第七章 线粒体疾病的遗传 几乎每个人体细胞中都含有数以百计的线粒体，每个线粒体内膜上富含5种具有传递电子功能的酶复合体，组成呼吸链-氧化磷酸化系统，将代谢过程中产生的电子通过连锁反应逐步传递给氧并将质子从线粒体基质转移到膜间腔，形成跨内膜的质子梯度，复合物Ⅴ（ATP合酶）利用质子顺浓度回流到基质中所产生的势能，使ADP磷酸化生成ATP，为细胞提供进行各种生命活动所需要的能量。 线粒体内还含有DNA分子，被称为人类第25号染色体，是细胞核以外含有遗传信息和表达系统的细胞器，其遗传特点表现为非孟德尔遗传方式，又称核外遗传。1981年Anderson等人完成了人类线粒体基因组的全部核苷酸序列的测定，1988年，Wallace等发现Leber视神经病的发生与线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）突变有关。近年来，人们发现线粒体不仅在细胞的生长代谢中起重要作用，而且mtDNA突变是许多人类疾病的重要病因。 第一节 人类线粒体基因组 mtDNA编码线粒体中部分蛋白质和全部的tRNA、rRNA，能够独立进行复制、转录和翻译，但所含信息量小，呼吸链-氧化磷酸化系统的80多种蛋白质亚基中，mtDNA仅编码13种，绝大部分蛋白质亚基和其他维持线粒体结构和功能的蛋白质都依赖于核DNA（nuclear DNA，nDNA）编码，在细胞质中合成后，经特定转运方式进入线粒体。此外，mtDNA基因的表达受nDNA的制约，线粒体氧化磷酸酶化系统的组装和维护需要nDNA和mtDNA的协调，二者共同作用参与机体代谢调节，因此线粒体是一种半自主细胞器，受线粒体基因组和核基因组两套遗传系统共同控制（图7-1），nDNA与mtDNA基因突变均可导致线粒体中蛋白质合成受阻，细胞能量代谢缺陷。 图7-1 mtDNA与nDNA的协同作用 一、线粒体基因组 线粒体基因组是人类基因组的重要组成部分，全长16569bp，不与组蛋白结合，呈裸露闭环双链状，根据其转录产物在CsCl中密度的不同分为重链和轻链，重链（H链）富含鸟嘌呤，轻链（L链）富含胞嘧啶。 mtDNA分为编码区与非编码区，编码区为保守序列，不同种系间75%的核苷酸具同源性，此区包括37个基因：2个基因编码线粒体核糖体的rRNA（16S、12S），22个基因编码线粒体中的tRNA，13个基因编码与线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）有关的蛋白质。13个基因序列都以ATG（甲硫氨酸）为起始密码，并有终止密码结构，长度均超过可编码50个氨基酸多肽所必需的长度，由这13个基因所编码的蛋白质均已确定，其中3个为构成细胞色素c氧化酶（COX）复合体（复合体Ⅳ）催化活性中心的亚单位（COXⅠ、COXⅡ和COXⅢ），这三个亚基与细菌细胞色素c氧化酶是相似的，其序列在进化过程中是高度保守的；还有2个为ATP合酶复合体（复合体Ⅴ）F0部分的2个亚基（A6和A8）；7个为NADH-CoQ还原酶复合体（复合体Ⅰ）的亚基（ND1、ND2、ND3、ND4L、ND4、ND5和ND6）；还有1个编码的结构蛋白质为CoQH2-细胞色素c还原酶复合体（复合体Ⅲ）中细胞色素b的亚基；各基因之间排列极为紧凑，部分区域还出现重叠，即前一个基因的最后一段碱基与下一个基因的第一段碱基相衔接，利用率极高。无启动子和内含子，缺少终止密码子，仅以U或UA结尾。基因间隔区只有87bp，占mtDNA总长度的的0.5%。因而，mtDNA任何区域的突变都可能导致线粒体氧化磷酸化功能的病理性改变。 非编码区也叫控制区（control-region，CR）或D环区（displacement loop region，D-loop），由1122bp组成（图7-2），与mtDNA的复制及转录有关，包含H链复制的起始点（OH）、H链和L链转录的启动子（PH1、PH2、PL）以及4个保守序列（分别在213～235、299～315、346～363bp和终止区16147～16172bp）。 图7-2 线粒体基因组 mtDNA突变率极高，多态现象比较普遍，两个无关个体的mtDNA中碱基变化率可达3%，尤其D环区是线粒体基因组中进化速度最快的DNA序列，极少有同源性，而且参与的碱基数目不等，其16024nt～16365nt（nt：核苷酸）及73nt～340nt两个区域为多态性高发区，分别称为高变区Ⅰ（hypervariable regionⅠ，HVⅠ）及高变区Ⅱ（hypervariable regionⅡ，HVⅡ），这两个区域的高度多态性导致了个体间的高度差异，适用于群体遗传学研究，如生物进化、种族迁移、亲缘关系鉴定等。 二、线粒体基因的转录 与核基因转录比较，mtDNA的转录有以下特点：①两条链均有编码功能：重链编码2个rRNA、12个mRNA和14个tRNA；轻链编码1个mRNA和8个tRNA；②两条链从D-环区的启动子处同时开始以相同速率转录，L链按顺时针方向转录，H链按逆时针方向转录；③mtDNA的基因之间无终止子，因此两条链各自产生一个巨大的多顺反子初级转录产物。H链还产生一个较短的、合成活跃的RNA转录产物，其中包含2个tRNA和2个mRNA；④tRNA基因通常位于mRNA基因和rRNA基因之间，每个tRNA基因的5′端与mRNA基因的3′端紧密相连，核酸酶准确识别初级转录产物中tRNA序列，并在tRNA两端剪切转录本，形成单基因的mRNA、tRNA和rRNA，剪切下来的mRNA无5′帽结构，在polyA聚合酶的作用下，在3′端合成一段polyA，成为成熟的mRNA。初级转录产物中无信息的片段被很快降解；⑤mtDNA的遗传密码与nDNA不完全相同：UGA编码色氨酸而非终止信号，AGA、AGG是终止信号而非精氨酸，AUA编码甲硫氨酸兼启动信号，而不是异亮氨酸的密码子；⑥线粒体中的tRNA兼用性较强，其反密码子严格识别密码子的前两位碱基，但第3位碱基的识别有一定的自由度（称碱基摆动），可以识别4种碱基中的任何一种，因此，1个tRNA往往可识别几个简并密码子，22个tRNA便可识别线粒体mRNA的全部密码子（表7-1）。与nDNA比较，线粒体密码子的第3位更常见的是A或C，这是线粒体密码子简并性的主要来源。 表7-1 丙氨酸（Ala）的tRNA反密码子摆动 密码子 反密码子   核tRNA 线粒体tRNA  GCU、GCC GCA、GCG GGC UGC UGC   三、线粒体DNA的复制 mtDNA可进行半保留复制，其H链复制的起始点（OH）与L链复制起始点（OL）相隔2/3个mtDNA。复制起始于L链的转录启动子，首先以L链为模板合成一段RNA作为H链复制的引物，在DNA聚合酶作用下，复制一条互补的H链，取代亲代H链与L链互补。被置换的亲代H链保持单链状态，这段发生置换的区域称为置换环或D环，故此种DNA复制方式称D-环复制。随着新H链的合成，D环延伸，轻链复制起始点OL暴露，L链开始以被置换的亲代H链为模板沿逆时针方向复制。当H链合成结束时，L链只合成了1/3，此时mtDNA有两个环：一个是已完成复制的环状双链DNA，另一个是正在复制、有部分单链的DNA环。两条链的复制全部完成后，起始点的RNA引物被切除，缺口封闭，两条子代DNA分子分离（图7-3）。新合成的线粒体DNA是松弛型的，约需40分钟成为超螺旋状态。 图7-3 D-环复制 多细胞生物中，mtDNA复制并不均一，有些mtDNA分子合成活跃，有些mtDNA分子不合成。复制所需的各种酶由nDNA编码。 mtDNA的复制形式除D环复制外，还有θ复制、滚环复制等，相同的细胞在不同环境中可以其中任何一种方式复制，也可以几种复制方式并存，其调节机制不明。 第二节 线粒体基因的突变 自从1988年发现第一个mtDNA突变以来，已发现100多个与疾病相关的点突变、200多种缺失和重排，大约60%的点突变影响tRNA，35%影响多肽链的亚单位，5%影响rRNA。mtDNA基因突变可影响OXPHOS功能，使ATP合成减少，一旦线粒体不能提供足够的能量则可引起细胞发生退变甚至坏死，导致一些组织和器官功能的减退，出现相应的临床症状。 确定一个mtDNA是否为致病性突变，有以下几个标准：①突变发生于高度保守的序列或发生突变的位点有明显的功能重要性；②该突变可引起呼吸链缺损；③正常人群中未发现该mtDNA突变类型，在来自不同家系但有类似表型的患者中发现相同的突变；④有异质性存在，而且异质性程度与疾病严重程度正相关。 mtDNA突变类型主要包括点突变、大片段重组和mtDNA数量减少。 一、点突变 点突变发生的位置不同，所产生的效应也不同。已知的由mtDNA突变所引起的疾病中，2/3的点突变发生在与线粒体内蛋白质翻译有关的tRNA或rRNA基因上，使tRNA和rRNA的结构异常，普遍影响了mtDNA编码的全部多肽链的翻译过程，导致呼吸链中多种酶合成障碍；点突变发生于mRNA相关的基因上，可导致多肽链合成过程中的错义突变，进而影响氧化磷酸化相关酶的结构及活性，使细胞氧化磷酸化功能下降。 二、大片段重组 mtDNA的大片段重组包括缺失和重复，以缺失较为常见。大片段的缺失往往涉及多个基因，可导致线粒体OXPHOS功能下降，产生的ATP减少，从而影响组织器官的功能。 最常见的缺失是8483～13459位碱基之间5.0kb的片段，该缺失约占全部缺失患者的1/3，故称“常见缺失”（common deletion），由于ATPase8、ATPase6、COⅢ、ND3、ND4L、ND4、ND5及部分tRNA基因的丢失，造成OXPHOS中某些多肽不能生成，ATP生成减少，多见于Kearns-Sayre综合症（KSS）、缺血性心脏病等；另一个较为常见的缺失是8637～16073位碱基之间7.4kb的片段，两侧有12bp的同向重复序列，丢失了ATPase6、COⅡ、ND3、ND4L、ND4、ND5、ND6、cytb、部分tRNA和D-环区的序列，多见于与衰老有关的退行性疾病；第三种常见的缺失是第4389至14812位10.4kb的片段，由于大部分基因丢失，能量代谢受到严重破坏。 引起mtDNA缺失的原因可能是mtDNA分子中同向重复序列的滑动复制或同源重组，典型疾病为KSS、慢性进行性眼外肌瘫痪（CPEO）等。 三、mtDNA数量减少 mtDNA数量的减少可为常染色体显性或隐性遗传，即提示该病由核基因缺陷所致线粒体功能障碍。 四、mtDNA突变的修复 mtDNA突变率比nDNA高10～20倍，其原因有以下几点：①mtDNA中基因排列非常紧凑，任何mtDNA的突变都可能会影响到其基因组内的某一重要功能区域；②mtDNA是裸露的分子，不与组蛋白结合，缺乏组蛋白的保护；③mtDNA位于线粒体内膜附近，直接暴露于呼吸链代谢产生的超氧粒子和电子传递产生的羟自由基中，极易受氧化损伤。如：mtDNA链上的脱氧鸟苷（dG）可转化成羟基脱氧鸟苷（8-OH-dG），导致mtDNA点突变或缺失；④mtDNA复制频率较高，复制时不对称。亲代H链被替换下来后，长时间处于单链状态，直至子代L链合成，而单链DNA可自发脱氨基，导致点突变；⑤缺乏有效的DNA损伤修复能力。过去人们认为线粒体中缺乏DNA修复系统，近年来的研究表明，线粒体有一定的自我修复能力。 mtDNA的修复机制主要有两种。一种为切除修复：核酸内切酶先切除损伤DNA片段，然后DNA聚合酶以未损伤链为模板，复制正确的核苷酸序列以填补形成的空缺。线粒体内存在上述过程所需的几种酶；另一种是转移修复，通过转移酶识别突变核苷酸（如甲基化核苷酸），并将该突变核苷酸清除。线粒体中虽然存在该修复类型所需的某些酶，但种类较少，清除突变碱基的能力远低于nDNA，而且在分裂旺盛的组织中有酶活性，在分裂终末组织（如脑组织）中则无酶活性。 第三节 线粒体疾病的遗传 每个细胞中有许多线粒体，每个线粒体中有若干个DNA分子。因此，由线粒体DNA突变所引起的细胞病变就不可能像核DNA突变引起的细胞病变那么简单。缺失多发生于体细胞中，引起的疾病常为散发，无家族史，突变mtDNA随年龄增长在组织细胞中逐渐积累，故诱发的疾病在一定的年龄阶段表现并进行性加重，缺失的大小、位置与疾病的生化表现和严重程度是否相关尚无定论；发生在生殖细胞中的mtDNA突变引起母系家族性疾病。 一、母系遗传 在精卵结合时，卵母细胞拥有上百万拷贝的mtDNA，而精子中只有很少的线粒体，受精时几乎不进入受精卵，因此，受精卵中的线粒体DNA几乎全都来自于卵子，来源于精子的mtDNA对表型无明显作用，这种双亲信息的不等量表现决定了线粒体遗传病的传递方式不符合孟德尔遗传，而是表现为母系遗传（maternal inheritance），即母亲将mtDNA传递给她的儿子和女儿，但只有女儿能将其mtDNA传递给下一代（图7-4）。 图7-4 线粒体基因病系谱 异质性在亲子代之间的传递非常复杂，人类的每个卵细胞中大约有10万个mtDNA，但只有随机的一小部分（2～200个）可以进入成熟的卵细胞传给子代，这种卵细胞形成期mtDNA数量剧减的过程称“遗传瓶颈效应”。通过“瓶颈”的mtDNA复制、扩增，构成子代的mtDNA种群类型。瓶颈效应限制了下传的mtDNA的数量及种类，造成子代个体间明显的异质性差异，甚至同卵双生子也可表现为不同的异质性水平。因此，一个线粒体疾病的女患者或女性携带者（因细胞中异常mtDNA未达到阈值或因核基因的影响而未发病）可将突变mtDNA传递给子代，子代个体之间异质的mtDNA的种类、水平可以不同（图7-5），由于阈值效应，子女中得到较多突变mtDNA者将发病，得到较少突变mtDNA者不发病或病情较轻。 图7-5　线粒体的母系传递（涂黑的为突变线粒体）O：卵子; S：精子; A、B、C：子代细胞 Mitochondrial inheritance 1.Mitochondria have their own DNA and are inherited only from the mother. 2.Mitochondria are distributed randomly in daughter cells, so these may contain normal mitochondrial DNA, mutant DNA, or a mixture of both. there is, therefore, variable expression of disease due to mutation in mitochondrial DNA, depending upon the relative proportion of normal to mutant DNA. No affected male will transmit the disease (e.g. Leber’s optic atrophy). 3.Mutations in mitochondrial DNA occur more frequently (as much as tenfold faster)than those in nuclear genes involved in oxidative phosphorylation. 4.The physiologic effect of defective mitochondrial function depends on the energy requirements of the cell. 5.Oxidative phosphorylation integrity declines with aging, paralleling the accumulation of mitochondrial DNA mutations in somatic cell. 6.The same clinical profile may result from different genetic defects, and, less commonly, an identical genetic defect can result in different phenotype. 二、多质性 人体不同类型的细胞含线粒体数目不同，通常有成百上千个，而每个线粒体中有2～10个mtDNA分子，由于线粒体的大量中性突变，因此，绝大多数细胞中有多种mtDNA拷贝，其拷贝数存在器官组织的差异性。 细胞融合实验表明不同线粒体之间tRNA和rRNA存在翻译互补作用，其机制可能是线粒体互相融合及mtDNA及其转录物的再分布。 三、异质性 如果同一组织或细胞中的mtDNA分子都是一致的，称为同质性（homoplasmy）。在克隆和测序的研究中发现一些个体同时存在两种或两种以上类型的mtDNA，这是由于mtDNA发生突变，导致一个细胞内同时存在野生型mtDNA和突变型mtDNA，称为异质性（heteroplasmy）。野生型mtDNA对突变型mtDNA有保护和补偿作用，因此，mtDNA突变时并不立即产生严重后果。 线粒体异质性可分为序列异质性（sequence-based heteroplasmy）和长度异质性（length-based heteroplasmy），一般表现为：①同一个体不同组织、同一组织不同细胞、同一细胞甚至同一线粒体内有不同的mtDNA拷贝；②同一个体在不同的发育时期产生不同的mtDNA。 不同组织中异质性水平的比率和发生率各不相同，中枢神经系统、肌肉异质性的发生率较高，血液中异质性的发生率较低；在成人中的发生率远远高于儿童中的发生率，而且随着年龄的增长，异质性的发生率增高。 mtDNA的异质性可以表现在编码区，也可以表现在非编码区，编码区的异质性通常与线粒体疾病相关。由于编码区和非编码区突变率以及选择压力的不同，正常人mtDNA的异质性高发于Ｄ环区。 四、阈值效应 mtDNA突变可以影响线粒体OXPHOS的功能，引起ATP合成障碍，导致疾病发生，但实际上基因型和表现型的关系并非如此简单。突变型mtDNA的表达受细胞中线粒体的异质性水平以及组织器官维持正常功能所需的最低能量影响，可产生不同的外显率和表现度。 异质性细胞的表现型依赖于细胞内突变型和野生型mtDNA的相对比例，能引起特定组织器官功能障碍的突变mtDNA的最少数量称阈值。在特定组织中，突变型mtDNA积累到一定程度，超过阈值时，能量的产生就会急剧地降到正常的细胞、组织和器官的功能最低需求量以下，引起某些器官或组织功能异常，其能量缺损程度与突变型mtDNA所占的比例大致相当。 阈值是一个相对概念，易受突变类型、组织、老化程度变化的影响，个体差异很大。例如，缺失5kb的变异的mtDNA比率达60%，就急剧地丧失产生能量的能力。线粒体脑肌病合并乳酸血症及卒中样发作（MELAS）患者tRNA点突变的mtDNA达到90%以上，能量代谢急剧下降。 不同的组织器官对能量的依赖程度不同，对能量依赖程度较高的组织比其它组织更易受到OXPHOS损伤的影响，较低的突变型mtDNA水平就会引起临床症状。中枢神经系统对ATP依赖程度最高，对OXPHOS缺陷敏感，易受阈值效应的影响而受累。其它依次为骨骼肌、心脏、胰腺、肾脏、肝脏。如肝脏中突变mtDNA达80％时，尚不表现出病理症状，而肌组织或脑组织中突变mtDNA达同样比例时就表现为疾病。 同一组织在不同功能状态对OXPHOS损伤的敏感性也不同。如线粒体脑疾病患者在癫痫突然发作时，对ATP的需求骤然增高，脑细胞中高水平的突变型mtDNA无法满足这一需要，导致细胞死亡，表现为梗塞或梗死。 线粒体疾病的临床多样性也与发育阶段有关。例如肌组织中mtDNA的部分耗损或耗竭在新生儿中不引起症状，但受损的OXPHOS系统不能满足机体生长对能量代谢日益增长的需求，就会表现为肌病。散发性KSS和进行性眼外肌瘫痪（PEO）患者均携带大量同源的缺失型mtDNA，但却有不同的临床表现：KSS为多系统紊乱，PEO主要局限于骨骼肌，可能是由于mtDNA缺失发生在囊胚期之前或之中，在胚层分化时，如果缺失mtDNA相对均一地进入所有胚层，将导致KSS；仅分布在肌肉内将导致PEO。 突变mtDNA随年龄增加在细胞中逐渐积累，因而线粒体疾病常表现为与年龄相关的渐进性加重。在一个伴有破碎红纤维的肌阵挛癫痫（MERRF）家系中，有85%突变mtDNA的个体在20岁时症状很轻微，但在60岁时临床症状却相当严重。 五、不均等的有丝分裂分离 细胞分裂时，突变型和野生型mtDNA发生分离，随机地分配到子细胞中，使子细胞拥有不同比例的突变型mtDNA分子，这种随机分配导致mtDNA异质性变化的过程称为复制分离。在连续的分裂过程中，异质性细胞中突变型mtDNA和野生型mtDNA的比例会发生漂变，向同质性的方向发展。分裂旺盛的细胞（如血细胞）往往有排斥突变mtDNA的趋势，经无数次分裂后，细胞逐渐成为只有野生型mtDNA的同质性细胞。突变mtDNA具有复制优势，在分裂不旺盛的细胞（如肌细胞）中逐渐积累，形成只有突变型mtDNA的同质性细胞。漂变的结果，表型也随之发生改变。 （李晓雯）