物抗性菌株SV6282。 通过以上一系列的菌种选育步骤，经过对90,000多个菌株的筛选，使最终获得的生产菌株产维吉尼亚霉素的能力比野生菌种提高了1,000倍以上。 10.7.3基因工程在抗生素生产菌选育中的应用 事实证明，应用基因工程的方法可以大大改进微生物的抗生素生产能力。基因重组既可以采用传统的接合、转导、转化及原生质体融合等方法，也可以通过现代的基因工程技术对基因进行直接操纵来实现。本节将介绍这方面的一些成功实例。 通过微生物的自然生殖系统改良菌种的方法一般适用于霉菌，经过准性生殖循环可以获得单倍体分离子或双倍体杂交子，往往比亲本具有更高的抗生素生产能力。有人针对青霉素生产菌P. chrysogenum进行了研究，发现在两个有不同标记的亲本间杂交后筛选异核体，所得到的二倍体产青霉素能力明显高于亲本。这种方法也可以用于放线菌，应用例子是卡那霉素高产菌株的选育，通过营养缺陷型S. rimosus（巴龙霉素生产菌，也生产少量的新霉素）和S. kanamyceticus（卡那霉素生产菌）的种间杂交，所得到的原养型重组菌卡那霉素生产能力高于亲本。 原生质体融合技术广泛应用于抗生素生产菌的育种。这种技术不需要掌握抗生素的生物化学和基因方面的详细知识，但针对每一种微生物必须要有一套获得原生质体并使其再生的有效方法。原生质体融合技术在霉菌和放线菌中均能应用。一个成功例子是通过C. acremonium的原生质体融合获得头孢菌素C生产菌，而且分离出了能有效利用无机硫酸盐的菌种。利用原生质体融合技术得到的P. chrysogenum能够快速生长，而且基本不产p-羟基青霉素V。由于p-羟基青霉素V是青霉素V的污染物，会干扰青霉素V化学转化为头孢菌素的过程，因此该菌种生产的青霉素V适合用于半合成抗生素生产。 重组DNA技术为抗生素生产菌种的选育提供了新的工具。由于抗生素是分子结构复杂的非蛋白质产品，参与抗生素生物合成的酶很多，要将编码这些酶的基因都克隆到一个质粒显然既不可能也没有必要。因此重组DNA技术在抗生素生产中的应用往往采用代谢工程的方法，即根据对抗生素代谢途径和调节机理的了解和分析，找出影响抗生素产量的主要因素，进而对与这些因素有关的基因进行改造，如对结构基因的强化及对条件和抗性基因的改造等。 在抗生素的生物合成途径中，往往可以鉴别、确定影响抗生素合成的限速步骤，这样催化该反应的酶就成了提高抗生素产量的关键，如果能通过重组DNA技术增加微生物中编码这种酶的基因剂量，就可以提高酶的表达量，从而提高抗生素产量。有人研究了用C. acremonium生产头孢菌素C的生物合成途径中，限速步骤是中间产物青霉素N的扩环和脱乙酰头孢菌素C的羟基化，催化这两个反应的酶都由基因cefEF编码，将该基因克隆到有潮霉素抗性标记的质粒中并转导到生产菌株，实验证实该工程菌中存在额外的cefEF基因拷贝数，而且头孢菌素C生产水平显著提高。 上一节的讨论已经提到抗生素生物合成的基因群中包括调节基因，调节基因的作用是阻遏或诱导结构基因的表达。在次甲霉素生产菌S. coelicolor中，次甲霉素的合成受到处于基因群末端DNA片段的负调节，将该片段改变或删除后就能够增加抗生素的产量；同样在这种微生物中，基因actII起正调节作用，因此增加该基因的拷贝数也能大幅度提高抗生素产量。 道诺红霉素生产菌S. peucetius中的dnrR1和dnrR2DNA片段能够刺激次级代谢产物的生产并增加微生物对产物的抗性。研究工作证明，在野生型菌株中插入这两个基因片段能增加道诺红霉素和它的一个关键中间产物的产量，将dnrR2DNA片段插入产物敏感型的生产菌则有利于提高其抗性。 目前代谢工程在抗生素生产中的应用还是初步的，关键问题是目前对抗生素生物合成途径和调节控制机理的认识还非常有限，对放线菌及霉菌等主要抗生素生产菌种的基因还缺乏了解，掌握的质粒也不多。可以预料，随着人们对抗生素合成基因的研究不断深入，代谢工程在提高抗生素产量方面是大有可为的。