第八章 核苷、核苷酸及其类似物的微生物发酵 8. 1 引言 人们发现许多核苷酸类物质都具有强化食品风味的功能,因此利用微生物发酵生产核苷和核苷酸的主要应用领域是在食品工业中作为风味强化剂。按强化能力的大小次序排列为:鸟嘌呤核苷酸(5’-GMP)>肌苷酸(5’-IMP)>黄嘌呤核苷酸(5’-XMP)。同时还发现当5’-GMP或5’-IMP的钠盐与谷氨酸钠合用时具有协同强化作用。而5’-AMP及其2’-和3’-的异构体、5’-脱氧核糖核苷酸、核苷及嘧啶类核苷酸则没有强化功能。核苷、核苷酸及其衍生物的另一重要应用领域是用于临床治疗药物,嘌呤类似物8-氮鸟嘌呤和6-巯基嘌呤具有与抗生素类似的功能,可以抑制癌细胞的生长;9-(-D-阿拉伯呋喃糖基腺苷聚肌胞则能用于治疗疱疹;S-腺苷蛋氨酸及其盐类用于治疗帕金森氏症、失眠并具有消炎镇痛作用。此外核苷酸在农业上也有良好的应用前景,用核苷酸及其衍生物进行浸种、蘸根及喷雾,可以提高农作物的产量。一些重要的核苷、核苷酸及相关产物见表8.1.1。 表8. 1.1 一些重要的核苷、核苷酸及相关产物 名称 估计年产量,吨/年 用途  5’-IMP(肌苷酸) 3, 000 食品添加剂  5’-GMP(鸟苷酸) 2, 000 食品添加剂  Inosine(肌苷) 500 心脏病  胞苷二磷酸-胆碱 4 强心剂  ATP(三磷酸腺苷) 200 肌肉营养不良  FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸) 少量生产 肝或肾病  NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸) 少量生产 肝或肾病  腺嘌呤 少量生产 白细胞减少  腺苷 少量生产 冠状缺陷、咽炎、高血压、动脉硬化  5’-AMP(腺苷单磷酸) 少量生产 循环系统疾病、风湿症  CAMP(环腺苷单磷酸) 少量生产 糖尿病、气喘、癌症等  乳清酸 少量生产 肝病  6-氮尿苷 少量生产 癌症   目前工业上主要通过RNA的酶法水解生产核苷酸。RNA的来源很广,如啤酒厂的废酵母、单细胞蛋白及其它发酵工业的废菌体等,其中以酵母中提取RNA最为常见。有时还专门培养高RNA含量的酵母供提取核苷酸生产之用。细菌、酵母及霉菌中的DNA及RNA含量列于表8.3.2。RNA水解酶一般来自于Penicillium citrinum和Streptomyces aureus这两个菌种的突变株。提取工艺包括细胞破碎、核酸水解及核苷酸分离等步骤。六十年代初RNA酶法水解生产核苷酸在日本投入了工业化生产。 表8.3.2 细菌、酵母及霉菌中的DNA及RNA含量 微生物 DNA含量,% RNA含量,%  细菌 0.37-4.5 5-25  酵母 0.03-0.52 2.5-15  霉菌 0.15-3.3 0.7-28   有些核苷及核苷酸类产品采用直接发酵法生产,如肌苷、5’-IMP和5’-GM等。本章将主要讨论直接发酵生产核苷及核苷酸的微生物、代谢途径和调控机制。 8. 2核苷酸的代谢机理 8.2.1嘌呤类核苷酸的生物合成途径及调节机制 核苷酸是细胞内合成RNA及DNA的基本结构单元,在正常的细胞代谢中将保持在一定的生理浓度范围内。要使微生物能够过量产生核苷酸或核苷就必需掌握它们的代谢途径和调节机理,有目的地对微生物进行诱变和筛选,才能获得高产菌株。图8.2.1显示了在Bacillus subtilis中嘌呤类核苷酸的生物合成途径及调节机制。IMP是GMP和AMP生物合成的前体,由于胞内IMP脱氢酶的比活要比腺苷琥珀酸合成酶的比活高10-30倍,IMP主要转化为GMP。但是,IMP脱氢酶又受到XMP和GMP的反馈抑制和阻遏,而GMP合成酶则基本上不受GMP的影响,这样当GMP浓度较高时,IMP就会转化为AMP。AMP的合成主要受到AMP对磷酸核苷高磷酸(PRPP)酰胺基转化酶反馈抑制的调节,只要0.2mM的AMP就能使PRPP酰胺基转化酶的比活降低50%,而达到同样抑制作用的GMP浓度需要2mM。AMP对腺苷基琥珀酸合成酶和腺苷基琥珀酸裂解酶也存在着反馈抑制。 图8. 2. 1 在Bacillus subtilis中嘌呤核苷酸生物合成途经及其调节机制 1:PRPP酰胺基转移酶;2:IMP脱氢酶;3:腺苷基琥珀酸 合成酶;4:GMP合成酶;5:腺苷基琥珀酸裂解酶 8.2.2嘧啶核苷酸的生物合成途径和调节机制 图8.2.2显示了嘧啶核苷酸的生物合成途径和调节机制。从图中可以看到,嘧啶核苷酸是从NH3、CO2和ATP合成氨基甲酰磷酸开始,再与天冬氨酸结合生成氨基甲酰天东氨酸,经闭环后生成二氢乳清酸,从而形成了嘧啶环。乳清酸进一步与PRPP反应生成乳清核苷-5’-磷酸,再经过脱羧反应生成5’-UMP,5’-UMP经磷酸化后依次生成5’-UDP及5’-UTP,后者按如下反应生成5’-CTP: 5’-UTP + NH3 + ATP 5’-CTP + ADP + Pi 在嘧啶核苷酸的生物合成途径中,主要的调节酶是天冬氨酸转氨基甲酰酶。它是一个变构酶,受到CTP的强烈反馈抑制,UMP、UDP及UTP也对该酶具有抑制作用,ATP则对它有激活作用,因此ATP的存在对CTP的抑制具有拮抗作用。 图8.2.2 嘧啶核苷酸的生物合成途径及调节 8.3核苷酸类物质生产菌的分离和选育 8.3.1核苷酸类物质生产菌的分离 从野生菌中直接筛选核苷及核苷酸生产菌的方法主要有生长圈法和特殊平板培养法。 8.3.1.1生长圈法 用生长圈法筛选核苷酸产生菌的机理是利用核苷酸产生菌能够促进嘌呤营养缺陷型大肠杆菌生长,因而能形成较大的生长圈。具体方法是将非精确的嘌呤营养缺陷型大肠杆菌(如E. Coli P64或B94)与不含嘌呤的琼脂混合后倒成平板,在平板表面涂布受检的细菌,在一定条件下培养。如果被检菌能够产生嘌呤类产物,在其周围形成生长圈,然后挑选生长圈较大的菌落进行进一步的鉴定后作为诱变育种的出发菌株。 也可以将被检菌株先在平板上培养,出现菌落时用紫外线照射杀菌。再用鸟嘌呤营养缺陷型的枯草杆菌的固体培养基覆盖于平板上,经过一定温度下的保温培养,如果发现能够生长的突变株,就说明它能够产生核苷类物质。 8.3.1.2 特殊平板培养法 采用含有高浓度的磷酸盐、镁盐、葡萄糖和锰盐的琼脂平板培养基也能用于筛选产核苷酸类物质的微生物,具体的筛选步骤如下: 采集哺乳动物、鸟类的粪和土壤样品。 分离培养基的成分为(%):葡萄糖10,琼脂2.0, KH2PO4 1.0, MgSO4(7H2O 1.0, CaCl2(2H2O 0.01, FeSO4(7H2O 0.001, MnSO4(4H2O 0.0001, 生物素30(g/L, 泛酸钙10mg/L, 硫胺素盐酸盐5 mg/L, 叶酸2 mg/L, 烟酸2 mg/L, 吡哆醛4 mg/L, 酚红15 mg/L。尿素经单独灭菌后加入培养基中,培养基调节pH8.2。 将粪或土壤样品悬浮液进行平板分离,300C培养2-3日,挑出培养基上的菌落。 3)检验产核苷酸能力 将上述挑得的菌株分别进行培养并检验产核苷酸能力。种子培养基和发酵培养基的组成分别如下。 种子培养基(%):葡萄糖2,蛋白胨1,肉膏1,NaCl 0.25,pH7.0。 发酵培养基(%):葡萄糖10,KH2PO4 1.0, MgSO4(7H2O 1.0, CaCl2(2H2O 0.01, FeSO4(7H2O 0.001, 酵母膏0.5-1.0, 生物素30(g/L; 也可以采用葡萄糖10,KH2PO4 1.0, MgSO4(7H2O 1.0, CaCl2(2H2O 0.01, FeSO4(7H2O 0.001, 肉膏0.2, 生物素30(g/L, 泛酸钙10mg/L, 硫胺素盐酸盐5 mg/L的培养基。 灭菌前pH8.0-8.2,尿素(0.6%)单独灭菌后加入。在培养初期需添加3 mg/L的嘌呤碱基。300C振荡培养5日后,分析发酵液中的核苷酸含量。 特殊平板分离法适用于分离两步法发酵生产核苷酸的微生物。 8.3.1.3核苷酸类物质生产菌选育 主要的核苷酸生产菌一般属于产氨短杆菌和枯草杆菌。1967年发现产氨短杆菌ATCC6872在嘌呤碱基存在下可以生产相应的核苷酸,如:由腺嘌呤生产腺苷酸,由次黄嘌呤生产肌苷酸及由鸟嘌呤生产鸟苷酸等。随着对该菌株研究工作的深入,通过诱变育种,获得了生产各种核苷酸的突变株,图8.3.1显示了诱变谱系及相应的产物。 图8.3.1 产氨短杆菌的诱变谱系和产物 (DES:硫酸二乙酯;MNNG:N-甲基-N’-硝基N-亚硝基胍;UV:紫外线; AL:腺嘌呤不完全缺陷型;A—:腺嘌呤缺陷型;Mns:锰敏感型;MnI:锰不敏感型; Ntw:核苷酸分解酶弱;6-MGr:6-巰基鸟嘌呤抗性;Docr:迪古霉素抗性) 枯草杆菌一般具有较高的磷酸酯酶活性,能够将核苷酸转化为核苷。1963年,日本味之素公司用X射线处理枯草杆菌获得了肌苷生产菌,此后关于用X射线、紫外线及化学诱变等方法处理枯草杆菌的报道很多,诱变后的枯草杆菌分别具有积累肌苷、鸟苷、腺苷及黄苷等的能力。 DNA转化法也常用于肌苷及鸟苷生产菌的育种。该方法首先要从枯草杆菌制备转化用的高纯度DNA,其方法如下:用溶菌酶使细胞壁溶解,冰冻后解冻,进一步用酚和pH9缓冲液的混合物在十二烷基磺酸钠存在下抽提核酸,核酸用胰RNase(EC2.7.7.16)和RNase T1(由EC3.1.4.8制备)使RNA消化,再用含酚缓冲液抽提即可获得具有高转化性的DNA。DNA转化则可以按如下步骤进行:将受体细胞在Difco抗菌培养基3通气培养至对数生长期结束时分离出菌体,洗涤菌体并以1:10比例重新悬浮于5毫升CHT-2培养基,于370C培养4小时,将细胞分离后洗涤;再次以1:10比例悬浮于CHT-10培养基,取0.9毫升于300C培养90分钟,添加1毫升DNA溶液(DNA浓度为1微克/毫升),继续培养30分钟后添加脱氧核糖核酸酶20微克/毫升并加镁盐浓度至0.01mol/L。继续保温10分钟后取0.1毫升的细胞悬浮液到基础培养基中进行培养,370C培养40-48小时后检查生产核苷的能力。 8.4发酵法生产核苷酸类物质 8.4.1发酵法生产5’-IMP 5’-IMP可以通过以下途径生产:1)微生物发酵法生产肌苷,然后通过化学反应磷酸化得到5’-IMP;2)直接发酵法生产5’-IMP;3)发酵法生产腺嘌呤或5’-AMP,再采用化学或酶催化转化为5’-IMP;4)将化学合成的次黄嘌呤通过微生物转化生产5’-IMP。本节将介绍前面两种生产方法,其中第一种方法的产物肌苷本身就可以直接用于医药工业。 在细胞内合成的5’-IMP不能透过细胞壁释放到胞外,但是通过胞内的脱磷酸反应生成肌苷后就可以释放到胞外。野生微生物产肌苷的能力很低,必须采用诱变育种的方法才能提高肌苷的产量。根据图8.2.1所示的5’-IMP生物合成途径和调节机制可以看到,诱变育种的目标应该是解除AMP对PRPP酰胺基转移酶的反馈抑制及切断5’-IMP继续代谢生成GMP和AMP的途径。由此可见,筛选AMP和GMP营养缺陷型突变株(Ade(和Gua()是提高肌苷产量的有效方法。为了使IMP脱氢酶和腺嘌呤基琥珀酸合成酶失活或降低活性,则应该筛选对鸟嘌呤及腺嘌呤类似物抗性的突变株以阻遏这两种酶的合成。此外,如果采用枯草杆菌进行诱变育种,某些氨基酸也会抑制5’-IMP的生物合成,因此选育组氨酸、苏氨酸及酪氨酸缺陷型突变株也有利于提高肌苷的产量。 表8.4.1 肌苷发酵微生物及其遗传标记 突变株 遗传特征 肌苷产量,g/L  枯草肝菌(Bacillus subtilis)  No. 2 Ade(  0.21  B-4 Ade( His(  4.46  C-30 Ade( His( Tyr(  10.50  RAD-16 Ade( Trp( Red( Dea( 8AGr  18.00  产氨短杆菌(Brevibacterium aminomiagenes)  KY13714 Ade( 6MGr Gua(  13.60  KY13761 Ade( 6MGr 6MTPr Gua(  30.0  41021 Ade( 6MGr Gua(,IMP生物合成酶系不受AMP、ATP和GMP的阻遏,也不受腺嘌呤和鸟嘌呤抑制  52.4  微杆菌(Microbacterium sp.)  No. 250 Bio(.6MPr 8AGr MSOr 6TGr  35.0  注:营养缺陷型:Ade(:腺苷;Bio(.:生物素;Gua(:鸟嘌呤;His(:组氨酸;Tyr(:酪氨酸;Trp(:色氨酸。酶缺失型:Red(:GMP还原酶;Dea(:AMP脱氨酶。类似物抗性:8AGr:8-氮鸟嘌呤;6MGr:6-巯基鸟嘌呤;6MTPr:6-甲基硫嘌呤;MSOr:蛋氨酸亚砜;6TGr:6-硫鸟嘌呤;6MPr:6-巯基嘌呤 许多腺嘌呤营养缺陷型菌株,如:Bacillus、Corynebacterium、Streptomyces及Saccharomyces等都能够产生肌苷。几种典型的肌苷发酵菌种及其遗传标记列于表8.4.1。从表中可以看到,通过合理设计诱变育种程序和方法,能够大幅度地提高肌苷的产量,其中以微杆菌No.250和产氨短杆菌41021的产量较高,分别达到了35和52.4g/L。 肌苷分子中氮含量比较高(20.9%),因此培养基中应该有充分的氮源,氯化铵、硫酸铵或尿素都能用作为氮源,但以使用氨气较为适宜,氨气既能用作为氮源,又能起到调节pH的作用。当用枯草杆菌发酵生产肌苷时,培养基中需要添加干酵母或粗RNA抽提物以提高培养基中腺嘌呤含量; 最佳pH范围为6.0-6.2;最佳温度为30-340C。培养介质应保持低的CO2浓度。此外,磷酸盐浓度、镁离子和钙离子、黄血盐及溶氧等因素都对肌苷的积累有比较大的影响。 8.4.2 直接发酵生产5’-IMP 能够用于直接发酵生产5’-IMP的微生物必须满足以下三条要求: 突变株应缺失琥珀酰AMP合成酶,消除AMP对PRPP酰胺基转移酶的反馈抑制; 具有降解5’-IMP能力的酶活应仅可能保持在低水平; 必须增加细胞壁的渗透性,使产生的5’-IMP能及时地释放到胞外。 表8.4.2 直接发酵生产5’-IMP的微生物 突变株 遗传特征 5’-IMP产量, g/L  枯草杆菌A-1-25 Ade( Nuc(  0.6  谷氨酸棒杆菌 Ade( 6MPr  2.0  产氨短杆菌 KY 7208 Ade(  5.0  产氨短杆菌 KY13102 Ade(  12.8  产氨短杆菌 KY13105 Ade(, 对Mn2+不敏感  19.0   几种能直接发酵生产5’-IMP的微生物及其遗传特征列于表8.2.2。从表中可以看到,腺嘌呤营养缺陷型、核苷酸酶缺失、6-巯基嘌呤抗性突变菌株有利于提高5’-IMP的产量。产氨短杆菌的突变株KY13105是工业上应用的菌种,它的优点是细胞的渗透性好,5’-IMP的结累不会受到Mn2+的影响。 产氨短杆菌 KY 7208和KY13102对Mn2+敏感,培养介质中的最佳Mn2+浓度为0.01-0.02mg/L,较高浓度时会降低5’-IMP的产量。在产氨短杆菌 KY13102培养的开始2-3天内,主要在胞外积累次黄嘌呤,随着5’-IMP浓度上升,次黄嘌呤的浓度开始下降。这一现象说明次黄嘌呤是在细胞外经过磷酸化反应才生成5’-IMP的,其反应机理见图8.4.1。但是在随后的发酵阶段,5’-IMP直接在胞内生成并释放到胞外介质中,不再需要胞外的磷酸化反应。培养介质中的磷酸盐和硫酸镁的浓度对5’-IMP积累很重要,应分别保持在1%和2%,同时培养基还应该提供腺嘌呤以满足细胞生长的需要。 8.4.3直接发酵法生产5’-GMP 由于PRPP酰胺基转移酶、IMP脱氢酶及GMP合成酶都受到反馈调节,5’-核苷酸酶和5’-核苷酶又都能降解5’-GMP,同时,5’-GMP还能被GMP还原酶转化为IMP,因此野生微生物基本上不积累5’-GMP。目前5’-GMP基本上都采用发酵和化学合成结合的方法生产,主要的有以下四条路线: 发酵法生产AICAR(5-氨基-4-咪唑基羧基酰胺核苷),然后化学合成5’-GMP; 发酵法生产鸟嘌呤,再经化学磷酸化生产5’-GMP; 发酵法生产黄嘌呤或5’-XMP,然后酶法转化为5’-GMP; 直接发酵法生产5’-GMP。 这四条路线中,目前只有前面两条用于工业化生产。 图8.4.1 嘌呤在细胞外转化为嘌呤核苷酸的机理 8.4.3.1发酵法生产AICAR AICAR不但是生产5’-GMP的前体,而且可以用于酶法生产AICA(5-氨基-4-咪唑基羧基酰胺),是生产嘌呤衍生物的重要中间体。 许多微生物,如:E. coli、B. Subtilis、B. Megaterium和Brecibacterium flavum等都能用作为发酵法生产AICAR的出发菌,其中B. Megaterium No366已经用于工业生产,产量可以达到16g/L。该菌株的特点是:1)该菌株属于嘌呤营养缺陷型,而且AICARP甲酰基转移酶所催化的反应已经被阻遏,因此AICARP不会进一步反应生成甲酰化AICARP;2)细胞中不存在催化AICA核苷水解的酶活;3)催化AICARP生物合成途径的酶不受胞内嘌呤核苷酸的调节,特别是PRPP酰胺基转移酶对产物AICARP不敏感。在发酵过程中,约有50%以上的AICAR生物合成发生在葡萄糖被消耗完以后,然后细胞利用前面积累的葡萄糖酸用于AICAR的生物合成。由于是嘌呤营养缺陷型,培养基中必须添加含嘌呤的酵母或RNA。 利用B. Megaterium No366菌株发酵时AICAR的产量与该菌种的孢子形成过程有密切关系,如果在发酵过程形成孢子会大大降低AICAR的产量,因此需要防止形成孢子。若采用在培养基中添加酪酸、镁盐和钙盐、表面活性剂、水溶性维生素和减少氧供应等方法可以有效地防止孢子形成,在间歇发酵的第8-12小时降低通氧强度具有很好的增产效果。为了防止回复突变,可以在培养基中添加红霉素加以抑制或改变保存培养基的组成。 8.4.3.2 发酵法生产鸟嘌呤 B. subtilis、B. Pumilus、B. Licheniformis、Corynebacterium petrophilum、C. quanofaciens及Streptomyces griseus的突变株能用于鸟嘌呤的生产。在枯草芽孢杆菌中鸟嘌呤生物合成的调节和控制机理如图8.4.2所示。与图8.2.1类似,从PRPP出发经过一系列反应生成IMP后,这些突变株应该具有如下特点:1)琥珀酰AMP合成酶活性受到阻遏;2)GMP还原酶活性阴性;3)降低核糖核苷酶的活性;4)GMP生物合成途径中的酶不会受到产物的反馈抑制,特别是要解除AMP对PRPP酰胺基转移酶、IMP脱氢酶及GMP合成酶的反馈调节;5)具有分泌GMP到胞外的能力。 曾用于工业化生产的B. subtilis突变株的遗传标记和鸟嘌呤生产水平见表8.4.1。从表中可以看出诱变育种的机理和步骤,其中腺嘌呤缺陷Ade(解除了AMP对PRPP酰胺基转移酶的抑制;8AXr抗性使IMP脱氢酶的活力提高了三倍,同时还降低了GMP还原酶的活性;蛋氨酸亚砜是谷氨酰胺的类似物,MSOr抗性突变株也能提高IMP脱氢酶的活力;阿洛酮糖腺苷(Psicofuranine, Psi)和德夸菌素(Decoynine, Dec)是GMP合成酶的抑制剂,这样Psir Decr抗性就解除了反馈抑制作用,提高了GMP合成酶的活性。  图8.4.2 枯草芽孢柑菌中GMP生物合成的调节机理 表8.4.1 发酵法生产鸟嘌呤的B. subtilis突变株 突变株 遗传标记 鸟嘌呤产量,g/L  B. subtilis AJ 1993 Ade( Red ( 8AGr  4.3  No. 30-12 Ade( Trp( Red ( 8AXr  5.0  1411 Ade( His( Red (  5.5  AG169 Ade( His( Red ( MSOr  8.0  GP-1 Ade( His( Red ( MSOr Psir  10.0  MG-1 Ade( His( Red ( MSOr Psir Decr  16.0  注:8AXr:8-氮黄嘌呤抗性,其余见表8.2.1及文中说明。 8.4.4发酵法生产腺苷、腺苷酸和其它腺苷酸类似物 腺苷和腺苷酸都是重要的医药中间体。腺苷发酵常采用产氨短杆菌和枯草杆菌的突变株。其中黄嘌呤营养缺陷型的Brevibacterium ammoniagenes产5’-AMP的能力为2.16g/L,同时还产ADP和ATP,分别达到1.59g/L和1.57g/L。Bacillus subtilisB的一个突变株P53-18的腺苷积累量则可以达到16g/L。在该突变株中,腺苷脱氨酶、GMP还原酶及IMP脱氢酶的活性受到了阻遏,遗传标记为(His( Thr( Xan( 8AXr)。 环腺苷-3’,5’-二磷酸(cAMP)也能通过发酵法生产,但目前的水平还不高,如Microbacterium sp. No. 205(Bio(6MPr8AGrMSOr)突变株产cAMP的能力为2.0g/L,而No. 205-M-32突变株的生产水平进一步提高到了8.6g/L。 表8.4.2发酵法生产的核苷类似物 发酵产物 发酵微生物 生产水平,g/L  FAD Sarcina lutea  1.0  NAD Brevibacterium ammoniagenes  1.9  辅酶A Brevibacterium ammoniagenes IFQ12071  2.0  乳清酸 Arthrobacter paraffineus  20.0  CDP-胆碱 Saccharomyces carlsbergensis  17.0   其它一些具有药用价值的核苷类似物虽然需求量不大,也能用发酵法生产。表8.4.2列出了几种产物发酵所用的微生物及它们的生产水平。