第 17章 高效液相色谱法 (High
Performance Liquid
Chromatography,HPLC)
概述
经典 LC HPLC
柱之内径 1~5cm ~0.4cm
长度 50~100cm 15~50cm
填充材料粒度 150μm~200μm 4μm~10μm
使用压力 1~10atm 50~200atm
分离时间 0.5h~天 ~10min
经典 LC与 HPLC比较
HPLC特点：高压, 高速, 高效, 高灵敏度, 样品回收方便
HPLC:采用高压输液泵, 高效微粒固定相和高灵敏度检测器
与气相色谱法比较, HPLC的 优点
1,分析对象广 气相色谱只限于分析气体和沸点较低的化合物；
HPLC不受样品挥发性和热稳定性的限制, 适用于高沸点, 热稳
定性差, 摩尔质量大的物质 。 原则上讲, 几乎可以分析除永久气
体外所有的有机和无机化合物 。
2,流动相对分离起作用 气相色谱的流动相仅起运载作用, 对组分
不产生相互作用力； HPLC的流动相对组分产生相互作用力, 相
当于增加了一个控制和改进分离条件的参数 。
3,经常在室温条件下操作 气相色谱法一般在较高温度下进行
缺点, 仪器设备费用昂贵, 操作严格 。
高效液相色谱法的分类
根据分离机理
? 液 -液分配色谱
? 化学键合相色谱
? 液 -固吸附色谱
? 离子交换色谱
? 离子色谱
? 离子对色谱
? 尺寸排阻色谱
? 亲和色谱
高效液相色谱仪
1.储液瓶 （ 输液管入口端安装有过滤
器 ） ； 2.高压输液泵； 3.混合器和阻
尼器； 4.进样器 （ 阀 ） ； 5.色谱柱；
6.检测器； 7.废液瓶； 8.数据处理和
控制系统
Agilent 1100系列高效液相色谱系统
高压输液系统
? 储液罐
? 高压输液泵 要求：密封性好，输出流量恒定，压力平稳，
可调流量范围宽，耐腐蚀
分类：恒流泵（机械泵）
恒压泵
? 过滤器
? 压力脉动阻力器
机械注射泵
机械往复泵
多用于流量要求在 1-50?L/min
范围的微型 HPLC或毛细管柱
HPLC中
活塞泵
隔膜泵
进样系统
? 隔膜注射进样器
? 高压进样阀 多采用六通阀进样
分离系统
? 色谱柱
柱管
固定相
检测系统
? 溶质性检测器 对被分离组分的物理或化学特性有响应
紫外检测器
荧光检测器
电化学（安培）检测器
? 总体检测器 对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应
示差折光检测器
电导检测器
紫外检测器
? 固定波长型 254 nm 或 280 nm
? 可调波长型 紫外可见分光光度计
光电二极管阵列的紫外检测器，采用计算机快速扫描采集
数据，可获得三维色谱图
Tungsten lamp
Coupling
lens
Deuterium lamp
Source lens
(Achromat)
Holmium
oxide
filter
Support lens
Flow cell
Spectro
lens
Grating
Array
Programmable
Slit
Optical Path - HP 1100
HP 1100 Diode Array
? Wavelength Range,190 - 950 nm
? Lamps:
Shine-through deuterium lamp (uv-range)
Tungsten lamp (vis-range)
? Slits,Programmable electromechanical; 1,2,4,8 and
16 nm
? Noise,2x10-5 AU at 254 nm and 750 nm
? Flow Cells,STD 10 mm 13 ul,Semi-micro 6 mm 5 ul,
Micro/HP 10 mm 1.7 ul
荧光检测器
? 优点：是一种选择性强、灵敏度高，比紫外检测
器高 2?3个数量级，可达 pg量级或更低，可用于
梯度淋洗。
? 缺点：样品适用范围有限，定量分析的线性范围
较窄 (104-105)。
示差折光检测器
偏转式和反射式
是一种通用型检测器, 灵敏度可达 10-7 g?cm-3。 缺点是对
温度变化敏感, 不能用于梯度淋洗 。
偏转式示差折光检测器光路图
电导检测器
? 是离子色谱法应用最多的检测器，依据物质在某些介质
中电离后所产生电导变化来测定电离物质的含量。受温
度的影响较大，需放在恒温箱中。 pH>7时不够灵敏。
附属系统
? 脱气
? 梯度淋洗
? 预饱和柱和预柱
? 恒温
? 自动进样
? 馏分收集
? 数据处理
梯度淋洗
? 在分离过程中使用两种或两种以上不同极性的溶剂按一
定程序连续改变它们之间的比例, 使流动相的强度, 极
性, pH或离子强度发生变化, 从而改变被测组分的相
对保留值, 提高分离效率 。 作用类似于气相色谱中的程
序升温 。
预柱和预饱和柱
? 预柱,安装在进样器和分析柱之间，填充有与分析柱相
同的固定相
作用：防止来自样品的不溶性颗粒物进入分析柱而造成污
染；将强保留组分截流在预柱上，避免进入分析柱而造
成污染。
? 预饱和柱,安装在泵和进样器之间，其中填充有硅胶填
料即可。
作用：防止固定相在流动相中的溶解
高效液相色谱的固定相
? 以承受高压能力分类
刚性固体
硬胶
? 按孔隙深度分类
表面多孔型固定相
全多孔型固定相
高效液相色谱的流动相
基本要求
? 对待测样品，有合适的极性和良好的选择性
? 高纯度
? 化学稳定性好
? 低粘度
? 与检测器相匹配
液固吸附色谱 (LSAC)
氧化铝和氧化镁
? 极性固定相 硅酸镁分子筛等 无定形硅胶
硅胶（酸性） 应用最广 薄壳型硅胶
全多孔球形硅胶
? 非极性固定相 多孔微粒活性炭
多孔石墨化碳黑
苯乙烯 -二乙烯基苯共聚物的单分散多孔小球
碳多孔小球
固
体
吸
附
剂
洗脱剂的选择：相似相溶
极性大的试样用极性强的洗脱剂, 极性弱的试
样用极性弱的洗脱剂
固定相
流动相
液液分配色谱 (LLPC)
? 固定相 载体和固定液 （ 常选用几种极性不同的固定
液）
? 流动相 要求：对固定相的溶解度尽可能小
分类
正相分配色谱 流动相的极性 <固定相的极性
适用于极性化合物的分离
反相分配色谱 流动相的极性 >固定相的极性
适用于非极性化合物的分离
化学键合相色谱 (CBPC)
键合固定相类型 利用硅胶表面的硅羟基与有机分子反应成键
1,非极性基团
2,极性基团
3,离子交换基团
键合相的键型
1,硅酸酯型 (?Si?OR) 适用于不含水或醇的流动相
2,硅氮型 (?Si?N?) 或硅碳型 (?Si?C?) 可用于非极性或强极性的
溶剂作流动相，当使用水溶液时，必须限制 pH在 4?8范围内
3,硅烷化 (?Si ?O ?Si ?C)型 具有热稳定性好，不易吸水，耐有
机溶剂，能在 70?C以下,pH在 2?8范围内正常工作
反相键合相色谱法
固定相,非极性键合固定相
流动相,极性较强的溶剂
正相键合相色谱法
固定相, 极性键合固定相
流动相, 比键合相极性小的非极性或弱极性有机溶剂
离子性键合相色谱法
固定相：以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合各种离子
交换基团
流动相：一般为缓冲溶液
优点,改变流动相的组成和种类，可有效分离各种类型化合物（极
性、非极性和离子型），适合于梯度淋洗。
缺点,不能用于酸、碱度过大或存在氧化剂的缓冲溶液作流动相
的体系
样品种类 键合基团 流动相 色谱类型 实例
低极性
溶解于烃类 ?C18
甲醇 -水
乙腈 -水
乙腈 -四氢呋喃
反相 多环芳烃
甘油三脂、类脂、脂溶性维
生素
甾族化合物、氢醌
中等极性
可溶于醇
?CN
?NH2
乙腈、正己烷
氯仿
正己烷
异丙醇
正相 脂溶性维生素、甾族、芳香醇、胺、类脂止痛药
芳香胺、脂、氯化农药、苯
二甲酸
?C18
?C8
?CN
甲醇、水
乙腈
反相 甾族、可溶于醇的天然产物
维生素、芳香酸、黄嘌呤
高极性
可溶于水
?C8
?CN
甲醇、乙腈
水、缓冲溶液
反相 水溶性维生素、胺、芳醇
抗菌素、止痛药
?C18 水、甲醇、乙腈 反相离子对 酸、磺酸类染料、儿茶酚胺
?SO3- 水和缓冲溶液 阳离子交换 无机阳离子、氨基酸
?NR3+ 磷酸缓冲液 阴离子交换 核苷酸、糖、无机阴离子、
有机酸
化学键合固定相的选择
离子交换色谱法 (IEC)
? 固定相,离子交换树脂
? 分类
按固定相制作方法：
1,多孔型离子交换树脂
2,薄膜型离子交换树脂
3,表面多孔型离子交换树脂
4,离子交换键合固定相
按离子交换剂类型,
1,强阳离子交换剂 以磺酸基为代表（ -SO3-)
2,强阴离子交换剂 以季胺基为代表 (-NR3+)
3,弱阳离子交换剂 以羧酸基为代表 (-COO-)
4,弱阴离子交换剂 以二乙基氨基为代表 (-CH2N(C2H5)2H+)
? 流动相：以水相 缓冲溶液为主，有时加少量
的有机改性剂
选择的原则：尽可能使样品和流动相的当量电
导相差大一些。
改变 pH和盐种类及其浓度，可改变选择
性
离子色谱法
? 由离子交换色谱法派生出来的
1,在离子交换分离柱后加一根抑制柱，降低流动相的电
导 抑制型离子色谱或双柱离子色谱
2,采用电导率极低的溶液作流动相 非抑制型离
子色谱或单柱离子色谱
离子对色谱法 (IPC)
? 正相离子对色谱
? 反相离子对色谱 键合相反相离子对色谱
固定相,非极性的疏水键合相
流动相,加有平衡离子（反离子）的极性溶液
通过改变流动相的 pH、平衡离子的浓度和种类可
改变分离的选择性
尺寸排阻色谱法 (SEC)
? 原理,依据试样分子的尺寸和形状不同进行分离
? 固定相,凝胶
分类
1,软性 葡萄糖、琼脂糖等凝胶
2,半刚性 中等交联度的聚苯乙烯等
3,刚性 多孔硅胶、多孔玻璃等
? 流动相 要求：能溶解样品，粘度低，与检测器相匹
配
应用,分离大分子物质，分离范围是相对分子质量
2000?2,000,000的物质
亲和色谱法 (AC)
? 固定相,载体和配基
载体,具有多孔网状结构，具有相当数量可供耦联的基团，
能结合配基，无吸附性，均一，有一定硬度，性质稳定。
常用的有琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、
多孔玻璃
配基,对亲和物有专一的亲和力，有能与载体相连的基团
如腺嘌呤核苷酸吸附剂，核苷酸吸附剂等
? 流动相,缓冲溶液
? 应用,生物大分子分离和分析
液相色谱方法选择
吸 附色 谱
分配色谱
凝胶渗
透色谱
分配色谱
凝胶渗
透色谱
凝胶过
滤色谱
凝胶过
滤色谱
离子交
换色谱
读书报告
对象：学号尾数为 8,9的同学必做
主题：高效液相色谱法在生命科学中的
应用
要求：查阅相关图书和文献, 字数不少
于 1000。
截止时间,5月 14日
报告提交形式：电子版或打印版或手写
版
Performance Liquid
Chromatography,HPLC)
概述
经典 LC HPLC
柱之内径 1~5cm ~0.4cm
长度 50~100cm 15~50cm
填充材料粒度 150μm~200μm 4μm~10μm
使用压力 1~10atm 50~200atm
分离时间 0.5h~天 ~10min
经典 LC与 HPLC比较
HPLC特点：高压, 高速, 高效, 高灵敏度, 样品回收方便
HPLC:采用高压输液泵, 高效微粒固定相和高灵敏度检测器
与气相色谱法比较, HPLC的 优点
1,分析对象广 气相色谱只限于分析气体和沸点较低的化合物；
HPLC不受样品挥发性和热稳定性的限制, 适用于高沸点, 热稳
定性差, 摩尔质量大的物质 。 原则上讲, 几乎可以分析除永久气
体外所有的有机和无机化合物 。
2,流动相对分离起作用 气相色谱的流动相仅起运载作用, 对组分
不产生相互作用力； HPLC的流动相对组分产生相互作用力, 相
当于增加了一个控制和改进分离条件的参数 。
3,经常在室温条件下操作 气相色谱法一般在较高温度下进行
缺点, 仪器设备费用昂贵, 操作严格 。
高效液相色谱法的分类
根据分离机理
? 液 -液分配色谱
? 化学键合相色谱
? 液 -固吸附色谱
? 离子交换色谱
? 离子色谱
? 离子对色谱
? 尺寸排阻色谱
? 亲和色谱
高效液相色谱仪
1.储液瓶 （ 输液管入口端安装有过滤
器 ） ； 2.高压输液泵； 3.混合器和阻
尼器； 4.进样器 （ 阀 ） ； 5.色谱柱；
6.检测器； 7.废液瓶； 8.数据处理和
控制系统
Agilent 1100系列高效液相色谱系统
高压输液系统
? 储液罐
? 高压输液泵 要求：密封性好，输出流量恒定，压力平稳，
可调流量范围宽，耐腐蚀
分类：恒流泵（机械泵）
恒压泵
? 过滤器
? 压力脉动阻力器
机械注射泵
机械往复泵
多用于流量要求在 1-50?L/min
范围的微型 HPLC或毛细管柱
HPLC中
活塞泵
隔膜泵
进样系统
? 隔膜注射进样器
? 高压进样阀 多采用六通阀进样
分离系统
? 色谱柱
柱管
固定相
检测系统
? 溶质性检测器 对被分离组分的物理或化学特性有响应
紫外检测器
荧光检测器
电化学（安培）检测器
? 总体检测器 对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应
示差折光检测器
电导检测器
紫外检测器
? 固定波长型 254 nm 或 280 nm
? 可调波长型 紫外可见分光光度计
光电二极管阵列的紫外检测器，采用计算机快速扫描采集
数据，可获得三维色谱图
Tungsten lamp
Coupling
lens
Deuterium lamp
Source lens
(Achromat)
Holmium
oxide
filter
Support lens
Flow cell
Spectro
lens
Grating
Array
Programmable
Slit
Optical Path - HP 1100
HP 1100 Diode Array
? Wavelength Range,190 - 950 nm
? Lamps:
Shine-through deuterium lamp (uv-range)
Tungsten lamp (vis-range)
? Slits,Programmable electromechanical; 1,2,4,8 and
16 nm
? Noise,2x10-5 AU at 254 nm and 750 nm
? Flow Cells,STD 10 mm 13 ul,Semi-micro 6 mm 5 ul,
Micro/HP 10 mm 1.7 ul
荧光检测器
? 优点：是一种选择性强、灵敏度高，比紫外检测
器高 2?3个数量级，可达 pg量级或更低，可用于
梯度淋洗。
? 缺点：样品适用范围有限，定量分析的线性范围
较窄 (104-105)。
示差折光检测器
偏转式和反射式
是一种通用型检测器, 灵敏度可达 10-7 g?cm-3。 缺点是对
温度变化敏感, 不能用于梯度淋洗 。
偏转式示差折光检测器光路图
电导检测器
? 是离子色谱法应用最多的检测器，依据物质在某些介质
中电离后所产生电导变化来测定电离物质的含量。受温
度的影响较大，需放在恒温箱中。 pH>7时不够灵敏。
附属系统
? 脱气
? 梯度淋洗
? 预饱和柱和预柱
? 恒温
? 自动进样
? 馏分收集
? 数据处理
梯度淋洗
? 在分离过程中使用两种或两种以上不同极性的溶剂按一
定程序连续改变它们之间的比例, 使流动相的强度, 极
性, pH或离子强度发生变化, 从而改变被测组分的相
对保留值, 提高分离效率 。 作用类似于气相色谱中的程
序升温 。
预柱和预饱和柱
? 预柱,安装在进样器和分析柱之间，填充有与分析柱相
同的固定相
作用：防止来自样品的不溶性颗粒物进入分析柱而造成污
染；将强保留组分截流在预柱上，避免进入分析柱而造
成污染。
? 预饱和柱,安装在泵和进样器之间，其中填充有硅胶填
料即可。
作用：防止固定相在流动相中的溶解
高效液相色谱的固定相
? 以承受高压能力分类
刚性固体
硬胶
? 按孔隙深度分类
表面多孔型固定相
全多孔型固定相
高效液相色谱的流动相
基本要求
? 对待测样品，有合适的极性和良好的选择性
? 高纯度
? 化学稳定性好
? 低粘度
? 与检测器相匹配
液固吸附色谱 (LSAC)
氧化铝和氧化镁
? 极性固定相 硅酸镁分子筛等 无定形硅胶
硅胶（酸性） 应用最广 薄壳型硅胶
全多孔球形硅胶
? 非极性固定相 多孔微粒活性炭
多孔石墨化碳黑
苯乙烯 -二乙烯基苯共聚物的单分散多孔小球
碳多孔小球
固
体
吸
附
剂
洗脱剂的选择：相似相溶
极性大的试样用极性强的洗脱剂, 极性弱的试
样用极性弱的洗脱剂
固定相
流动相
液液分配色谱 (LLPC)
? 固定相 载体和固定液 （ 常选用几种极性不同的固定
液）
? 流动相 要求：对固定相的溶解度尽可能小
分类
正相分配色谱 流动相的极性 <固定相的极性
适用于极性化合物的分离
反相分配色谱 流动相的极性 >固定相的极性
适用于非极性化合物的分离
化学键合相色谱 (CBPC)
键合固定相类型 利用硅胶表面的硅羟基与有机分子反应成键
1,非极性基团
2,极性基团
3,离子交换基团
键合相的键型
1,硅酸酯型 (?Si?OR) 适用于不含水或醇的流动相
2,硅氮型 (?Si?N?) 或硅碳型 (?Si?C?) 可用于非极性或强极性的
溶剂作流动相，当使用水溶液时，必须限制 pH在 4?8范围内
3,硅烷化 (?Si ?O ?Si ?C)型 具有热稳定性好，不易吸水，耐有
机溶剂，能在 70?C以下,pH在 2?8范围内正常工作
反相键合相色谱法
固定相,非极性键合固定相
流动相,极性较强的溶剂
正相键合相色谱法
固定相, 极性键合固定相
流动相, 比键合相极性小的非极性或弱极性有机溶剂
离子性键合相色谱法
固定相：以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合各种离子
交换基团
流动相：一般为缓冲溶液
优点,改变流动相的组成和种类，可有效分离各种类型化合物（极
性、非极性和离子型），适合于梯度淋洗。
缺点,不能用于酸、碱度过大或存在氧化剂的缓冲溶液作流动相
的体系
样品种类 键合基团 流动相 色谱类型 实例
低极性
溶解于烃类 ?C18
甲醇 -水
乙腈 -水
乙腈 -四氢呋喃
反相 多环芳烃
甘油三脂、类脂、脂溶性维
生素
甾族化合物、氢醌
中等极性
可溶于醇
?CN
?NH2
乙腈、正己烷
氯仿
正己烷
异丙醇
正相 脂溶性维生素、甾族、芳香醇、胺、类脂止痛药
芳香胺、脂、氯化农药、苯
二甲酸
?C18
?C8
?CN
甲醇、水
乙腈
反相 甾族、可溶于醇的天然产物
维生素、芳香酸、黄嘌呤
高极性
可溶于水
?C8
?CN
甲醇、乙腈
水、缓冲溶液
反相 水溶性维生素、胺、芳醇
抗菌素、止痛药
?C18 水、甲醇、乙腈 反相离子对 酸、磺酸类染料、儿茶酚胺
?SO3- 水和缓冲溶液 阳离子交换 无机阳离子、氨基酸
?NR3+ 磷酸缓冲液 阴离子交换 核苷酸、糖、无机阴离子、
有机酸
化学键合固定相的选择
离子交换色谱法 (IEC)
? 固定相,离子交换树脂
? 分类
按固定相制作方法：
1,多孔型离子交换树脂
2,薄膜型离子交换树脂
3,表面多孔型离子交换树脂
4,离子交换键合固定相
按离子交换剂类型,
1,强阳离子交换剂 以磺酸基为代表（ -SO3-)
2,强阴离子交换剂 以季胺基为代表 (-NR3+)
3,弱阳离子交换剂 以羧酸基为代表 (-COO-)
4,弱阴离子交换剂 以二乙基氨基为代表 (-CH2N(C2H5)2H+)
? 流动相：以水相 缓冲溶液为主，有时加少量
的有机改性剂
选择的原则：尽可能使样品和流动相的当量电
导相差大一些。
改变 pH和盐种类及其浓度，可改变选择
性
离子色谱法
? 由离子交换色谱法派生出来的
1,在离子交换分离柱后加一根抑制柱，降低流动相的电
导 抑制型离子色谱或双柱离子色谱
2,采用电导率极低的溶液作流动相 非抑制型离
子色谱或单柱离子色谱
离子对色谱法 (IPC)
? 正相离子对色谱
? 反相离子对色谱 键合相反相离子对色谱
固定相,非极性的疏水键合相
流动相,加有平衡离子（反离子）的极性溶液
通过改变流动相的 pH、平衡离子的浓度和种类可
改变分离的选择性
尺寸排阻色谱法 (SEC)
? 原理,依据试样分子的尺寸和形状不同进行分离
? 固定相,凝胶
分类
1,软性 葡萄糖、琼脂糖等凝胶
2,半刚性 中等交联度的聚苯乙烯等
3,刚性 多孔硅胶、多孔玻璃等
? 流动相 要求：能溶解样品，粘度低，与检测器相匹
配
应用,分离大分子物质，分离范围是相对分子质量
2000?2,000,000的物质
亲和色谱法 (AC)
? 固定相,载体和配基
载体,具有多孔网状结构，具有相当数量可供耦联的基团，
能结合配基，无吸附性，均一，有一定硬度，性质稳定。
常用的有琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、
多孔玻璃
配基,对亲和物有专一的亲和力，有能与载体相连的基团
如腺嘌呤核苷酸吸附剂，核苷酸吸附剂等
? 流动相,缓冲溶液
? 应用,生物大分子分离和分析
液相色谱方法选择
吸 附色 谱
分配色谱
凝胶渗
透色谱
分配色谱
凝胶渗
透色谱
凝胶过
滤色谱
凝胶过
滤色谱
离子交
换色谱
读书报告
对象：学号尾数为 8,9的同学必做
主题：高效液相色谱法在生命科学中的
应用
要求：查阅相关图书和文献, 字数不少
于 1000。
截止时间,5月 14日
报告提交形式：电子版或打印版或手写
版
