工业微生物学（教材电子书）：第三章 微生物营养和生长（1）

第三章 微生物的营养和生长 新陈代谢是生命的基本特征之一。微生物同其它生物一样，不断地进行新陈代谢。通过代谢，微生物与外部环境进行物质和能量的交换，从环境中获得各种元素以合成细胞物质，提供生命活动所需的能量及在新陈代谢中起调节作用。这些物质称为营养物质(nutrient)。而有机体摄取、利用营养物质的过程称为营养(nutrition)。 3.1 微生物的营养 营养物质是生命活动的基础，没有营养，微生物的生命活动就会终止，所以说，营养过程是微生物生命活动的重要特征。只有吸收营养物质，才能进一步代谢，实现微生物的生长、发育和繁殖。熟悉微生物的营养知识是研究和利用微生物的必要基础，有了营养理论，就能更自觉和有目的地选用和设计符合微生物生理需要、有利于发酵生产的培养基。 3.1.1 微生物的营养类型 生物界存在两种典型的营养类型：(1)以高等植物为代表的自养型(autotroph)，它们完全依靠无机养分（如CO2,H2O,无机盐）合成复杂的有机物，供自身生长发育需要，并以光为能源；(2)以高等动物为代表的异养型(heterotroph)，它们必需摄取现成的有机物才能满足其生长发育的需求，并通过有机物的氧化来获取能源。 微生物除有以上两种营养类型外，还有一些中间类型。一般以能源、碳源不同分成四大类型： CO2 （自养型） ——光能自养型 光……光能营养型 有机碳化物（异养型） ——光能异养型 能源 化合物…化能营养型 CO2,CO32- （自养型） ——化能自养型 有机碳化物（异养型） ——化能异养型 3.1.1.1 光能自养型 或称光能无机自养型（photolithoautotroph,PLA) 光能自养型生物以CO2作为唯一或主要碳源，以光为生活所需的能源，能以无机物（如硫化氢、硫代硫酸钠或其它无机硫化物）作供氢体，使CO2还原成细胞的有机物。十分凑巧的是氢供体与其碳源的性质一般是一致的。即若碳源是无机的，氢供体也是无机的。该类型的代表是高等植物、藻类和少量细菌。 高等植物： 光能 CO2 ＋H2O (( [CH2O] ＋O2 叶绿素 光合细菌： 光能 绿硫细菌： CO2 ＋2H2S (( [CH2O] ＋2S ＋H2O 细菌叶绿素 光能 红硫细菌： CO2 ＋H2S ＋2H2O (( 2[CH2O] ＋H2SO4 细菌叶绿素 植物与光合细菌的光合作用可用下式概括： 光能 CO2 ＋2H2A (( [CH2O] ＋2A ＋H2O 光合色素 高等植物以水为CO2 的还原剂，同时释放出O2。光合细菌从H2S、Na2S2O3等无机硫化物得到H来还原CO2，同时析出S或H2SO4。光合作用的过程较复杂，具体内容可参考有关生物化学的教材。 3.1.1.2 光能异养型(photoorganoheterotroph,POH) 光能异养型微生物利用光为能源，利用有机物为供氢体，不能以CO2作为主要或唯一的碳源，一般同时以CO2和简单的有机物为碳源。光能异养细菌生长时，常需外源的生长因子。如红螺菌科的细菌（即紫色无硫细菌）以光为能源，CO2为碳源，并需异丙醇为供氢体，同时积累丙酮。 光能 2(H3C-)CHOH ＋ CO2 (( 2CH3COCH3 ＋[CH2O] ＋ H2O 光合色素 3.1.1.3 化能自养型（chemolithoautotroph,CLA) 化能自养型微生物以CO2（或碳酸盐）为碳源，以无机物氧化所产生的化学能为能源。它们可以在完全无机的条件下生长发育。这类菌以氢气、硫化氢、Fe2+或亚硝酸盐为电子供体，使CO2还原。氢细菌、硫细菌、铁细菌和硝化细菌属于此类菌。它们广泛分布在土壤和水域中，在自然界的物质循环和转化过程中起着重要作用。它们一般生活在黑暗和无机的环境中，故又称为化能矿质营养型。 3.1.1.4 化能异养型(chemoorganoheterotroph,COH) 化能异养型生物以有机化合物为碳源，以有机物氧化产生的化学能为能源。所以，有机化合物对这些菌来讲，既是碳源，又是能源。动物和大多数微生物（几乎全部真菌、大多数细菌和放线菌）都属于此类。绝大多数工业上应用的微生物都属于化能异养型。 化能异养型微生物又可分为寄生(parasitism)和腐生(saprophytism)两种类型。寄生是指一种生物寄居于另一种生物体内或体表，从而摄取宿主细胞的营养以维持生命的现象；腐生是指通过分解已死的生物或其它有机物，以维持自身正常生活的生活方式。实际上，在寄生和腐生之间存在着不同程度的既寄生又腐生的中间类型，可称为兼性寄生或兼性腐生。 上述四大类型微生物的划分并不是绝对的，在它们之间也有一些过渡类型。例如红螺菌在光照和嫌气的条件下，利用光能同化CO2，而在黑暗和好气的条件下，也能利用有机物氧化产生的化学能实现生长，所以它兼有光能自养型和化能异养型的特征。在化能自养和化能异养型之间也有中间类型，氢单胞菌在完全无机的条件下，通过氢的氧化而获取能量，同化CO2，而当环境中存在有机物时，它便利用有机物实行异养生活。 许多（甚至所有）异养型微生物也都可以利用CO2，所不同的是它们不以CO2为唯一的碳源，而是将CO2固定在有机物上，如将CO2固定到丙酮酸生成草酰乙酸。所以单纯就能否利用CO2来讲，自养型与异养型也没有绝对界限。它们主要区别在于：自养型微生物可利用CO2（碳酸盐）作唯一或主要的碳源而且同化CO2（碳酸盐）为细胞结构物质，所需的能量来自光或无机物的氧化，但也不是说它们绝对不能利用有机物；异养型微生物可以固定CO2，但其主要的碳源来自有机物，不能在完全无机的环境中生长，它们的合成反应所需能量来自有机物的氧化。 微生物营养类型的区分一般是以最简单的营养条件为根据，光能先于化能，自养先于异养，并加以“严格”，“兼性”来描述营养的可变性。所以，氢单胞菌为“兼性自养型”，红螺菌是“兼性光能异养型”。 3.1.2 微生物的营养要素 微生物的营养物质应满足机体生长、繁殖和完成各种生理活动的需要。它们的作用可概括为形成结构（参与细胞组成），提供能量（机体进行各种生理活动所需的能量）和调节作用（构成酶的活性成分和物质运输系统）。 微生物细胞的化学组成从一个侧面反映了微生物生长繁殖的物质需要。虽然，随微生物种类、生理状态及环境的不同，其组成也有变化，但通过对细胞元素组成的分析可大体看出微生物所需的营养物质。表3.1.1显示细菌、酵母菌和霉菌的主要元素组成。这些元素主要以水、有机物和盐的形式存在于细胞中。水是微生物细胞的主要成分。细菌平均含水量为鲜重的75-85%，酵母为70-85%，霉菌为85-90%，芽孢为40%，霉菌孢子为38%。有机物主要是蛋白质、糖、脂类、核酸、维生素以及激素等。 表3.1.1 细菌、酵母和霉菌的元素组成（干重%） 元素  细菌 酵母 霉菌  碳 50~53 45~50 40~63  氢 7 7 --  氮 12~15 7.5~11 7~10  磷 2.0~3.0 0.8~2.6 0.4~4.5  硫 0.2~1.0 0.01~0.24 0.1~0.5  钾 1.0~4.5 1.0~4.0 0.2~2.5  钠 0.5~1.0 0.01~.01 0.02~.05  钙 0.01~1.5 0.1~0.3 0.1~1.4  镁 0.1~0.5 0.1~0.5 0.1~0.5  氯化物 0.5 -- --  铁 0.02~0.2 0.01~0.5 0.1~0.2   我们可以将微生物的营养物质分成六大营养要素，即水、碳源、氮源、无机盐、生长因子和能源。 3.1.2.1水 水是微生物细胞的重要组成成分，在代谢中占有重要的地位。主要作用有： (1) 直接参与一些反应。如蓝细菌利用水作为CO2的还原剂。 (2) 作为机体内一系列生理生化反应的介质。代谢物只有先溶于水，才能参与反应。 (3) 营养物质的吸收、代谢产物的排泄都需通过水，特别是微生物没有特殊的摄食器官和排泄器官，这些物质只有溶于水才能通过细胞表面。 (4)由于水的比热高，又是良好的热导体，所以它能有效地吸收代谢释放的热量，并将热量迅速地散发出去，从而有效地控制细胞的温度。因为水分子通过分子间的氢键连接，而破坏氢键需耗费额外的能量，所以提高水温所需的热量很大，水的高气化热也有利于将发酵过程中积聚的热量带走。 人体 平均60% 海蜇 (96% 霉菌孢子 (39% 几种生物的游离水含量 孢子 细菌芽孢 皮层 (70% 微生物 核心 极低 营养体 细菌 (80% 酵母 (75% 霉菌 (85% 水在细胞中有两种存在形式：结合水和游离水。结合水与溶质或其它分子结合在一起，很难加以利用。游离水（或称非结合水）则可以被微生物利用。不同生物及不同细胞结构中游离水的含量有较大的差别： 游离水的含量可用水的活度a(（water activity）表示，水活度定义为在相同温度、压力下，体系中溶液的水的蒸汽压与纯水的蒸汽压之比，即a(=P/P0 (P表示溶液的蒸汽压，P0 表示纯水的蒸汽压)。 纯水的a(为1.00，当含有溶质后，a((1.00。微生物能在a(=0.63(0.99的培养条件下生长。对某种微生物而言，它对a(的要求是一定的。 3.1.2.2碳源 从表3.1.1中可知，细胞干物质中的碳约占50%，所以说微生物对碳的需求最大。凡是可以作为微生物细胞结构或代谢产物中碳架来源的营养物质，称为碳源(carbon source)。 可作为微生物营养的碳源物质种类极其广泛，从简单的无机物（CO2、碳酸盐）到复杂的有机含碳化合物（糖、糖的衍生物、脂类、醇类、有机酸、烃类、芳香族化合物及各种含氮化合物等）。但不同微生物利用碳源的能力不同。有的能广泛地利用不同类型的碳源，如假单孢菌属的有些种可利用90种以上的碳源，但有的微生物能利用的碳源范围极其狭窄，如甲烷氧化菌仅仅能利用两种有机物，甲烷和甲醇。某些纤维素分解菌只能利用纤维素。 大多数微生物是异养型的，它们以有机化合物为碳源，能利用的碳源种类很多，但其中以糖类是最好的碳源，糖类中单糖优于双糖，已糖优于戊糖。葡萄糖、蔗糖通常作为培养微生物的主要碳源。在多糖中，淀粉可以为大多数微生物所利用，纤维素能为少数微生物所利用。纯多糖优于琼脂等杂多糖。醇、有机酸和脂类的利用次于糖类。少数微生物能利用酚、氰化物等有机毒物做碳源，所以可用于治理“三废”。有人从污泥中分离到了以氰化物为唯一碳源和氮源的诺卡氏菌和霉菌。 对于异养微生物，碳源物质通过机体内一系列复杂的化学反应，最终用于构成细胞物质或为机体提供完成整个生理活动所需的能量。所以，碳源往往也是能源物质。 自养菌以CO2、碳酸盐为唯一或主要碳源。因为CO2是被彻底氧化的物质，所以，CO2转化成有机的细胞成分是一个还原过程，此过程需消耗大量能量。因此，这类微生物同时需要从光或其它无机物氧化来获取能量。这类微生物的碳源和能源分别属于不同的物质。 不少种类的异养型微生物，尤其是生长在动物的血液、组织和肠道中的致病微生物，除必需有机碳源外，还需要少量CO2才能正常生长，因此，在培养这些微生物时，常要提供10%CO2（V/V）；在有些好氧微生物生长时，如果用KOH除去CO2，往往也会抑制生长。 3.1.2.3氮源 凡是构成微生物细胞物质或代谢产物中氮元素来源的营养物质，称为氮源(nitrogen source)。细胞的干物质中氮含量仅次于碳和氧。氮是组成核酸和蛋白质的重要元素，所以，氮对微生物的生长发育有着重要的作用。从分子态的N2到复杂的含氮化合物都能被不同的微生物所利用，而不同类型的微生物能利用的氮源差异较大。 固氮微生物能利用分子态N2合成自己需要的氨基酸和蛋白质。它们也能利用无机氮和有机氮化物，但在这种情况下，它们便失去了固氮能力。固氮微生物主要是原核生物，如与豆类共生的根瘤菌和自生固氮菌。还有不少光合细菌、蓝藻和真菌也有固氮作用。 许多腐生细菌和动植物的病原菌不能固氮，一般利用铵盐或其它含氮盐作氮源。硝酸盐必须先还原成NH4+后，才能用于生物合成。以无机氮化物为唯一氮源的微生物都能利用铵盐，但它们并不都能利用硝酸盐。 当无机氮化物为唯一氮源培养微生物时，培养基会表现出生理酸性或生理碱性。如以(NH4)2SO4为氮源时，NH4+被利用后，培养基的pH下降，故有“生理酸性盐”之称。以K2NO3为氮源时，NO3+被利用后，培养基的pH上升，故有“生理碱性盐”之称。 利用 (NH4)2 NO3为氮源，可以避免pH急剧升降，但是，NH4+的吸收快， NO3+的吸收滞后，所以，培养基pH会先降后升。所以，培养基配方中应加入缓冲物质。 从微生物所利用的氮源种类看，存在着一个明显的界限：一部分微生物不需要氨基酸为氮源，它们能将非氨基酸类的简单氮源（例如尿素、铵盐、硝酸盐和氮气）自行合成所需要的一切氨基酸，它们称为“氨基酸自养型生物”，反之，凡需要从外界吸收现成氨基酸作氮源的微生物，则称为“氨基酸异养型生物”。所有的动物和大量异养型微生物是氨基酸异养型的，而所有绿色植物和很多微生物是氨基酸自养型的。 实验室的有机氮源有蛋白胨，牛肉膏，酵母膏，玉米浆等，工业上能够用黄豆饼粉、花生饼粉和鱼粉等作为氮源。 有机氮源中的氮往往是蛋白质或其降解产物，其中，氨基酸可以直接吸收而参与细胞代谢，而蛋白质需经菌体分泌的胞外酶水解后才能利用。因为花生饼粉和黄豆饼粉中的氮主要以蛋白质存在，所以，被称为“迟效性氮源”。而(NH4)2SO4和玉米浆等被称为“速效性氮源”。 氮源一般只提供合成细胞质和细胞中其它结构的原料，不作为能源。只有少量细菌，如硝化细菌能利用铵盐、硝酸盐作氮源和能源。某些梭菌对糖的利用不活跃，可以利用氨基酸为唯一的能源。 3.1.2.4无机盐 无机盐也是微生物生长所不可缺少的营养物质。其主要功能是： （1）构成细胞的组成成分。 （2）作为酶的组成成分。 （3）维持酶的活性。 （4）调节细胞渗透压，氢离子浓度和氧化还原电位。 （5）作为某些自氧菌的能源。 磷、硫、钾、钠、钙、镁等盐参与细胞结构组成，并与能量转移、细胞透性调节功能有关。微生物对它们的需求量较大（10-4 ( 10-3M)，称为“宏量元素”。没有它们，微生物就无法生长。铁、锰、铜、钴、锌、钼等盐一般是酶的辅助因子，需求量不大（10-8 ( 10-6M)，所以，称为“微量元素”。不同的微生物对以上各种元素的需求量各不相同。铁元素介于宏量元素和微量元素之间。 1)磷 所有细菌都需要磷。磷是合成核酸、磷脂、重要的辅酶（NAD，NADP，CoA等）及高能磷酸化合物的重要原料。细胞内磷酸盐也来源于营养物中的磷。一般都以K2HPO4和KH2PO4的形式人为地提供磷元素。 2)硫 硫是蛋白质中某些氨基酸(如半胱氨酸和蛋氨酸)的组成成分，是辅酶因子（如辅酶A，生物素，硫辛酸和硫胺素）的组成成分，也是谷胱甘肽的组成成分。硫还是某些自养菌的能源物质。 微生物从含硫无机盐或有机硫化物中得到硫。一般人为的提供形式为MgSO4。微生物从环境中摄取SO42-，再还原成—SH。 3)镁 镁是一些酶（如己糖激酶，异柠檬酸脱氢酶，羧化酶和固氮酶）的激活剂。是光合细菌菌绿素的组成成分。镁还起到稳定核糖体、细胞膜和核酸的作用。缺乏镁，细胞生长就会停止，首当其冲的就是核糖体和细胞膜。微生物可以利用硫酸镁或其它镁盐。 4)钾 钾不参加细胞结构物质的组成，但是，它是细胞中重要的阳离子之一。它是许多酶（如果糖激酶）的激活剂，也与原生质的胶体特性和细胞膜的透性有关。钾在胞内的浓度比胞外高许多倍。各种无机钾盐，尤其是磷酸钾盐（磷酸二氢钾，磷酸氢二钾）可做为钾源。 5)钙 钙一般不参与微生物的细胞结构物质（除细菌芽孢外），也是细胞内重要的阳离子之一，它是某些酶（如蛋白酶类）的激活剂，还参与细胞膜通透性的调节。各种水溶性的钙盐，如CaCl2及Ca(NO3)2等都是微生物的钙元素来源。 6 )钠 钠也是细胞内的重要阳离子之一，它与细胞的渗透压调节有关。钠在细胞内的浓度低，细胞外浓度高。对嗜盐菌来说，钠除了维持细胞的渗透压（嗜盐菌放入低渗溶液即会崩溃）外，还与营养物的吸收有关，如一些嗜盐菌吸收葡萄糖需要Na+的帮助。 7)微量元素 除上述几种重要的宏量元素外，正常生长的微生物还需要其它一些微量元素，如果缺乏这些元素，将会导致微生物生理活性降低，甚至停止生长。微量元素往往与酶活性有关，或参与酶的组成，或是许多酶的调节因子。 铁是过氧化氢酶、过氧化物酶、细胞色素和细胞色素氧化酶的组成元素，也是铁细菌的能源，铁含量太低会影响白喉杆菌形成白喉毒素。铜是多酚氧化酶和抗坏血酸氧化酶的成分。锌是醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、肽酶和脱羧酶的辅助因子。钴参与维生素B12的组成。钼参与固氮酶的组成。锰为超氧化物酶的激活剂。 在配制培养基时，可以通过添加有关化学试剂来补充宏量元素。其中首选是K2HPO4和MgSO4,它们可提供四种需要量很大的元素：K、P、S和Mg。对其它需要量较少的元素尤其是微量元素来说，因为它们在一些化学试剂、天然水和天然培养基组分中都以杂质等状态存在，在玻璃器皿等实验用品上也有少量存在，所以，不必另行加入。但如果要配制研究营养代谢等精细培养基时，所用的玻璃器皿是硬质材料、试剂又是高纯度的，这就应根据需要加入必要的微量元素。 3.1.2.5生长因（素）子 自养型的微生物可以不依赖外源有机物质，只需无机物就能合成全部细胞物质；大部分异养型微生物除需要有机碳源外，在无机氮源或其它矿物质的环境中也能够生长。但是，另外一些异养型的微生物在一般碳源、氮源和无机盐的培养基中培养还不能生长或生长较差。当在培养基加入某些组织（或细胞）提取液时，这些微生物就生长良好。这说明这些组织或细胞中含有这些微生物生长所必需的营养因子，这些因子就称为生长因子（growth factor）。可以将生长因子定义为某些微生物不能从普通的碳源、氮源合成，而需要另外少量加入来满足生长需要的有机物质。它们包括氨基酸、维生素、嘌呤和嘧啶碱及其衍生物。有时也包括一些脂肪酸及其它膜成分。 必须指出的是各种微生物所需的生长因子互不相同，有的需要多种，有的仅需一种，有的不需要。一种微生物所需的生长因子也会随培养条件的变化而变化。如在培养基中有否前体物质、通气条件、pH和温度等条件都会影响微生物对生长因子的需求。 从自然界直接分离到的任何微生物在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，均称为该微生物的野生型（wild type)。绝大多数野生型菌株只需要简单的碳源和氮源等就能生长，不需要添加生长因子；野生型菌株在实验室中经过人工诱变处理后，常会丧失合成某种营养物质（通常是生长因子）的能力。这些菌株生长的培养基中必需添加某种氨基酸、嘌呤、嘧啶或维生素等生长因子。这些由野生型菌株突变而来的菌株称为营养缺陷型（auxotroph)。在微生物遗传、变异和代谢生理的研究、以及微生物杂交育种和氨基酸、核苷酸等发酵生产中常采用营养缺陷型菌株；营养缺陷型菌株经回复突变或基因重组后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同的称为原养型（prototroph)，原养型菌株的生长也不需要添加生长因子。 1)维生素 维生素（Vitamin）是一些微生物生长和代谢所必需的、微量的小分子有机物。它们的特点是: （1）机体不能合成，必须经常从食物中获得。 （2）生物对其的需要量较低。微生物对维生素的需要量1-50(g/L或更低。 （3）它不是结构或能量物质，但它是必不可少的代谢调节物质。大多数是酶的辅助因子。 （4）不同生物所需的维生素各不相同。有的微生物可以自行合成维生素，如肠道菌可以合成维生素K等，有的细菌可以用于生产维生素C。 2) 氨基酸 L-氨基酸是组成蛋白质的主要成分，此外，细菌的细胞壁合成还需要D-氨基酸。所以，如果微生物缺乏合成某种氨基酸的能力，就需要补充这种氨基酸。补充量一般要达到20-50(g/mL，是维生素需要量的几千倍。可以直接提供所需的氨基酸，或含有所需氨基酸的小分子肽。在有些情况下，细胞只能利用小肽，而不能利用氨基酸。这是因为单个氨基酸不能透过细胞，而小分子肽较容易透过细胞，随后由肽酶水解成氨基酸。 有时培养基中一种氨基酸的含量太高，会抑制其它氨基酸的摄取，这就是“氨基酸不平衡”现象。 3) 碱基 碱基包括嘌呤和嘧啶碱，主要功能是组成核酸和一些辅酶。生物体的碱基有两种来源：通过食物摄取和经“从无到有”途径合成。 核苷酸合成的途径有两条： 从碱基直接形成相应的单磷酸核苷酸 G ＋ PRPP (( GMP ＋ PPi 鸟嘌呤 磷酸核糖 鸟苷酸 焦磷酸 焦磷酸 (2) 间接途径 G ＋ 核糖-1-P (( 鸟嘌呤-核糖（鸟苷） 鸟苷 ＋ ATP (( GMP ＋ ADP 如果微生物细胞中存在第二条途径，核苷和游离碱基都可用作生长因子；如果微生物细胞中只有第一条途径，那么，微生物就只能利用游离的碱基。核苷酸一般不能用做生长因子，因为核苷酸中磷酸基团的存在会导致它在水溶液中电离，而难以透过细胞膜进入细胞。另外有些微生物既不能合成碱基，也不能利用外源碱基，所以，需要提供核苷或核苷酸，而且需要量很大。 4) 脂肪酸等类脂 某些微生物不能合成脂肪酸等类脂，必须从外界摄取长链脂肪酸，用于构建细胞膜。另外，有些微生物还需要如固醇、胆碱和肌醇等类脂用于组成细胞膜。 3.1.2.6能源 能源是指能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能。微生物的能源谱如下： 有机物：化能异养型微生物的能源（与碳源相同） 化学物质 无机物：化能自养性微生物的能源（不同于碳源） 能源谱 辐射能 光能自养和光能异养型微生物的能源 化能异养型微生物的能源即碳源。化能自养型微生物的能源都是还原态的无机物，如：NH4+、NO2-、S、H2S、H2、Fe2+等，它们分别属于是硝化细菌、亚硝酸细菌、硫化细菌、硫细菌、氢细菌和铁细菌等。 一种营养物常有一种以上营养要素的功能，即除单功能营养物外，还有双功能，甚至三功能的营养物。如：辐射能是单功能的；还原态无机养分常是双功能的（NH4+既是硝化细菌的能源，又是它的氮源）甚至是三功能的（ 能源、氮源和碳源）；有机物常有双功能或三功能作用。 3.1.3 微生物的培养基 培养基通常指人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。广义上说，凡是支持微生物生长和繁殖的介质或材料均可作为微生物的培养基。培养基是微生物学尤其是工业微生物学研究的重要内容。一个恰当的培养基配方，对发酵产品的产量和质量有着极大的影响。微生物的培养基配方犹如菜谱，种类繁多，且层出不穷。如今，培养基的种类有数万种之多。 3.1.3.1培养基的配制原则 针对不同的微生物，不同的营养要求可以有不同的培养基。但是，它们的配制必须遵循一定的原则。 1) 营养物质应满足微生物的需要 不同营养类型的微生物对营养的需求差异很大，所以，应根据所培养菌种对各营养要素的不同要求进行配制。如自养微生物的培养基成分是无机的，而异养型微生物的培养基成分必须含有机物。针对四大类微生物，一般可以采用现成配方的培养基。如细菌采用肉汤蛋白胨培养基、放线菌采用高氏1号合成培养基、酵母采用麦芽汁培养基及霉菌采用查氏合成培养基。 2)营养物的浓度及配比应恰当 营养物的浓度太低，则不能满足微生物生长的需要，浓度太高，又会抑制微生物的生长。如糖和盐都是良好的营养物质，但是，浓度升高，则有抑菌作用。 碳氮比（C/N）一般指培养基中元素C与N的比值。为方便测定和计算，人们常以培养基中还原糖含量与粗蛋白含量的比值来表示。在考察培养基组成时，人们常以碳氮比作为一个重要的指标。一般培养基的C/N比为100：0.5-2；在谷氨酸生产菌发酵中，C/N比为4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累量较少；当C/N为3/1时，菌体繁殖受到抑制，谷氨酸大量积累。 在设计营养物配比时，还应该考虑避免培养基中各成分之间的相互作用。如蛋白胨、酵母膏中含有磷酸盐时，会与培养基中钙或镁离子在加热时发生沉淀反应。在高温下，还原糖与蛋白质或氨基酸也会相互作用产生褐色物质。 在培养基配制时，可添加化学试剂补充宏量元素。其中，首选的是K2HPO4和MgSO4，因为它们包含了四种宏量元素。对于微量元素，一般化学试剂、水及器皿上均有存在。 3) 物理化学条件适宜 (1) pH值 各大类微生物一般都有它们生长繁殖的最适pH。细菌的最适pH一般在7.0-8.0，放线菌在pH7.5-8.5间，酵母菌在pH3.8-6.0间，霉菌在pH4.0-5.8之间。对于具体的微生物菌种来说，它们都有各自特定的最适pH范围，有时会大大突破上述界限。 在微生物生长繁殖过程中会产生引起培养基pH改变的代谢产物，尤其是不少微生物有很强的产酸能力，如不适当地加以调节，就会抑制甚至杀死其自身。在设计它们的培养基时，就要考虑到培养基的pH调节能力。一般应该加入磷酸缓冲液或CaCO3，使培养液的pH 稳定。 调节K2HPO4和KH2PO4两者浓度比，可获得从pH6.0到pH7.6间一系列稳定的pH，当两者等摩尔浓度比时，溶液的pH可稳定在6.8。其反应式如下： K2HPO4 + HCl (( KH2PO4 + KCl KH2PO4 + KOH (( K2HPO4 + H2O CaCO3在水溶液中溶解度极低，加入液体或固体培养基中，不会使培养基pH升高。但是，当微生物生长过程中不断产生酸时，它被逐渐溶解，并与酸反应，最终以CO2形式释放到大气中，所以，它具有良好的稳定培养基pH的作用。 CO32+ ( HCO3- ( H2CO3 ( CO2 ( + H2O 培养基中的蛋白质或氨基酸经发酵后，会产生氨，从而有升高培养基pH的趋势。 培养基的灭菌过程也会引起培养基的pH发生变化。高温处理过程中，一些大分子发生分解，造成pH下降。 (2) 其它 培养基的其它物化指标也将影响微生物的培养。培养基中水的活度应符合微生物的生理要求（aω值在0.63-0.99之间）。大多数微生物适合在等渗的环境下生长，而有些细菌如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)能在3mol/L Nacl中生长。能在高盐环境（2.8~6.2mol/LNacl）生长的微生物称为嗜盐微生物（halophiles）。 在配制培养基时，通常不必测定这些指标，因为培养基中各种成分及其浓度等指标的优化已间接地确定了培养基的水活度和渗透压。此外，各种微生物对培养基的氧化还原电位等也有不同的要求。 4) 根据培养的目的 培养基的成分直接影响着培养的目标。在设计培养基时必须考虑是要培养菌体，还是要积累产物，是实验室培养还是大规模发酵等问题。 用于培养菌体的种子培养基营养成分应丰富，尤其是氮源含量宜高。即碳氮比值低。相反，用于积累大量生产代谢产物的发酵培养基，它的氮源一般应比种子培养基稍低。当然，若发酵产物是含氮化合物时，有时还应该提高培养基的氮源含量。 在设计培养基时，还应特别考虑到代谢产物是初级代谢产物，还是次级代谢产物。若是次级代谢产物还要考虑是否加入特殊元素（如维生素B12中的Co）或特定的前体物质（如生产卞青霉素时，应加入苯乙酸）。 在设计培养基尤其是大规模发酵生产用的培养基时，还应重视培养基中各种成分的来源和价格，应该优先选择来源广泛开展、价格低廉的培养基，提倡“以粗代精”，“以废代好”。 3.1.3.2培养基的种类 培养基的种类繁多。因考虑的角度不同，可将培养基分成不同的类型。 天然培养基 根据对培养基成分了解的程度 合成培养基 半合成培养基 液体培养基 根据培养基物理状态 固体培养基 半固体培养基 种子培养基 发酵培养基 根据培养的目的 繁殖培养基 保藏培养基 基本培养基 加富培养基 根据培养基的特殊用途 选择培养基 鉴别培养基 测定生理生化特性的培养基 表3.1.2 几种天然培养基原材料的特性 原材料 制作特点 营养价值  牛肉膏 瘦牛肉加热抽提并浓缩而成的膏状物 主要提供碳水化合物（有机酸、糖类），有机氮化物（氨基酸、嘌呤、胍类），无机盐（钾，磷等）和水溶性维生素（主要为B族）  蛋白胨 酪素、明胶或鱼粉等蛋白质经酸、酶（胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶）水解而成 主要提供有机氮、维生素及碳水化合物  酵母膏（酵母粉） 酵母细胞水抽提物浓缩而成的膏状物或粉剂 可提供大量的B族维生素，大量的氨基酸，嘌呤碱及微量元素  玉米浆 用亚硫酸浸泡玉米制淀粉时的废水，经减压浓缩而成的浓缩液。干物质占50%，棕黄色，久置沉淀 提供可溶性蛋白质、多肽、小肽、氨基酸、还原糖和B族维生素。  甘蔗糖蜜 甜菜糖蜜 制糖厂除去糖结晶后的下脚废液，棕黑色 主要含蔗糖和其它糖，还有氨基酸、有机酸，少量的维生素等   天然培养基(natural medium) 凡利用生物的组织、器官及其抽取物或制品配成的培养基，称为天然培养基。优点是配制方便、经济、营养丰富，但是，它的化学成分不清楚或不稳定（受产地、品种、保存加工方法等因素影响）。常见的天然培养基成分有：麦芽汁、肉浸汁、鱼粉、麸皮、玉米粉、花生饼粉、玉米浆及马铃薯等。实验室常用牛肉膏、蛋白胨及酵母膏等。几种常用天然培养基原材料的特性见表3.1.2。 合成培养基(synthetic medium) 使用成分完全了解的化学药品配制而成的培养基称为合成培养基。合成培养基的优点是：成分已知、精确、重复性好。但价格较贵，培养的微生物生长较慢。适用于实验室进行微生物生理、遗传育种及高产菌种性能的研究。培养放线菌的高氏一号培养基和培养真菌的察氏培养基都属于合成培养基。 半合成培养基(semi-defined medium) 由部分天然材料和部分已知的纯化学药品组成的培养基称为。例如，培养真菌用的马铃薯蔗糖培养基等。严格地讲，凡含有未经特殊处理的琼脂的任何合成培养基，实际上都只是一种半合成培养基。特点是配制方便，成本低，微生物生长良好。发酵生产和实验室中应用的大多数培养基都属于半合成培养基。 液体培养基(liquid medium) 各营养成分按一定比例配制而成的水溶液或液体状态的培养基称为液体培养基。工业上绝大多数发酵都采用液体培养基。实验室中微生物的生理、代谢研究和获取大量菌体是也常利用液体培养基。 固体培养基(solid medium) 固体培养基一般是指液体培养基中加入一定量的凝固剂配制而成的固体状态的培养基。此外，固体营养物（如麸皮、米糠、木屑、土豆块、玉米粉）与水和盐等混合构成的疏松状培养基也属于固体培养基。固体培养基在科学研究和生产实践中具有很多用途，例如它可用于菌种分离、鉴定、菌落计数、检测杂菌、选种、育种、菌种保藏、抗生素等生物活性物质的效价测定及获取真菌孢子等。在发酵工业中常用固体培养基进行固体发酵。 理想的固体培养基凝固剂应具备以下条件： （1）不被微生物液化、分解和利用。 （2）在微生物生长的温度范围内保持固体状态。凝固点温度对微生物无害。 （3）不会因消毒、灭菌而破坏。 (4) 配制方便，价格低，透明性好。 琼脂（Agar)是最好的凝固剂。它由石花菜等红藻加工而成，主要由琼脂糖（agarose）和琼脂胶（agaropectin）两种多糖组成。除极少数菌外，大多数微生物无法降解琼脂。琼脂 45℃固化，约100℃才融化。灭菌过程中不会被破坏，并且价格低廉。培养基中加0.5%琼脂时可以获得半固体培养基，加入1.5%-2.0%琼脂即成固体培养基，加8%琼脂则成硬固体培养基。 明胶（Gelatin）也是一种凝固剂。它是由动物的皮、骨、韧带等煮熬而成的一种蛋白质，含有多种氨基酸，可被许多微生物作为氮源而利用。明胶20℃凝固，28～35℃融化，所以，只能在20-25℃温度范围作凝固剂使用，适用面很窄，但可用于特殊检验。 硅胶（Silica gel）是无机硅酸钠(Na2SiO3)和硅酸钾(K2SiO3)与盐酸和硫酸中和反应时凝结成的胶体。因为它完全无机，在研究分离自养菌时用作培养基的凝固剂。硅胶一旦凝固后，就无法再融化。 6) 半固体培养基(semi-solid medium) 半固体培养基是指琼脂加入量为0.2-0.5%而配制的固体状态的培养基。半固体培养基有许多特殊的用途，如可以通过穿刺培养观察细菌的运动能力，进行厌氧菌的培养及菌种保藏等。 7)种子培养基(seed culture medium) 种子培养基是适合微生物菌体生长的培养基，目的是为下一步发酵提供数量较多，强壮而整齐的种子细胞。一般要求氮源、维生素丰富，原料要精。值得注意的是一般氨基酸或肌苷的生产菌往往是营养缺陷型，所以，种子培养基营养丰富还可防止种子阶段出现回复突变株。 8)发酵培养基(fermentation medium) 用于生产预定发酵产物的培养基。一般的发酵产物以碳为主要元素，所以，发酵培养基中的碳源含量往往高于种子培养基。若产物的含氮量高，应增加氮源。在大规模生产时，原料应该价廉易得，还应有利于下游的分离提取工作。 9) 繁殖和保藏培养基(reproducible medium) 主要用于菌种保藏，大部分情况下就是斜面培养基。对营养缺陷型或结构类似物抗性菌株或抗生素抗性菌株来说，它们的保藏培养基中可以适当加入特定的对应成分。 10) 基本培养基（Minimal Medium，MM） 基本培养基又称最低限度培养基，指能满足某菌种的野生型（原养型）菌株最低营养要求的合成培养基。不同微生物的基本培养基很不相同，有的极为简单，如大肠杆菌的基本培养基；有的极为复杂，如一些乳酸菌、酵母菌或梭菌的基本培养基。基本培养基有时也需要添加生长因子等。 若在基本培养基中加入富含氨基酸、维生素、碱基等生长因子的营养物质，如蛋白胨、酵母膏等，就可满足各种营养缺陷型的生长需求，这种培养基称为完全培养基（Complete Medium，CM）。 若在基本培养基中只是针对性地加入一种或几种营养成分，以满足相应的营养缺陷型生长，那么，这种培养基称为补充培养基（Supplement Medium,SM)。 11) 加富培养基（enriched medium) 加富培养基是在普通培养基中加入血、血清、动（植）物组织液或其它营养物（或生长因子）的一类营养丰富的培养基。它主要用于培养某种或某类营养要求苛刻的异养型微生物，或者用来选择性培养（分离、富集）某种微生物。具有助长某种微生物的生长，抑制其它微生物生长的功能。广义上讲，保藏培养基和鉴别培养基也属于加富培养基。 12) 选择性培养基(selected medium) 根据某种或某类微生物的特殊营养要求，或对某些物理、化学条件的抗性而设计的培养基，称为选择性培养基。目的是利用这种培养基把某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。混合样品中数量很少的某种微生物，如直接采用平板划线或稀释法进行分离，往往因为数量少而无法获得。选择性培养的主要方法有两种，一是根据某些微生物对碳源、氮源的需求而设计，如：以纤维素为唯一碳源的培养基可用于分离纤维素分解菌；用石蜡油来富集分解石油的微生物；用较浓的糖液来富集酵母菌等。二是根据某些微生物的物理和化学抗性设计的，如分离放线菌时，在培养基中加入数滴10%的苯酚，可以抑制霉菌和细菌的生长；在分离酵母菌和霉菌的培养基中，添加青霉素、四环素和链霉素等抗生素可以抑制细菌和放线菌的生长；结晶紫可以抑制革兰氏阳性菌，培养基中加入结晶紫后，能选择性地培养革兰氏阴性菌；7.5%NaCl可以抑制大多数细菌，但不抑制葡萄球菌，从而选择培养葡萄球菌。德巴利酵母属（Debaryomyces)中的许多种和酱油中酵母能耐高浓度（18-20%）的食盐，而其它酵母只能耐受3-11%浓度的食盐，所以，在培养基中加入15-20% 浓度的食盐，即构成耐食盐酵母的选择培养基。 马丁氏(martin)培养基就是专门用于分离土壤中真菌的选择性培养基。其配方是：葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，KH2PO4 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%,琼脂2%，孟加拉红（或称虎红）1/3万，链霉素30(g/ml，金霉素2(g/ml。此处的孟加拉红、链霉素和金霉素等的作用是抑制细菌生长，从而富集土壤中的真菌。 广义上讲，加富培养基也是一类选择性培养基。 13) 鉴别培养基(differential medium) 在培养基中添加某种或某些化学试剂后，某种微生物生长过程中产生的特殊代谢产物会与加入的这些化学物反应，并出现明显的、肉眼可见的特征性变化，从而使该种微生物与其它微生物区别开来。这种培养基称为鉴别培养基。例如：用于检测饮水、乳品中是否含肠道致病菌的伊红-美兰乳糖培养基，即EMB（Eosin Methylene Blue）培养基。其成分是：蛋白胨10克，乳糖10克，K2HPO4 2克，2%伊红 20ml，0.325%美兰20ml, 蒸馏水1000ml, pH7.2 其中的伊红和美兰两种苯胺染料可以抑制革兰氏阳性菌和一些难培养的革兰氏阴性菌。试样中的多种肠道菌会在EMB培养基上产生相互易区分的特征菌落，因而易于辨认。尤其是大肠杆菌，因其强烈分解乳糖而产生大量混合酸，使菌体带H+，很容易染上酸性染料伊红，伊红又与美兰结合，其复合物为黑色，所以，大肠杆菌的菌落呈紫黑色并带金属光泽，其菌落较小。产气杆菌产酸弱，菌落呈棕色；变形杆菌不能发酵乳糖，菌落无色、透明。 明胶培养基可用于鉴别产蛋白酶的微生物，醋酸铅培养基可用于鉴别微生物能否产生H2S。 选择性培养基与鉴别培养基的功能往往结合在同一种培养基中。例如上述EMB培养基既有鉴别不同肠道菌的作用，又有抑制革兰氏阳性菌和选择性培养革兰氏阴性菌的作用。 14) 测定生理生化特性的培养基 这些是在鉴定微生物时，为了观察微生物的培养特征或测定生理生化反应而采用的培养基。它们用于研究某种微生物能同化哪些碳水化合物，发酵哪些糖类，分解哪些简单的或复杂的含氮化合物，在生长或发酵过程中形成何种代谢产物等。石蕊牛奶培养基、营养肉汁明胶培养基、甲基红及V.P试验培养基、同化碳源基础培养基、同化氮源基础培养基、糖类发酵培养基、测定各种氨基酸或维生素的基础培养基以及测定各种酶类的培养基都属于此类。 3.1.4 营养物质的跨膜运输 微生物没有专门的摄食器官，只能够通过细胞表面进行物质交换。微生物的细胞表面是细胞壁和细胞膜。细胞壁只对大颗粒的物体起阻挡作用，而许多大分子物质可自由进出细胞壁，所以物质的进出主要与细胞膜有关。也就是说，细胞膜是物质进出细胞的主要屏障。细胞膜由磷脂双分子层构成，镶嵌有膜蛋白，磷脂碳氢链“尾巴”构成的非极性区对极性分子具有高度的不渗透性。 可以通过人工制备的磷脂双分子层膜实验间接地考察细胞膜对不同类型分子的相对透性，见图3.1.1。
图3.1.1 人工磷脂双分子层膜对不同类型分子的相对透性 一般来说，分子越小、脂溶性越高，就越容易通过细胞膜。某些脂溶性物质可以通过磷脂层的溶解而透过细胞，它们进入细胞是单纯的物理扩散过程。不带电的极性分子，如果足够地小，也可以很快地通过膜上小孔扩散进入细胞，如CO2、乙醇和尿素等。甘油分子稍大，扩散速度就比较慢。水分子也能很快地通过磷脂层，这可能是因为水分子小而且不带电。 某些非脂溶性物质（如糖、氨基酸、核苷酸和金属离子等）透过细胞就较复杂，因为双分子层对于这些物质是天然“屏障”，人工制备磷脂双分子层膜实验表明它几乎不能透过葡萄糖分子。据此推论，这些物质很难透过细胞膜或透过速度很慢。但事实上，这些物质都能够以很快的速度通过细胞膜，并在细胞中积聚，形成细胞内外浓度梯度。有时胞内浓度还大于周围环境浓度许多倍，甚至上千倍。如：大肠杆菌在生长期中，有选择地从周围环境摄取K+，胞内浓度比胞外高3000倍；当它以乳糖为碳源时，细胞内乳糖浓度比胞外高五百倍。这种现象不能用简单的扩散、渗透来解释。所以，除简单扩散这一物理作用外，还有一些特殊的、与生理机能紧密相关的运输形式。目前，一般认为营养物质进入细胞主要有四种方式：简单扩散（单纯扩散），促进扩散，主动运输和基团转移（位）。前两者不需能量，是被动的；后两者需要消耗能量，是主动的，并在营养物质的运输中占主导地位。 3.1.4.1 营养物质的被动扩散（Passive diffusion ) 营养物质顺浓度梯度，以扩散方式进入细胞的过程称为被动扩散。这个过程遵循基本的物理化学原理，但也有明显的生物学特征。微生物细胞膜并不是典型的半透膜，而是差异膜，它对各种物质的透性是有差异的（但并无绝对透与绝对不透之分），而且这种差异现象在生命过程中还不断地变化着，如膜的结构成分和载体等的改变和调整。虽然这种变化不会影响最后的结果，也不能改变流向，但却能加快物质进出的速度。 一些细胞可以将被运输物质迅速转移或及时在酶系统作用下转化，以免在细胞内积累，从而保持了被动扩散所需的浓度梯度，保证了运输。 被动扩散主要包括简单扩散和促进扩散。两者的显著差异在于前者不借助载体，后者需要借助载体进行。 1) 简单扩散（ Simple diffusion） 细胞膜的中层是疏水性的，通过细胞膜需通过三步才能完成： （1）从水相到疏水性的脂质层， （2）通过脂质层， （3）离开脂质层，进入水相。 营养物质通过细胞膜的难易程度与它们的极性有关。极性弱、脂溶性强的分子易进行简单扩散。当然，扩散的难易也与膜的结构有关（如脂肪链的长度，不饱和性）。 简单扩散的速度与该物质在细胞内外的浓度差成正比，方向从浓到稀。当细胞内外该物质的浓度达到平衡时，扩散就停止。扩散速率可用Fick 定律描述： J= D dC/dX 式中 J为被运输物质的扩散速度，D为扩散系数，dC/dX为该物质的浓度梯度。 极性分子完成前两步十分困难。事实上极性分子并不走以上的路线。因为膜是流动性的，磷脂的移动会导致膜疏水区域出现间隙（即小孔），这些小孔可允许小分子的极性分子通过。间隙的大小和形状对透过物质具有选择性。所以，对极性分子而言，简单扩散的难易程度与分子大小和形状有关。 水、某些气体（如N2，CO2，O2）、脂溶性物质（甘油，乙醇，苯）及少数氨基酸和盐可能采取简单扩散的方式通过细胞膜。 2) 促进扩散（Facilitated diffusion） 仅仅依靠简单扩散远远不能满足细胞的营养要求。实验发现，一些极性分子的被动扩散会显现出饱和效应和结构类似物的竞争关系。这说明这些极性分子的被动运输是在载体的帮助下进行的。 促进扩散就是有特异的载体蛋白参加而不需要代谢能的一种运输机制。运输的方向仍然是从浓到稀，但速度较快。载体蛋白就是细胞膜上特异性的膜蛋白。这种蛋白可与被运输营养物质（溶质）发生可逆性结合，并象“渡船”一样把溶质从细胞膜的一侧运到另一侧。在运输前后，载体本身不发生变化。它的存在可加快运输过程。图3.1.2 表示了这种运输模型。 载体蛋白的外部是疏水性的，但与溶质的特异性结合部位却是高度亲水的。载体亲水部位取代了极性溶质分子上的水合壳，实现载体与溶质分子的结合。具疏水性外表的载体将溶质带入脂质层，到达另一侧。因为胞内溶质浓度低，所以，溶质就会在胞内侧释放。
图3.1.2 促进扩散过程的模式图 载体蛋白对溶质具有选择性的。溶质和溶质类似物与载体蛋白的结合有竟争性抑制作用。载体蛋白一般由几个亚基构成，有功能亚基和调节亚基。运输（反应）速度受溶质（底物）浓度、pH及温度等因素影响。载体蛋白以上特性与酶极为相似，所以，也可将它们称为渗透酶（permease）。 细胞中有许多不同的渗透酶。每种只帮助一类物质的运输。它们大多数为诱导酶，即当外界存在某种物质时，才诱导产生该种物质的渗透酶。促进扩散的动力仍然是浓度梯度，不需要消耗能量。 促进扩散主要在真核生物细胞中用于运输糖分，在原核生物中较少见。 3.1.4.2微生物对营养物质的主动运输 对大多数微生物而言，环境中的盐和其它营养物质浓度总是低于细胞内浓度。也就是说，这些物质的摄取必需逆浓度梯度地“抽”到细胞内。显然，这个过程需要能量，并且需要渗透酶。我们将营养物质逆自身浓度梯度由稀处向浓处移动，并在细胞内富集的过程称为主动运输。 主动运输中的载体蛋白（渗透酶）还能改变反应的平衡点，而一般的酶不能改变平衡点，只能加快反应速度。 主动运输分为简单主动运输和基团移位两种机制。 1) 简单的主动运输(simple active transport) 简单的主动运输是在消耗代谢能的同时，实现溶质（营养物质）在细胞内浓集的过程。溶质在运输前后并不发生任何化学变化。 简单的主动运输可能是微生物的主要运输方式。大肠杆菌对乳糖的吸收就是主动运输的典型例证。乳糖先在膜外表面与其载体 —— 半乳糖苷渗透酶特异性结合，运到膜的内表面，在消耗能量的同时，酶的构型发生变化，对乳糖的亲和力下降而将其释放，乳糖在胞内得到浓集。如果加入能量生成的抑制剂或氧化磷酸化解偶联剂，如叠氮钠（NaN3)，即阻断了呼吸链，细胞对乳糖的吸收就会停止。这时，半乳糖苷透过酶在膜内外对半乳糖苷的亲和力相同，只能进行促进扩散。
图3.1.3 载体蛋白的运输模式 如果载体蛋白只是单纯地将某溶质从膜的一侧运输到另一侧，那么，它所形成的运输体系称为单一通道（uniport），该载体蛋白称为单向载体蛋白（uniporter）。两个不同的分子或离子被同一载体蛋白以同样方向同时或相继运输的系统称为同向通道（symport），该蛋白称为同向载体蛋白（symporter）。两个不同分子或离子被同一载体以相反方向同时或相继运输的系统称为逆向通道（antiport），相应的蛋白称为逆向载体蛋白（antiporter）。通过同向通道和逆向通道进行的物质运输称为协同运输（cotransport），见图3.1.3。 许多主动运输系统是被离子梯度中储存的能量驱动，而不是直接靠ATP水解而获能的。所有功能都是由同向通道或者逆向通道的协同系统来完成的。在细菌中，许多主动运输系统都是与H(协同运输的。例如，大多数糖和氨基酸进入细菌细胞的主动运输是由跨膜H(梯度驱动的。半乳糖苷渗透酶运输乳糖是与H(同向协同作用的结果，即每运入一个乳糖分子就有一个质子同时运入。真核细胞膜的Na(-K(ATPase也是一种协同运输系统，在消耗ATP的同时将Na(泵出细胞，将K(泵入细胞，是一种逆向通道，见图3.1.4。所以，离子梯度是由将辐射能或化学能转变为电-渗透能的机构（如与离子移位有关的ATP酶、光合磷酸化系统和呼吸链）完成的。
图3.1.4 Na(-K+ATPase主动运输模式图 （每消耗一分子ATP，就泵出三分子钠离子，泵进两分子钾离子） 离子载体（ionophores）是一类可溶于脂双分子层的疏水性小分子，它可以增大脂双分子层对离子的透性，大多数由微生物合成，有的就是抗生素。离子载体有两种模式：动态载体（mobile carrier）和静态载体（static carrier），见图3.1.5。
图3.1.5离子载体的运输模式图
图3.1.6 能运输碱金属的洁霉素离子载体 动态载体通过改变与营养物结合的部位（或旋转，或穿梭）来输送营养物质。静态载体在细胞膜上保持不动，但有供溶质通过的通道。 洁霉素（valinomycin）是链霉菌产生的一种抗生素，其结构为一环状缩肽分子，见图3.1.6。分子中的氨基酸残基的亲水基团指向内部，疏水基团暴露在脂质层中，它能高度专一地将碱金属离子（K+、Rb+、Cs+ 等）结合在它的环中，并把水合离子带过膜。它作为载体的能力依赖于膜的物理状态，运K(的能力随膜的粘度下降而上升，所以，它是一种动态载体。 尼日利亚菌素也是一种进行的K(、H(交换的动态载体。 短杆菌肽A(granmicidin A)是一种短芽孢杆菌产生的抗生素，由15个氨基酸组成的线状分子。疏水性侧链可与阳离子结合，但特异性比洁霉素低。短杆菌肽的两个单体分子头头相对形成二聚体，沿螺旋的轴向构成一个穿过膜的亲水通道，属于静态载体。因为二聚体不稳定，不断地形成和解离，是通道开放的时间大概可以用秒量度。当存在较高的电化学梯度时，短杆菌肽A每个通道在一秒内能运输2 X 107个阳离子，大约是动态载体运输量的一千倍。 2) 基团移位（group translocation) 若被运输的底物分子在膜内经受到了共价修饰，以被修饰的形式进入细胞质的输送机制称为基团移位或基团转移（group transport)。这种运输是通过磷酸基团发生移位，即从磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)转移到被输送的基质分子上而实现的，见图3.1.7。因为在运输过程中，消耗了磷酸烯醇式丙酮酸上的高能磷酸键，所以，这类运输也属于主动运输。
图3.1.7 细菌运输糖的基团移位模式图 基团移位最典型的例子是1964年在E.coli中发现的磷酸转移酶系统（phosphotransferase system , PTS ) 。它由三部分组成，酶Ⅰ，酶Ⅱ，HPr（组氨酸蛋白,histidine protein），酶Ⅰ是非特异性的，是磷酸烯醇式丙酮酸--己糖磷酸转移酶。酶Ⅱ对每一种糖具有特异性，能被各种糖诱导。它包括两部分：酶Ⅱa和酶Ⅱb。HPr为热稳定性可溶蛋白，像高能磷酸载体一样起作用，是非特异性的磷酰基载体蛋白。 金黄色葡萄球菌的磷酸转移酶系统由酶Ⅰ，酶Ⅱ，HPr和酶Ⅲ组成。酶Ⅲ相当于大肠杆菌的酶Ⅱb，是高能磷酸的中间受体，经诱导产生。 大肠杆菌中基团移位过程如下： 酶Ⅰ 磷酸丙酮酸盐(i) + HPr(i) ((( Hpr-磷酸(i) +丙酮酸盐(I) 酶Ⅱ Hpr-磷酸(i) + 糖(o) (((糖-磷酸(i) +HPr(i) 总反应式： 酶Ⅰ酶Ⅱ 磷酸丙酮酸盐(i) + 糖(o) ((( 丙酮酸盐(I) + 糖-磷酸(i) HPr(i) 在金黄色葡萄球菌中，基团转移过程如下： PEP(i) + 酶Ⅰ(i) ((( 酶Ⅰ～Pi + 丙酮酸(i) 酶Ⅰ～Pi + HPr(Im) ((( HPr-P(I) 酶Ⅰ(im) HPr-P(I) + 酶Ⅲ(im)((( HPr (I) + 酶Ⅲ-P(im) 酶Ⅱ 糖(o)+ 酶Ⅲ-P (((糖-P (i)+ 酶Ⅲ(i) 总反应为： 酶Ⅰ,酶Ⅱ,酶Ⅲ, PEP(i) + 糖(o) ((((( 糖-P(i) + 丙酮酸(i) Hpr 式中，下标i 表示胞内，o 表示胞外，im表示膜内。 由于膜对大多数极性的磷酸化合物有高度的不渗透性，所以，磷酸化后的糖不易再流出细胞，马上可以进入分解代谢。 根据目前所知，该方式主要用于许多单、双糖及糖的衍生物、核苷和核苷酸的运输。如大肠杆菌和伤寒杆菌的嘧啶、嘌呤碱就是通过基团移位方式输入的。 以上四大类营养物质跨膜运输方式的总结见表3.13。 表3.1.3 四种跨膜运输方式的比较 比较项目 简单扩散 促进扩散 简单的主动运输 基团移位  特异载体蛋白 运输速度 溶质运输方向 平衡时内外浓度 运输分子 能量消耗 运输前后的溶质分子 载体饱和效应 与溶质类似物 运输抑制剂 运输对象举例 无 慢 由浓到稀 相等 无特异性 不需要 不变 无 无竞争性 无 H2、CO2、O2、甘油、少数氨基酸、盐类 有 快 由浓到稀 相等 特异性 不需要 不变 有 有竞争性 有 SO42-、PO43- 糖（真核生物） 有 快 由稀到浓 胞内较高 特异性 需要 不变 有 有竞争性 有 氨基酸、乳糖等糖类、Na+、Ca2+等无机离子 有 快 由稀到浓 胞内较高 特异性 不要 改变 有 有竞争性 有 葡萄糖、果糖、甘露糖、嘌呤、核苷、脂肪酸   3.2 微生物的生长 微生物在适宜的环境条件下，不断吸收营养物质，合成自身的细胞组分，进行同化作用（assimilation）。若同化作用大于异化作用，那么，细胞原生质不断增加，细胞的重量和体积不断增大，这就是生长。 细胞生长是有限的，当细胞增长到一定程度时，就开始分裂，形成两个基本相似的子细胞。对于单细胞微生物，细胞分裂的结果就是个体数量增加，这就是繁殖。对多细胞微生物来而言，细胞数量增加并不一定伴随着个体数目的增加，因此只能称为生长。微生物从生长到繁殖是个量变到质变的发展过程，这一过程称为发育。发育是生物的构造和机能从简单到复杂的变化过程。所以说，生长是繁殖的基础，繁殖是生长的结果。 如何表述微生物的生长呢？微生物生长有那些规律？哪些因素会影响菌体生长？这是微生物学所关心的重要问题。 虽然生长和繁殖是不同的概念，但是，由于微生物个体细胞的生长时间较短，很快进入分裂即繁殖阶段，所以，生长和繁殖实际上很难区分。另外，由于测量方法的局限，我们常以细胞数目增加（即繁殖）来作为单细胞微生物生长的指标，这时所指的生长实际上是群体的生长。 3.2.1微生物生长的测定 描述不同种类、不同生长状态微生物的生长情况，需要选用不同的测定指标。对单细胞微生物，既可取细胞数，也可选取细胞重量作为生长的指标；而对多细胞（尤其是丝状真菌），则常以菌丝生长的长度或菌丝的重量为生长指标。由于考察的角度、测定的条件和要求不同，形成了许多微生物生长测定的方法。有的方法直接测定细胞的数量或重量，有的方法通过细胞组分的变化和代谢活动等间接地描述细胞的生长。 3.2.1.1直接法 1)显微计数法 通常采用血球计数板(hemocytometer)进行计数，即将一定稀释度的细胞悬液加到固定体积的计数器小室内，在显微镜下观测小室内细胞的个数，计算出样品中细胞的浓度。见图3.2.1。
图3.2.1 采用血球计数板测定细胞个数的程序 该法简便、快速，被广泛应用于单细胞微生物的测定，但不适用于多细胞微生物。被测定的细胞悬液中应该不存在会与细胞混淆的其它颗粒。该方法一般不能鉴别菌体死活，但有时可以预先在细胞悬液中加入染料而分辩出死菌和活菌。如：用美兰染料将酵母菌染色，活的酵母菌是无色的，死的菌体被染成蓝色，这样可以分别计算活菌数和死菌数。 将待测的细胞悬液按比例与血液混合后加入计数小室，在显微镜下测得待测细胞与红细胞的比例。因为血液中红细胞浓度是已知的，所以，可计算出每毫升样品中待测细胞数。这种方法也称比例计数法。将上述混合样品涂片后，显微镜下测定它们之间的比例，可以得到同样的结果。该方法较适用于测定细胞含量较低的样品。 2) 比色法（比浊法） 这是测定悬液中细胞数量的快速而简单的方法。因为菌体不透光，所以，悬液中单细胞的数量与光密度成正比。通常采用分光光度计，选择600-700nm之间的某一波长进行比色测定。但应该注意培养基的成分和培养产物不能在所选用的波长范围有吸收。如果样品颜色较深或其中有一些固体颗粒则不能直接采用比色法。 3) 干重测定法 将细胞培养液离心或过滤后，洗涤除去培养基成分后转移到适当的容器中，置100-105℃干燥箱烘干或低温低压干燥（60-80℃）至恒重后，称重。该方法要求培养液中没有除细胞以外的固体颗粒，否则结果就会产生较大误差。一般细胞干重为细胞湿重的10-20%。以细菌为例，一个细胞重约10-12-10-13克。 若是固体培养物，可先加热溶解琼脂， 然后过滤出菌体，洗涤、干燥后再称重。该法适合于单细胞和多细胞微生物的生长测定。 4) 菌丝长度测定法 这是针对丝状真菌生长而确定的测定方法。一般在固体培养基上进行。最简单的方法是将真菌接种在平皿的中央，定时测定菌落的直径或面积。对生长快的真菌，每隔24小时测定一次，对生长缓慢的真菌可数天测定一次，直到菌落覆盖了整个平皿。由此求出菌丝的生长速度。该法的缺点是没有反映菌丝纵向生长，即菌落的厚度和深入培养基内的菌丝，另外，接种量也会影响测定结果。 另一个计算真菌生长的方法是U形管培养法，见图3.2.2。U型管底部铺设一层培养基，将真菌接种在U形管的一端，定时测定菌丝的长度。这种方法的优点是对生长较快的菌丝可以有足够的时间进行测量。不易被污染，缺点是不能反映菌丝的总量，通气也不够良好。

图3.2.2 计算丝状真菌的U形管 图3.2.3 测定堆积体积的离心管 5) 细胞堆积体积测定法 将细胞悬液装入毛细沉淀管内，见图3.2.3，在一定条件下离心，根据堆积体积计算含菌量。一些工厂中将发酵液直接装入刻度离心管内，经过一定转速和时间的离心，从得到的体积推测出细胞的重量。细胞的密度变化不大，一般是在1.05-1.1之间。 6) 平皿菌落计数法 将发酵液稀释后涂布在固体培养基表面，也可将经过灭菌后冷却至45-50℃的固体培养基与一定稀释度和体积的菌悬液混合，凝固后培养适当时间，测定菌落形成单位（colony formation unit,CFU）的数目,见图3.2.4。涂布法不易使菌落均匀分布，从而影响菌体计数。混匀浇注法较易使菌落均匀分布，但分布在培养基内的部分细胞所形成的菌落较小，甚至无法形成菌落，这会影响菌体计数。所以两种方法各有利弊，可酌情选用。不同菌种的菌落大小不同，一般应将样品中的菌浓控制在9厘米培养皿中能生长50-500个CFU为佳。通常是先将待测样品作一系列稀释，每个稀释度在三个以上的平皿中培养生成菌落，取其平均值，根据合适的稀释度的平皿菌落数进行含菌量计算，见图3.2.5。
图3.2.4 两种常用的平皿菌落形成方法
图3.2.5 菌落计数的操作步骤 平皿菌落计数法可以反映样品中活菌的数量。该法要求菌体呈分散状态，否则单个菌落未必就是单个细胞形成的，所以，它较适合于细菌和酵母菌计数，不适于霉菌。如果培养基或培养条件不恰当，有些细胞也不能形成菌落。一个细胞一般要传25代，才会形成肉眼容易看到的菌落。 也有人将培养基放在固定于载玻片上的小环中，将细胞接种到这种微型平板上，经短时间培养后，将它们移到显微镜下观测菌落数目。与以上平皿计数法相比，它能更快地获得结果。 7)液体稀释法 对未知菌样作连续的10倍系列稀释。根据估计数，从最适宜的3个连续的10倍稀释液中各取5ml试样，分别接种到3组共15支装有培养液的试管中（每管接入1ml）。经培养后，记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查最大可能数表(MPN, most probable number,见有关微生物实验教材)，根据样品的稀释倍数就可计算出其中活菌含量。见图3.2.6。
图3.2.6液体稀释法操作示意图 8) 粒子计数器法（particle counter) 又称电阻法 如图3.2.7所示，将一电极放入一带微孔的小管内，从小管上端抽真空，将会造成含有细胞的电解液从微孔吸入管内。由于电极间有电压，当细胞通过微孔时，电阻增大，电阻会引起电流脉冲，脉冲的数目反映了通过的粒子数。因为计数器吸入样品的体积已知，所以，可以计算出细胞粒子的浓度。另外，电阻的大小与细胞大小成正比，所以，脉冲强度也反映了细胞粒子的大小。计数器配有各种大小的微孔，可用于不同大小的细胞。但是，粒子计数器无法区分其它颗粒，所以，样品中不能有细胞以外的其它颗粒存在。
图3.3.7 粒子计数器测定细胞数量的图解 3.2.1.2间接法 1) 根据细胞组分含量进行估算 每种细胞中核酸和蛋白质等组分的含量占有一定的比例，根据样品中这些物质的含量可以间接地估算出细胞含量。但在微生物细胞分批培养的不同生长阶段，这些细胞组成所占的比例可能有变化，其中RNA的变化最大。在对数期，菌体生长速度稳定，细胞组分也恒定，但在延迟期和衰亡期，细胞组分常有变化。 DNA在各种细胞内的含量最为稳定，它也不会因加入营养物而发生变化。尽管DNA测定方法较繁琐，费用也高，但在某些特殊情况下，DNA测定可发挥其特殊的优势。如固定化载体内的微生物含量一般无法用直接法测定，但可以将载体粉碎后测定DNA来估算微生物的细胞数量。 蛋白质测定在生化技术中比较成熟。菌体除去水分后，主要是蛋白质，含量也比较稳定。可以采用双缩脲、福林试剂或凯氏定氮法等常用手段测定蛋白含量以便间接确定菌体含量。但是，许多培养基的组成中也有蛋白质，这就限制了蛋白质测定法的应用。 ATP在活细胞生长过程中是作为化学能利用的中间体。它在各种微生物细胞中的含量也很稳定，一般是10-6M数量级。典型细菌细胞的ATP含量为每克细胞干重含有1毫克ATP。因为细胞死亡后几分钟内，ATP就会被水解，所以，以ATP为指标，可以快速、灵敏地反映活菌体数量。ATP测定可以利用萤光素酶催化的生物发光反应： 萤光素酶 荧光素 + O2 + ATP (((( 氧化荧光素 + AMP + 光 在氧气和ATP参与下，荧光素被氧化，释放出光子。光的强度与ATP含量成正比。发光反应在300毫秒内就达到高峰。这种发光反应借助发光光度计或液闪仪等特殊仪器进行测定。利用该法可以检测到很低浓度的ATP（10-12克/L），所以样品的需要量很小。 2) 从培养基成分的消耗量来估算 选择一种不用于合成代谢产物的培养基成分为检测对象，如磷酸盐、硫酸盐和镁离子。从这些成分的消耗量可以间接地估算出菌体的生长速度。若发酵的主要产品是菌体本身，也可从碳源或氧的消耗来估算。 3) 从细胞代谢产物来估算 在有氧发酵中，CO2是细胞代谢的产物，它与微生物生长密切有关。在全自动发酵罐中已应用红外线气体分析仪来测定发酵产生的CO2量，进而估算出微生物的生长量。 4) 从发酵液的粘度来估量 随着菌体量的增加以及粘性的发酵产物的形成，发酵液的粘度会显著地增大。发酵工厂常采用简单的粘度测定作为发酵生长量的监测指标之一。当然，发酵菌体裂解或染菌等不正常情况也会造成发酵液粘度的增大，从而增加估算的误差。 5) 从发酵的放热量来估算 产热是微生物生长中的普遍现象。发酵过程中的能量平衡可用下式表示： Q积累 =Q发酵+Q搅拌+Q蒸发+Q空气+Q散热 式中Q蒸发和Q空气一般可以忽略，而Q搅拌和Q散热 可以计算。这样可以连续测定发酵过程的产热量。 发酵热可以使用动力学量热法测定。将整个发酵罐看成一个绝热的量热器。在测定发酵热时，切断温度控制，允许温升0.5-1.0℃，累积的热量Q累积可从温度时间曲线的斜率（(T/(t）和系统的总热容Cp(kJ/℃)来估算，即： Q累积 = (T/(t·Cp （式中Cp是水的比热） 另一种简易方法是测定发酵罐冷却水的进口温度（T进）、出口温度（T出）和流速V。冷却水的能量平衡可以写成下式： Q积累=V Cp(T出-T进) 这种测定适用于表面积与体积比值较小的大型发酵罐。 6) 从发酵液的酸碱度来估量 在某些特定情况下，培养基pH的变化能较好地反映底物的消耗和微生物的生长。如氨的利用结果是释放出H(，导致pH 下降；类似地，硝酸盐作为氮源，氢离子被从培养基中移去，导致pH值上升。 3.2.2 微生物的群体生长规律 微生物在不受限制的条件下，生长的理想状态可用数学方法来描述。（对体系内的微生物培养物的生长状态也可进行近似的化学计量描述。） 如果，微生物细胞重量或细胞数量倍增之间的间隔恒定，那么，微生物就以对数速率增加，其生长可以用下式描述 dX/dt = (X 或 dN/dt = (nN 式中，X-细胞浓度（g/L）；N-细胞浓度（细胞数/L）；t-时间（h）；(-细胞重量的比生长速率（h-1）；(n-细胞数的比增长速率（h-1) ；乘积(X为菌体产率g/（L h）。 将方程式两边积分: 若比速率(为常数，则 式中x0是初始细胞浓度。细胞浓度增加一倍的时间称为细胞倍增时间(，即X2 = 2X1 所需要的时间，则 微生物生长速度可用平均倍增时间(或比生长速率(来描述。 以上数学公式只是描述了理想状态下的微生物群体生长，实际上，由于微生物种类、培养条件和所处生长阶段的不同，微生物群体生长有较大的差异。以下将主要讨论微生物在分批培养、连续培养和同步分裂培养条件下的生长规律。 3.2.1.1分批培养(Batch culture) 微生物在化学成分一定的培养基中进行培养称为分批培养或间歇培养。它是一个封闭体系，初始状态下含有限的营养物和微生物。微生物在分批培养中的生长速度随时间而发生有规律性的变化。 1) 细菌的生长曲线 在细菌分批培养过程中，定时取样测定单位体积里的细胞数，以单位体积中的细胞数的对数为纵坐标，以培养时间为横坐标，就可得到如图3.2.8所示的细菌繁殖曲线。细菌是单细胞微生物，细菌的繁殖也就是群体的生长，所以，繁殖曲线又称生长曲线。
图3.2.8 细菌的生长曲线 1、2为延迟期；3、4为对数生长期；5.为稳定期；6.为衰亡期 根据细菌生长曲线的变化规律，可把分批培养的全过程分为四个阶段：延迟期，对数生长期，稳定期，衰亡期。 (1)延迟期(lag phase) 又称适应期或调整期。当微生物进入一个新的培养环境时，一般并不立即进行繁殖，而是需要一个从微生物接种到培养基后的适应期。在开始一段时间内，细菌数或重量几乎不增加，甚至还稍有减小，这个时期称为延迟期。此时，菌体需要重新调整分子组成，包括酶和细胞结构成分，所以，又称调整期。 延迟期微生物有下列生理特性：a)菌体内含物质量显著增加，菌体体积增大，杆菌则表现出菌体明显伸长，如巨大芽孢杆菌在延迟期末细胞的长度比刚接种时大6倍，接种时只有约3.4(m, 3.5小时后增加到9.1(m，5.5小时后19.8(m 。b)菌体的代谢机能非常活跃，将产生特异性酶（如诱导酶）、辅酶及某些中间代谢产物以适应环境的变化。核糖体和ATP合成加快,这时细胞中的RNA，尤其rRNA含量较高，所以，细胞的嗜碱性强。c)对外界理化因素（如抗生素、盐、热、紫外线和X光等）影响的抵抗能力较弱。 延迟期的存在可能是移种到新培养环境的微生物一时还缺乏分解或催化底物的酶，或缺乏充分的中间代谢产物。要产生诱导酶或合成有关代谢物，就需要一个适应过程，所以出现了群体生长停滞现象，但细胞却处于旺盛的生长之中，只是细胞的分裂延迟了。 延迟期的长短与菌种的遗传性、菌龄、接种量及移种前后环境的差异等有关，短的只有几分种，长的可达几小时。 从菌种来看，细菌和酵母菌的延迟期短，霉菌次之，放线菌较长。繁殖快的菌种延迟期较短。接种前菌种处于对数生长期的，延迟期较短，甚至检测不到。天然培养基比合成培养基的延迟期短，接种到相同组分培养基比不同组分培养基的延迟期短。接种量大可以缩短，甚至消除延迟期。 延迟期的存在会延长微生物正常的生长周期，在发酵工业中，使生产周期延长、设备的利用率降低，所以，应该尽量缩短延迟期。可以采取的措施有，采用适当菌龄（处于对数生长期）的健壮菌种；发酵培养基的组成应尽量接近种子培养基，或在种子培养基中加入发酵培养基的成分及增加接种量，工业上常用的接种量是1:10。 (2)对数生长期(exponential growth phase,log phase) 延迟期末，细菌已适应了新环境，细胞开始分裂，并以几何级数增长，这一时期称为对数生长期。微生物在这个时期，生长非常旺盛，故又称生长旺盛期。细菌细胞数接近数学公式描述的理想生长状态。图中反映出此阶段的生长曲线趋于直线。 对数生长期微生物的生理特征有：a)菌体高速生长，生长速率常数最大，增代时间和原生质增倍的时间最短。该阶段养分充足，空间充裕，排出的代谢产物还不会影响生长。若培养基配方恰当，培养条件合适，生长速度则更快;b)生长繁殖速度易受培养温度的影响，应该尽量接近最适生长温度;c)处于该阶段前期的细胞对理化因素影响仍很敏感;d)菌体大小、形态、生理特征比较一致，大多是单个存在，所以，研究微生物遗传和代谢性能时宜采用该阶段的菌体。生产中接种的种子也应该用处于对数生长期的菌体。 在分批培养中，营养物浓度较低时，微生物的生长速度和菌体产量常受到某种营养物质浓度的影响，随着营养物浓度的逐渐提高，生长速度不受影响，而只影响最终菌体生长量，如果进一步提高营养物的浓度，则生长速度和菌体产量均不受影响，见图3.2.9。我们把在较低浓度范围内，影响菌体生长速率和菌体产量的营养物质称为限制性营养物质。限制性营养物质通常是碳源或能源，如葡萄糖。 若以比生长速率(对限制性营养物的浓度[S]作图，往往符合Monod公式： ( = (max[S/（KS + S）] 式中(max为最大比生长速率；S是培养基中限制性营养物质的浓度；KS为微生物以最大速度的一半的速度生长时，所要求的营养物质浓度，即( = (max/2时，KS = S。Monod公式只适用于单个限制性营养物质的情况。 常见的营养物质的KS值很小，当 S(10 KS时，( 接近于 (max ，比生长速率不再明显受营养物质浓度变化的影响。
图3.2.9 营养物浓度对生长速度和菌体产量的影响 (3)稳定期(stationary phase) 又称恒定期或最高生长期 当营养物质的消耗尤其是限制性营养物耗尽或营养物比例失调（如C/N改变），酸、醇、毒素和过氧化氢等有害代谢产物的积累，以及其它环境条件（如pH、氧化还原电位等）发生对菌体生长不利的变化时，在对数期末期，菌体生长速率就会逐渐下降，细胞分裂速度也逐渐下降，而死亡速率上升，以致出现繁殖率与死亡率逐渐趋于平衡，活菌数基本保持稳定的阶段，这一时期称为稳定期。 稳定期微生物的生理特征有：a)( =0，即菌体数处于动态平衡，此时，菌体产量达最高，若目标产物是菌体本身，则应在该阶段收获；b)细胞分裂速度下降，细胞内开始积累内含物，如肝糖、脂肪粒、多聚(-羟丁酸和多聚偏磷酸盐等。大多数产芽孢的细菌在开始产芽孢，以适应不利的环境；c)代谢活动继续，并保持相当水平，对于累积某些代谢产物或某些酶的发酵，此时是最佳的收获时机，有的微生物则开始合成次级代谢产物，如抗生素；d)该时期的长短与菌种、培养条件有关，若生产需要，可在菌种或工艺上采取措施，延长稳定期。 (4)衰亡期（decline phase) 若将稳定期后期的菌体继续培养，细胞死亡速率将进一步上升，以致明显超过繁殖速率，体系中活菌数明显下降，就到达了衰亡期。 若其中活菌数以几何级数下降，称为对数衰亡期。 衰亡期的出现是由于培养环境对微生物生长明显不利，使分解代谢大于合成代谢，最终导致细胞大量死亡。 这阶段微生物的生理特性有：a)(为负值；b)细胞内颗粒更明显，出现液泡，细胞出现多形态、畸形或衰退形，芽孢开始释放；c)因细菌本身产生的酶及代谢产物的作用，使菌体死亡，并伴随着自溶，有的微生物继续产生抗生素等次级代谢产物；c) 衰亡期比其它各期时间更长，而且时间长度取决于菌种及环境条件。 2) 丝状真菌的生长曲线 菌丝状微生物（放线菌、霉菌等）的生长曲线与单细胞微生物存在显著的不同，它们一般没有典型的对数生长期，见图3.2.10。 丝状真菌的生长过程大致可分为三个阶段： （1）生长停滞期 造成生长停滞的原因有两种，一是孢子萌发前真正的停滞状态，另一种情况是生长已经开始但还无法测定。 （2）迅速生长期 此时菌丝体干重迅速增加，其立方根与时间呈直线关系。因为它不是单细胞，繁殖不是以几何级数倍增，所以，它没有对数生长期。在迅速生长期中，碳、氮、磷等被迅速利用，呼吸强度达到顶峰。代谢产物有些出现有些不出现。 （3）衰亡期 真菌进入衰亡期的标志是菌丝体干重下降。一般是在短期内失重很快，以后不再变化。大多数次级代谢产物（如抗生素）在此时合成。处于衰亡期的大多数细胞都出现大的空泡。菌体自溶的程度因菌种和培养条件而异。
图3.2.10 丝状真菌的生长曲线 1. 对应线性纵坐标（左）；2.对应对数纵坐标（右）
图3.2.11 分批培养与连续培养的关系 3.2.1.2连续培养（continuous culture),又称开放培养（open culture) 分批培养时，培养基是一次性加入，不再更换，微生物的生长及代谢产物的积累经过一段有限的时间后就会结束。从分批培养中的稳定期起因的分析可知，如果，不断补充新鲜的培养基，同时，排出含细胞及代谢产物的发酵液，就有可能消除营养物质的不足及代谢产物的抑制作用，在理论上可以长期维持细胞处于对数生长期生长。细胞浓度、比生长速率和培养环境（如营养物和产物的浓度）将不随时间的变化而变化。这就是连续培养中菌体生长的重要特征。见图3.2.11。 3.2.1.3 同步分裂培养（synchronous culture) 在上述培养过程中，微生物群体以一定的速度生长，但是，并不是所有细胞同时进行分裂，而是有的早，有的迟，每个细胞的“年龄”并不相同。显然，这些培养条件下的微生物群体生长的生理生化特性不能很好地反映个体细胞的生理生化特性。同步分裂培养就是通过一定的手段，使培养物中所有的细胞处于同一生长阶段，使群体与个体的行为保持一致。同步分裂培养的生长曲线呈现“梯形”状，见图3.2.12。这种培养方式主要用在实验室中进行微生物细胞的生理生化研究。 使细胞分裂同步的手段主要有两种：诱导法和选择法。 1)诱导法 控制培养的物化条件（如温度、营养物），诱使细胞同步生长的方法称为诱导法。如果让菌体在低于或高于最适生长温度的环境下培养一段时间，这些细胞缓慢生长，但不发生分裂，然后，再将培养温度恢复到最适生长温度，这时，大多数细胞就会同时进行分裂。例如将鼠伤寒沙门氏杆菌置25℃28分钟，37℃8分钟，重复几次，就能获得37℃下同步生长的培养物。
图3.2.12 细菌的同步生长与非同步生长的曲线 也可以通过改变培养基成分来获得同步培养物。例如限制碳源或其它营养物，使细胞只能进行一次分裂而不能继续生长，从而获得刚分裂的细胞群体，然后转入适宜的培养基中，它们便进入同步生长。对于营养缺陷型菌株，同样可以通过控制它所缺乏的某种营养物质而达到同步化。例如大肠杆菌胸腺嘧啶缺陷型菌株，先在不含胸腺嘧啶的培养基中培养一段时间，所有的细胞在分裂后，由于缺乏胸腺嘧啶，DNA的合成停留在复制的前期，随后在培养基中加入适量的胸腺嘧啶，于是所有的细胞都会同步生长。 从细菌的生长曲线可知，处于稳定期的细胞，由于环境条件不利，细胞均处于衰老状态，如果移入新鲜培养基中，同样也可获得同步生长。 总之，诱导法就是创造一个微生物能生长，但是分裂受抑制的环境，一旦移去抑制条件，培养物细胞就能够同时开始分裂。 2)选择法 选择法是通过差速离心或过滤等手段，将处于不同生长阶段的细胞分开，从而实现同步培养。选择法的优点是它不会影响菌体的正常代谢，获得的菌体活力正常。但是，这种方法只适用于不同生长阶段的细胞大小和比重有明显差异的微生物种类。
图3.2.13 硝酸纤维素薄膜法 选择法中有一种较巧妙的操作方法——硝酸纤维素薄膜法，其大致过程如图3.2.13所示：（1）将菌液通过装有硝酸纤维素滤膜的过滤器，由于细菌与滤膜带有不同的电荷，所以处于不同生长阶段的细菌均附着在膜上；(2)将膜翻转，再用新鲜的培养液滤过培养；(3)附着在膜上的细菌开始分裂，分裂的子细胞不能与薄膜直接接触，由于菌体自身重量，加上它附带的培养液的重量，使菌体下落到收集器内；(4)收集器在短时间内获得的细菌都是处于同一分裂阶段的新细胞，用这些细胞接种培养，便能得到同步培养物。 需要指出的是，以上两类方法获得的培养物最多只能同步分裂4-5代，有的仅能维持一代。这是因为细胞个体之间差异总是存在的，这些差异随着分裂次数的增加就会逐渐增大。
图3.2.14 代谢产物和微生物细胞形成过程的关系 (a)酵母菌形成的初级代谢产物——乙醇；（b）产黄青霉形成的次级代谢产物——青霉素； 3.2.1.4 微生物生长与产物形成的关系 微生物发酵形成产物的过程与微生物细胞生长的过程并不总是一致的。一般认为微生物的初级代谢（primary metabolism）是给予生物能量和生成中间产物的过程, 初级代谢生成的中间产物称为初级代谢产物(primary metabolite)，如氨基酸、核苷酸、乙醇等，它们对微生物的生存是必需的，各种微生物形成的初级代谢产物种类也比较相似。这些产物的形成往往与微生物细胞的形成过程同步，见图 3.2.14(a)和图3.2.15(a)。在微生物分批培养过程中，微生物生长的稳定期是这些产物的最佳收获时机。另有一些产物与微生物的生存、生长和繁殖无关，称为次级代谢产物（secondary metabolite）。这些代谢产物的形成过程往往与微生物细胞生长过程不同步，见图3.2.14(b)、图3.2.15(b)和图3.2.15(c)。在分批培养中，它们形成的高峰往往在微生物生长的稳定期后期或衰亡期，初级代谢产物的关键中间体多半是次级代谢的前体。不同微生物形成的次级代谢产物的种类相差较大。次级代谢产物的种类主要有抗生素、生长激素、生物碱、维生素、色素和毒素等。相当多的次级代谢产物是重要的发酵产品。
图3.2.15 初级代谢产物和次级代谢产物 (1)细胞与代谢物几乎同时形成；(2)在细胞和初级代谢产物形成后，细胞将初级代谢产物转化为次级代谢产物；(3)在细胞形成后，进一步将营养物转化为次级代谢产物