第十四章 吸光光度法 §14-1 概论 利用被测物质对可见光具有选择性吸收的特性而建立的分析方法称为吸光光度法。如有一试样含铁量为0.01mg(g-1。试样经处理后，用1.8(10-3mol(L-1的KMnO4溶液滴定，到达化学计量点时，所用KMnO4溶液的体积为0.02ml。而通常滴定管的读数误差就有0.02ml，显然用滴定法测定该试样中的含铁量是不合适的。但是，在适当的反应条件下加入一种试剂（如磺基水杨酸），使它与Fe3+生成紫红色螯合物，即可用吸光光度法测定其含量。在试样的分析工作中，吸光光度法是常用的分析方法之一。 §14-2 光吸收基本原理 一、紫外(可见吸光光度法的特点 1．具有较高的灵敏度。一般物质可测到10-3(10-6mol(L-1。适用于微量组分的测定。 2．有一定的准确度。该方法相对误差为2%(5%，可满足对微量组分测定的要求。如一试样含铁量为0.020mg，相对误差5%，其含量在0.019(0.021 mg之间，该结果是令人满意的。 3．操作简便、快速、选择性好、仪器设备简单。近年来由于新显色剂和掩蔽剂的不断出现，提高了选择性，一般不分离干扰物质就能测定。 4．应用广泛。可测定大多数无机物质及具有共轭双键的有机化合物。 二、物质对光的选择性吸收 溶液之所以呈现不同的颜色，是与它对光的选择性吸收有关。当一束白光，通过一有色溶液时，某些波长的光被溶液吸收。另一些波长的光不被吸收而透过溶液。人眼能感觉的波长在400(760nm，为可见光区。溶液的颜色由透过光波长所决定。例如，KMnO4溶液强烈地吸收黄绿色的光，对其它的光吸收很少或不吸收，所以溶液呈现紫红色。又如CuSO4溶液强烈地吸收黄色的光，所以溶液呈现蓝色。如溶液对白光中各种颜色的光 都不吸收，则溶液为透明无色，反之，则呈黑色。如果两种颜色的光按适当的强度比例混合后组成白光，则这两种有色光称为互补色，如错误！未找到引用源。所示。成直线关系的两种光可混合成白光。各种物质的颜色的互补关系列于错误！未找到引用源。中。 图141有色光的互补色 表 141 物质颜色(透过光)与吸收光颜色的互补关系 颜色 黄绿 黄 橙 红 紫红 紫 蓝 绿蓝 蓝绿  吸收光色 波长/nm 紫 400(450 蓝 450(480 绿蓝 480(490 蓝绿 490(500 绿 500(560 黄绿 560(580 黄 580(610 橙 610(650 红 650(760  A  图142 光吸收曲线 以上仅简单地用有色溶液对各种波长光的选择吸收来说明溶液的颜色。究竟某种溶液最易选择吸收什么波长的光？可用实验方法来确定，即用不同波长的单色光透过有色溶液，测量溶液对每一波长的吸光程度（称为吸光度）。然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图可得一曲线，如错误！未找到引用源。所示，称为光吸收曲线。图中a、b、c、d代表被测物质含量由低到高的吸收曲线。每种有色物质溶液的吸收曲线都有一个最大吸收值，所对应的波长为最大吸收波长（(max）。一般定量分析就选用该波长进行测定，这时灵敏度最高。对不同物质的溶液，其最大吸收波长不同，此特性可作为物质定性分析的依据。对同一物质，溶液浓度不同，最大吸收波长相同，而吸光度值不同。因此，吸收曲线是吸光光度法中选择测定波长的重要依据。 §14-3 光的吸收定律(朗伯-比耳定律  图14-3光通过吸光物质示意图 当一束平行的单色光通过一均匀的吸收物质溶液时，吸光物质吸收了光能，光的强度将减弱，其减弱的程度同入射光的强度、溶液层的厚度、溶液的浓度成正比。如错误！未找到引用源。所示。表示它们之间的定量关系的定律称为朗伯-比耳定律，这是各类吸光光度法定量测定的依据。 一、朗伯定律 1760年朗伯提出了一束单色光通过吸光物质后，光的吸收程度与溶液液层厚度正比的关系，该关系称为朗伯定律。即  （141） 式14-1中，A为吸光度；I0为入射光强度；I为透射光强度；k(为比例常数；b为液层厚度（光程长度）。 二、比耳定律 1852年比耳又提出了一束单色光通过吸光物质后,光的吸收程度与吸光物质微粒的数目(溶液的浓度)成正比的关系，该关系称比耳定律。即  （142） 在（14-2）中，k((为比例常数；c为溶液的浓度。 三、朗伯-比耳定律 将两个定律合并起来就成为朗伯-比耳定律，其数学表达式为：  （143） 在（14-3）中，K为比例常数，它与吸光物质性质、入射光波长、及温度等因素有关，该常数称为吸光系数。通常液层厚度b以cm为单位，若以g(L-1为单位的质量浓度，则常数(用a表示, a为吸光系数；若以mol(L-1为单位的物质的量浓度，则常数(用(表示，( 为摩尔吸光系数。则（14-3）可改写为：  （14-4） 摩尔吸光系数( 是各种吸光物质在特定波长和溶剂下的一个特征常数，数值上等于在1cm的溶液厚度中吸光物质为1mol(L-1时的吸光度，它是吸光物质的吸光能力的量度。( 值是定性鉴定的重要参数之一，也可用以估量定量分析方法的灵敏度，即( 值越大，表示该吸光物质对某一波长的吸光能力越强，则方法的灵敏度越高。为了提高定量分析的灵敏度就必须选择合适的试剂与被测物生成(值大的配合物及具有最大( 值的波长的单色光作为入射光。 由（14-3）可见，如果光通过溶液时完全不被吸收，则I = I0，而I / I0=1。透过光I值越小，则I/I0的比值越小，因此，将I/I0称为透光度T。  或  （145） 式（14-5）是各类光吸收的基本定律。其物理意义为：当一束平行的单色光通过一均匀的、非散射的吸光物质溶液时，其吸光度与溶液液层厚度和浓度的乘积成正比。这是各类吸光光度法定量测定的依据。 例1双硫腙试剂与Cd2+形成红色络合物,可用光度法测定。已知(520= 8.8×104L·mol-1·cm-1，使用2cm比色皿，测得透射比为60.3%，计算Cd的质量浓度((g/mL)。（M(Cd)=112.4 ） 解： A=-lgT=- lg60.3%= 0.220   (?= 1.25×10-6×10-3×112.4×106 = 0.14((g/mL) 例2有一质量浓度为15.0 (g/mL, 摩尔质量为280g/mol的有机化合物，于2cm比色皿中，在某一波长下测得透射比为35%，求在该波长下的 ( 值。 解：A=-lgT=-lg35%=0.456 c ==5.36×10-5() (==4.25×103 （L(mol-1(cm-1） 例3用光度法测定一有色物质。已知摩尔吸光系数是2.5×104L·mol-1·cm-1，每升中含有5.0×10-3g溶质,在1cm比色皿中测得的透射比是10%。计算该物质的摩尔质量。 解：A =-lgT=-lg10%= 1.00   §14-4 偏离朗伯-比耳定律的原因 吸光光度法中，光的吸收定律是定量测定物质含量的基础。根据A=Kbc这一关系式，以A对c作图，应为一通过原点的直线，通常称为工作曲线（或称标准曲线）。有时会在工作曲线的高浓度端发生偏离的情况，如（图14-4）中虚线所示，即在该实验条件下，当浓度大于c1时，偏离了朗伯-比耳定律。引起偏离的原因很多，主要可能有以下几方 面的原因引起的不成线性关系。  图 043 吸光光度法工作曲线 一、朗伯-比耳定律的局限性 朗伯-比耳定律是一个有限制性的定律，它假设了吸收粒子之间是无相互作用的，因此仅在稀溶液的情况下才适用。在高浓度（通常c(0.01mol(L-1）时，由于吸光物质的分子或离子间的平均距离缩小，使相邻的吸光微粒（分子或离子）的电荷分布互相影响，从而改变了它对光的吸收能力。由于这种相互影响的过程同浓度有关系，因此使吸光度A与浓度c之间的线性关系发生了偏离。 二、非单色入射光引起的偏离 严格地讲，朗伯-比耳定律仅在入射光为单色光时才是正确的，实际上一般分光光度计中的单色器获得的光束不是严格的单色光，而是具有较窄波长范围的复合光带，这些非单色光会引起对朗伯-比耳定律的偏离，而不是定律本身的不正确，这是由仪器条件的限制所造成的。 三、由于溶液本身发生化学变化的原因而引起的偏离 由于被测物质在溶液中发生缔合、解离或溶剂化、互变异构、配合物的逐级形成等化学原因，造成对朗伯-比耳定律的偏离。这类原因所造成的误差称为化学误差。例如，在一个非缓冲体系的铬酸盐溶液中存在着如下的平衡： Cr2O72- + H2O  2HCrO4- 2CrO42- + 2H+ (橙色) (黄色) 测定时，在大部分波长处，Cr2O72-的(值与CrO42-的(值是很不相同的。因此，当铬的总浓度相同时，各溶液的吸光度决定于c(Cr2O72-/CrO42-)之比值，它将随溶液的稀释而发生显著的变化。所以将造成A与c之间线性关系的明显偏离。为了控制这一偏离可采用：在溶液中加碱使其中Cr2O72-全部转化为CrO42-；或加酸，使CrO42-全部转化为Cr2O72-。这样溶液中的总浓度c与A之间就能符合朗伯-比耳定律。 另外，有些配合物的稳定性较差，由于溶液稀释导致配合物离解度增大，使溶液颜色变浅，因此有色配合物的浓度不等于金属离子的总浓度，导致A与c不成线性关系。 §14-5 显色反应与显色条件的选择 许多无机离子无色，有些金属水合离子有色，但它们的吸光系数值很小，通常必须选一适当的试剂与它发生化学反应，从而转化为有色化合物再进行光度测定，此反应称显色反应，所用的试剂称显色剂。常用的显色反应大多是能形成很稳定的、具有特征颜色的螯合物的反应，也有的是氧化还原反应。可见，为了得到准确的分析结果，除了选择合适的测量仪器外，还要使被测离子能生成一个灵敏度和选择性较高有有色化合物。 一、对显色反应的要求 显色反应首先应有较高的灵敏度与选择性。灵敏度高，即在含量甚低时仍能测定。灵敏度的高低可从摩尔吸光系数(来判断，(值越大则灵敏度越高。通常(值为104～105L( g -1( cm -1时，则可认为该的反应的灵敏度较高。如Fe2+与邻二氮菲生成螯合物的为1.1(104L (g-1(cm-1，其灵敏度较高。选择性好，即在选定的反应条件下，显色剂仅与被测组分显色，不与共存的其他离子显色。其次是形成的有色螯合物的组成要恒定，化学性质要稳定，生成的有色螯合物与显色剂之间的颜色差别要大，显色条件要易于控制等。这样才能保证测定结果有良好准确度和重现性。 二、显色反应条件的选择 实际工作中，为了提高准确度，在选定显色剂后必须了解影响显色反应的因素，控制其最佳分析条件。现讨论如下： 1．显色剂的用量 在显色反应中存在下列平衡： M(被测离子) + R(显色剂) MR(有色配合物) 显色剂用量越多，越有利于M转化为MR。加入R稍过量，显色反应即能定量进行。有时显色剂用量太多，反而对测定不利。例如用SCN-作显色剂测定Mo时，要求生成Mo(SCN)5的红色配合物，而SCN-浓度过高时，则生成Mo(SCN)6-的浅红色配合物，致使其吸光度值降低。若SCN-浓度过低，则生成Mo(SCN)32+的浅红色配合物，也使吸光度降低。当以SCN-作显色剂测定Fe3+时，随SCN-浓度的增大，会逐级生成颜色更深的不同配位数的配合物，使其吸光度值增大。这说明必须严格控制显色剂的用量，以得到准确的测定结果。 2．酸度 酸度对显色反应的影响是多方面的。现讨论如下： (1) 酸度对显色剂颜色的影响 当显色剂为有机弱酸时，它本身具有酸碱指示剂的性质，在不同pH值的情况下，显色剂的分子和离子状态具有不同的颜色，它可能干扰测定。 (2 )酸度对配合物组成的影响 在不同酸度下，某些被测组分与显色剂能形成不同组成的配合物，例如，磺基水杨酸与Fe3+的显色反应中，当溶液在pH为2～3时，生成1∶1的红紫色配合物；pH为4～7时，生成1∶2的棕橙色配合物；pH为8～10时，生成1∶3的黄色配合物；当pH＞12时，生成Fe(OH)3沉淀。因此，必须严格控制溶液pH，才能得到准确的测定结果。 (3) 酸度对被测离子存在状态的影响 多数金属离子在溶液酸度降低时而发生水解，形成各种多核羟基配合物、碱式盐，甚至于析出氢氧化物沉淀，不利于吸光光度法的测定。 3．显色时的温度和时间 多数显色反应在室温下能很快地进行，但有些反应受温度影响很大，室温下反应很慢，须加热至一定温度（如磷钼蓝法测定磷，其发色温度为55～60℃)才能进行完全。有些反应在高温下不稳定，反应生成物易褪色，因此对不同的显色反应，必须选择合适的温度。显色反应由于反应速度不同，完成反应的时间也不同。有些反应能瞬时完成，且颜色能在长时间内保持稳定；有些反应虽能快速完成，但产物迅速分解。因此，必须选择适当的显色时间，使有色配合物的颜色能够稳定。然而，温度和时间的选择，都要通过试验来确定。 对于一般的分析，希望加入显色剂后数分钟就达到最大的吸光度值，且在1～2h内稳定不变。显色太慢，影响分析速度，颜色稳定时间太短，不便于操作。 4．溶剂的影响 许多有色配合物在水中解离度较大，而在有机溶剂中的解离度较小。例如，Fe(SCN)2+在丙酮溶液中，配合物颜色变深，从而提高了测定的灵敏度。有些配合物易溶于有机溶剂，如用适当的有机溶剂将它萃取出来，再测定萃取液的吸光度，这种方法称萃取比色法。它的优点是：分离了杂质，提高了方法的选择性；把有色物质浓缩到有机溶剂的小体积内，降低了它的解离度，从而提高了测定的灵敏度；方法比较简单、方便、快速。 5．干扰物质的影响及消除 常见的干扰物质对显色反应的影响表现为干扰离子本身有颜色、在测量条件下有吸收、或发生水解，或析出沉淀等，以影响吸光度的测量。如干扰离子与显色剂生成更稳定的无色配合物，消耗显色剂，使被测离子显色反应不完全；或干扰离子与显色剂生成有色配合物而干扰测定。消除干扰的方法可通过控制溶液的酸度；加入适当的掩蔽剂利用氧化还原反应改变干扰离子的价态；选择适当的测量条件，如利用两者的(max不同，选择适当波长进行测定；采用萃取或其它分离方法，预先分离干扰离子；选择合适的参比溶液等都可以消除干扰离子的影响。 §14-6 仪器测量误差和测量条件的选择 任何光度计都有一定的仪器测量误差，该误差可能来源于：入射光源的不稳定；吸收池玻璃的厚薄不均匀；池壁不够平行、表面有水迹；油污或划痕等；光电池不灵敏、疲劳现象及检流计的刻度不准，使光电流测量不够准确等。以上因素造成的测量误差的总和，最后表现为产生透光度读数误差(T。由于透光度T与浓度c之间是对数关系，在吸收池厚度b不变的情况下，同样的(T对不同浓度溶液所造成的(c不同。因此，为了使测定结果有较高的灵敏度和准确度，除注意显色反应的条件控制外，还必须选择和控制适宜的测量条件。主要考虑以下几个方面。 一、入射光波长的选择 根据吸收曲线，入射光波长的选择应以溶液的(max为宜。此时值最大，测定时灵敏度和准确度最高。但当有干扰存在时，应根据具体情况兼顾灵敏度和选择性。 二、光度计读数范围的选择 光度计读数误差是经常遇到的测量误差，当透光度读数太大或太小时，微小的透光度读数误差会造成相当大的浓度相对误差。根据朗伯(比耳定律： 或写成为 （14 6） 将式13 6微分得： d(lgT) = 0.434dT/T = -abdc （14-7）  14-5测量误差示意图 在分析工作中要注意的是由透光度T的读数误差所造成的浓度相对误差，由 （14 6和 （14-7可得：  （148） 将(c/c对T作图，可得图14-5所示的曲线。 不同的吸光度读数造成不同的浓度045 (c/c与T的关系相对误差。从图14-5可以看出在T = 36.8%(A = 0.434)处的浓度相对误差有一极小值，而在透光度坐标的两端的对应误差迅速增大。通常，透光度读数在15%～65% (A = 0.8～0.2) 范围内，此时浓度相对误差较小，因此过高或过低的吸光度都将造成很大的测量误差。通常可调整溶液浓度或吸收池厚度使吸光度读数落在这一范围内。一般分光光度计的透光度读数误差在(0.002至(0.01之间。如果以(0.005计算，这一误差所造成的浓度相对误差约在1.4%～2.2%左右。计算结果见表14-2所示。 表 042 不同T（或A）值时浓度测量的相对误差 (透光度测量误差(T假设为(0.005或(0.5%) 透光度 吸光度 浓度百分误差 透光度 吸光度 浓度百分误差  0.95 0.022 (10.2 0.40 0.399 (1.36  0.90 0.046 (4.74 0.30 0.523 (1.13  0.80 0.097 (2.80 0.20 0.699 (1.55  0.70 0.155 (2.00 0.15 0.824 (1.76  0.65 0.187 (1.78 0.10 1.000 (2.17  0.50 0.301 (1.44 0.02 1.699 (6.4   例4已知某钢样含锰约为试样的0.50%，将试样溶解使锰氧化为MnO4(，最后定容于100mL容量瓶中。今采用分光光度法测定锰，在525nm处,以1cm 比色皿测量其吸光度。为使测量误差所引起的浓度相对误差最小，问应称取钢样多少克 ? 解：已知(?（MnO4(）= 4.3×103 (L·mol-1·cm-1)， M(Mn)=54.9 ∵(c/c最小时, A = 0.43 C(Mn) = 0.43/4.3×10-3×1=1.0×10-4() 设：称取试样的质量为ms ∴ms×0.0050×(1000/100)/54.9 = 1.0×10-4 ms = 0.11（g） 三、参比溶液的选择 在吸光光度分析中，选择适当的参比溶液是非常重要的。通常参比溶液的选择应考虑以下两点。 1．如显色剂仅与被测组分反应的产物有吸收，其他试剂均无吸收，可以用纯溶剂作参比溶液。如显色剂和其他试剂略有吸收，则应用不含被测组分的试剂溶液作参比溶液。 2．如显色剂与试剂中干扰物质也发生反应，且产物在所选择的波长处也有吸收，则可选合适的掩蔽剂将被测组分掩蔽后再加显色剂和其他试剂，以此溶液作为参比溶液。  I0(为入射光；Ir为反射光；Ia为吸收光； It为透过光 图146 光吸收示意图 总之，选择参比溶液的目的是使测得的吸光度能真正反映被测物质的含量。参比溶液的作用是用来调节仪器零点，以消除吸收池壁及溶剂等对入射光的反射和吸收带来的影响。 在讨论光的吸收定律时指出，当有一束一定强度的单色光通过一均匀的有色溶液时，一部分被有色溶液吸收，还有一部分光被吸收池表面反射和被溶剂吸收，剩下部分光才是透过光。如14-6所示。因此，对原始入射光的强度I0与透过光强度It.的比值取对数并非与有色溶液浓度c成正比（即不符合朗伯-比耳定律）。 为了消除上述影响，必须采用与测定试样时的相同操作步骤配制一个合适的参比溶液，装入吸收池，置于光路中，并调节光强至吸光度A为零。然后，在同样条件下测量标准溶液及试样溶液的吸光度值。这样，即可消除吸收池表面的反射和溶剂的吸收的影响。 §14-7 吸光光度法应用 吸光光度法是测定微量组分的一种很好的方法，也能应用于常量组分和多组分的测定，已广泛地应用于各个领域的科学研究，如化学平衡的研究，有机物纯度测定等。 一、单组分的测定 标准曲线法——先将一系列标准溶液显色、定容、分别测其吸光度，作标准曲线，并在相同条件下，测出被测物的吸光度，由所测的吸光度便可在标准曲线上查出未知样品中被测物的浓度，如下图（14-7）所示。 图14-7标准曲线 二、多组分的测定 对于多组分的试液，如果各种吸光物质之间没有相互作用，且服从朗伯-比耳定律，这时体系的总吸光度等于各组分吸光度之和，即吸光度具有加和性，由此可得 A(总) = A1 + A2+……+An = (1bc1 + (2bc2 + ……+(nbcn （14-9） 通常，各组分的吸收光谱有: 1．吸收光谱互不重叠 如试样中含X、Y两组分，在一定条件下将它们转化为有色配合物，在某一波长(1时X组分有吸收而Y组分不吸收，在另一波长(2时Y组分有吸收而X组分不吸收。如图14-8所示。两组分互不干扰，可不经分离，分别在(1和(2处测量溶液的吸光度。  图 148 X和Y组分的吸收光谱互不重叠  图149 X和Y组分的吸收光谱单向重叠 2．吸收光谱单向重叠 图14-9所示为吸收光谱的单向重叠，即在(1时Y组分明显地与X组分同时有吸收，而在(2时X组分不吸收，它不干扰Y组分的测定。因此Y组分可在(2处测得吸光度，从而求出Y组分的浓度。但是，在(1时测得的吸光度则是X和Y的总吸光度A(1X+Y。因此，必须先测得Y组分的纯样在(1处的摩尔吸光系数((1Y，并根据已测得的混合物中Y组分的浓度计算出Y组分在(1时的吸光度A(1Y，则组分X的浓度就可从下式中求得：  （1410） 三、应用计算示例 例5称取合金钢试样0.5250g，用H2SO4-H3PO4混合酸溶解,以过硫酸铵- 银盐氧化试样中的Mn为MnO4-,然后定容于100mL容量瓶中,用1cm比色皿，于525nm 处测得吸光度为0.496。已知其摩尔吸光系数(525=2.24×103Lmol-1·cm-1，计算试样中锰的质量分数。M(Mn)=54.94 解： ∵A = (bc c = A/(b=0.496/（2.24×103×1 ）= 2.21×10-4() ∴ 例6有一试样含有x和y两种组分,组分x在(1和(2的摩尔吸光系数分别为 1.98 ×103(Lmol-1·cm-1)和2.80×104(Lmol-1·cm-1);组分y在(1和(2的摩尔吸光系数分别是2.04×104(Lmol-1·cm-1)和3.13×102(Lmol-1·cm-1),用相同的比色皿, 测得总吸光度总=0.301, 总= 0.398,计算试样中x和y的物质的量浓度。 解：