Medical Microbiology
Department of Microbiology,HMU
第一篇 微生物学基础第 8章微生物感染的病原学检查法微生物学教研室 谷鸿喜提纲
细菌感染的微生物学检查法病原体检查 核酸的检测 抗原、抗体的检测
病毒感染的微生物学检查法电镜及免疫电镜 病毒的分离培养和鉴定核酸的检测 抗原、抗体的检测
真菌感染的微生物学检查法直接镜检 真菌的分离培养病原学实验室诊断方法
形态学检查
光学显微镜 电子显微镜
分离培养和鉴定
免疫学技术
抗原－抗体检测
分子生物学方法
病原体基因检测标本的采集与送检原则
无菌操作
感染部位、病变部位采集标本
不同时间采集不同标本
尽量在使用抗生素前采集
检查特异性抗体，采急性期和恢复期双份血清
≥4倍有诊断价值。血清标本应 -20℃ 保存
及时送检
多数细菌标本应冷藏送检。脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌应注意保温，床旁接种
病毒 4℃ ~-70℃ 保存细菌感染的微生物学检查法
细菌学诊断
病原菌成分检测
抗体的检测细菌学诊断示踪性检测
形态学检查
分离培养
生化试验
血清学鉴定致病力和药敏测定
动物实验
毒力检测
药物敏感试验形态学检查
细菌染色检查法
革兰染色法（ Gram stain）
抗酸染色法（ acid-fast stain）
荧光染色
暗视野检查（ darkfield examination）
用于检查活菌、螺旋体及其动力直接涂片镜检
形态与染色性具有特征的病原菌可直接染色镜检，根据典型形态、排列、染色性做初步诊断病原菌的分离培养：菌落
大小
形态
颜色
表面性状
透明度
溶血性生化反应糖发酵试验 H2S试验 枸橼盐利用试验血清学鉴定
利用含已知的特异性抗体的免疫血清，对细菌（志贺菌属、沙门菌属）进行群和型的鉴别
常用方法是玻片凝集试验动物实验
常用动物小鼠 豚鼠 家兔
接种途径皮内 皮下 腹腔 静脉脑内 鼻腔 灌胃毒力检测
半数致死量
median lethal
dose,LD50
半数感染量
median
infective dose,
ID50
Elek平板
白喉毒素
肠产毒性大肠埃希菌肠毒素药物敏感试验
Antimicrobial susceptibility test
方法
纸碟法、试管法、小杯法和凹孔法
最低抑菌浓度
minimum inhibitory concentration,MIC
能够抑制培养基内细菌生长的最低药物浓度
最低杀菌浓度
minimum bactericidal concentration,MBC
是指能够杀灭培养基内细菌的最低药物浓度。 MIC和
MBC的值越低，表示细菌对该药越敏感
杀菌性药物的抑菌和杀菌浓度相等或相近，但抑菌性药物即使在很高的浓度下也无杀菌作用病原菌成分检测
抗原 的检测
用 已知 的特异性 抗体 检测 未知 的细菌 抗原 成分
方法有玻片凝集试验、协同凝集试验、间接血凝试验、乳胶凝集试验、对流免疫试验、酶免疫技术、免疫荧光技术和同位素标记技术等
核酸 的检测
核酸杂交
PCR
病原菌抗原的检测
利用已知的特异性 Ab检测 Ag的方法
常用的方法有
沉淀反应（ precipitation test）
协同凝集试验（ coagglutination test）
免疫荧光法（ immunoflorecence,IF）
单克隆抗体技术（ McAb technique）
细菌核酸的检测
基因探针
DNA印迹杂交 (southern blot)
质粒指纹图谱分析
PCR
PCR
基因芯片（ microarray chip）
血清学诊断：检测抗体
用 已知细菌或其 Ag检测相应的 Ab及量的多少，作为某些病原菌感染的辅助诊断
急性期和恢复期 双份血清,恢复期效价升高 ≥4倍有诊断价值
局限
难以早期诊断
当抗体水平升高，很难找出抗体效价与病情间关系
方法：玻片或试管凝集试验、沉淀试验、补体结合试验和冷凝集试验细菌感染的实验诊断方法病毒感染的实验室诊断方法
形态学检查
分离培养
病毒在细胞中增殖的鉴定指标
病毒成分的检测
病毒抗体的检测形态学检查
电子显微镜（ electromicroscopy,EM）
免疫电镜法 immunoelectromicroscopy,IEM
光学显微镜
包涵体（ inclusion body）
内基小体（ Negri body）
病毒的分离培养
动物接种
鸡胚培养,9~14日鸡胚
组织培养
器官培养 组织培养 细胞培养细胞培养培养细胞的类型
原代细胞 Primary cell culture
体外分裂 2~3代
二倍体细胞 Diploid cell
保持二倍染色体,50~100代，用于病毒疫苗生产
传代细胞
体外无限分裂的细胞，多是肿瘤细胞
易于传代，多数病毒敏感，但不能用于制备疫苗，
且可能有内源性病毒病毒在细胞增殖的鉴定指标
细胞病变效应（ cytopathic effect,CPE）
红细胞吸附（ hemadsorption）
红细胞凝集（ hemagglutination）
病毒干扰作用（ viral interference）
中和试验（ neutralization test,NT）
细胞病变效应（ CPE）
病毒的定量
TCID50
病毒感染性和毒力的指标是 50%组织细胞感染量（
50% tissue culture infectious dose）
PFU
空斑形成试验（ plaque formation）
每毫升病毒悬液空斑形成单位（ pfu/ml）
用于病毒浓度的精确定量病毒的数量与感染性测定
蚀斑测定：准确滴定病毒感染性的方法
蚀斑（ Plaque），
每个蚀斑是由一个有感染性病毒颗粒形成，
称为 蚀斑形成单位 （ Plaque forming unit，
PFU）。病毒的感染量用 PFU/ml表示
50%感染量（ ID50）或 50%组织细胞感染量（ TCID50）
不能准确地测定感染性病毒颗粒的数量病毒成分的检测
病毒 抗原 的检测
目前常用的技术是荧光标记技术、酶标记技术
（如 enzyme linked immunosorbent assay，
ELISA）或放射免疫标记技术。
病毒 核酸 的检测
基因芯片（ gene chip）
DNA芯片（ DNA chip）或 cDNA微矩阵列（
cDNA Microarray）
病毒抗体的检测
中和试验（ neutralization test,NT）
血凝抑制试验（ hemagglutination inhibition
test,HI）
补体结合试验（ complement fixation,CF）
ELISA法
蛋白印迹技术（ Western blot）
ELISA for HIV antibody
Microplate ELISA for HIV antibody,coloured wells indicate reactivity
病毒感染的实验室诊断方法病毒感染的快速诊断
形态学检查
电镜和免疫电镜
普通光学显微镜：包涵体
检查病毒性抗原
免疫荧光 / 固相放射免疫测定 / 酶免疫技术
检测特异性抗体的快速诊断,IgM
病毒核酸的检测真菌感染的微生物学检查法
直接镜检
皮屑、指（趾）甲和毛发等先用 10%的 KOH处理，然后进行镜检。观察孢子、菌丝或假菌丝。若怀疑新生隐球菌，墨汁负染后镜检，芽生菌体外围绕宽厚荚膜
分离培养
沙保弱培养基（ pH5.6，不适宜细菌生长），常加入放线（菌）酮、青霉素、链霉素或其他抑制性抗生素。
在 25℃ ～ 28℃ 下培养数日至数周，观察菌落特征
可疑深部真菌感染的标本可接种于血平板、肉渣培养基，分别在室温和 37℃ 培养数日至数周
血清学诊断
核酸杂交探针技术小结
细菌感染的微生物学检查法病原体检查 核酸的检测 抗原、抗体的检测
病毒感染的微生物学检查法电镜及免疫电镜 病毒的分离培养和鉴定核酸的检测 抗原、抗体的检测
真菌感染的微生物学检查法直接镜检 真菌的分离培养
Department of Microbiology,HMU
第一篇 微生物学基础第 8章微生物感染的病原学检查法微生物学教研室 谷鸿喜提纲
细菌感染的微生物学检查法病原体检查 核酸的检测 抗原、抗体的检测
病毒感染的微生物学检查法电镜及免疫电镜 病毒的分离培养和鉴定核酸的检测 抗原、抗体的检测
真菌感染的微生物学检查法直接镜检 真菌的分离培养病原学实验室诊断方法
形态学检查
光学显微镜 电子显微镜
分离培养和鉴定
免疫学技术
抗原－抗体检测
分子生物学方法
病原体基因检测标本的采集与送检原则
无菌操作
感染部位、病变部位采集标本
不同时间采集不同标本
尽量在使用抗生素前采集
检查特异性抗体，采急性期和恢复期双份血清
≥4倍有诊断价值。血清标本应 -20℃ 保存
及时送检
多数细菌标本应冷藏送检。脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌应注意保温，床旁接种
病毒 4℃ ~-70℃ 保存细菌感染的微生物学检查法
细菌学诊断
病原菌成分检测
抗体的检测细菌学诊断示踪性检测
形态学检查
分离培养
生化试验
血清学鉴定致病力和药敏测定
动物实验
毒力检测
药物敏感试验形态学检查
细菌染色检查法
革兰染色法（ Gram stain）
抗酸染色法（ acid-fast stain）
荧光染色
暗视野检查（ darkfield examination）
用于检查活菌、螺旋体及其动力直接涂片镜检
形态与染色性具有特征的病原菌可直接染色镜检，根据典型形态、排列、染色性做初步诊断病原菌的分离培养：菌落
大小
形态
颜色
表面性状
透明度
溶血性生化反应糖发酵试验 H2S试验 枸橼盐利用试验血清学鉴定
利用含已知的特异性抗体的免疫血清，对细菌（志贺菌属、沙门菌属）进行群和型的鉴别
常用方法是玻片凝集试验动物实验
常用动物小鼠 豚鼠 家兔
接种途径皮内 皮下 腹腔 静脉脑内 鼻腔 灌胃毒力检测
半数致死量
median lethal
dose,LD50
半数感染量
median
infective dose,
ID50
Elek平板
白喉毒素
肠产毒性大肠埃希菌肠毒素药物敏感试验
Antimicrobial susceptibility test
方法
纸碟法、试管法、小杯法和凹孔法
最低抑菌浓度
minimum inhibitory concentration,MIC
能够抑制培养基内细菌生长的最低药物浓度
最低杀菌浓度
minimum bactericidal concentration,MBC
是指能够杀灭培养基内细菌的最低药物浓度。 MIC和
MBC的值越低，表示细菌对该药越敏感
杀菌性药物的抑菌和杀菌浓度相等或相近，但抑菌性药物即使在很高的浓度下也无杀菌作用病原菌成分检测
抗原 的检测
用 已知 的特异性 抗体 检测 未知 的细菌 抗原 成分
方法有玻片凝集试验、协同凝集试验、间接血凝试验、乳胶凝集试验、对流免疫试验、酶免疫技术、免疫荧光技术和同位素标记技术等
核酸 的检测
核酸杂交
PCR
病原菌抗原的检测
利用已知的特异性 Ab检测 Ag的方法
常用的方法有
沉淀反应（ precipitation test）
协同凝集试验（ coagglutination test）
免疫荧光法（ immunoflorecence,IF）
单克隆抗体技术（ McAb technique）
细菌核酸的检测
基因探针
DNA印迹杂交 (southern blot)
质粒指纹图谱分析
PCR
PCR
基因芯片（ microarray chip）
血清学诊断：检测抗体
用 已知细菌或其 Ag检测相应的 Ab及量的多少，作为某些病原菌感染的辅助诊断
急性期和恢复期 双份血清,恢复期效价升高 ≥4倍有诊断价值
局限
难以早期诊断
当抗体水平升高，很难找出抗体效价与病情间关系
方法：玻片或试管凝集试验、沉淀试验、补体结合试验和冷凝集试验细菌感染的实验诊断方法病毒感染的实验室诊断方法
形态学检查
分离培养
病毒在细胞中增殖的鉴定指标
病毒成分的检测
病毒抗体的检测形态学检查
电子显微镜（ electromicroscopy,EM）
免疫电镜法 immunoelectromicroscopy,IEM
光学显微镜
包涵体（ inclusion body）
内基小体（ Negri body）
病毒的分离培养
动物接种
鸡胚培养,9~14日鸡胚
组织培养
器官培养 组织培养 细胞培养细胞培养培养细胞的类型
原代细胞 Primary cell culture
体外分裂 2~3代
二倍体细胞 Diploid cell
保持二倍染色体,50~100代，用于病毒疫苗生产
传代细胞
体外无限分裂的细胞，多是肿瘤细胞
易于传代，多数病毒敏感，但不能用于制备疫苗，
且可能有内源性病毒病毒在细胞增殖的鉴定指标
细胞病变效应（ cytopathic effect,CPE）
红细胞吸附（ hemadsorption）
红细胞凝集（ hemagglutination）
病毒干扰作用（ viral interference）
中和试验（ neutralization test,NT）
细胞病变效应（ CPE）
病毒的定量
TCID50
病毒感染性和毒力的指标是 50%组织细胞感染量（
50% tissue culture infectious dose）
PFU
空斑形成试验（ plaque formation）
每毫升病毒悬液空斑形成单位（ pfu/ml）
用于病毒浓度的精确定量病毒的数量与感染性测定
蚀斑测定：准确滴定病毒感染性的方法
蚀斑（ Plaque），
每个蚀斑是由一个有感染性病毒颗粒形成，
称为 蚀斑形成单位 （ Plaque forming unit，
PFU）。病毒的感染量用 PFU/ml表示
50%感染量（ ID50）或 50%组织细胞感染量（ TCID50）
不能准确地测定感染性病毒颗粒的数量病毒成分的检测
病毒 抗原 的检测
目前常用的技术是荧光标记技术、酶标记技术
（如 enzyme linked immunosorbent assay，
ELISA）或放射免疫标记技术。
病毒 核酸 的检测
基因芯片（ gene chip）
DNA芯片（ DNA chip）或 cDNA微矩阵列（
cDNA Microarray）
病毒抗体的检测
中和试验（ neutralization test,NT）
血凝抑制试验（ hemagglutination inhibition
test,HI）
补体结合试验（ complement fixation,CF）
ELISA法
蛋白印迹技术（ Western blot）
ELISA for HIV antibody
Microplate ELISA for HIV antibody,coloured wells indicate reactivity
病毒感染的实验室诊断方法病毒感染的快速诊断
形态学检查
电镜和免疫电镜
普通光学显微镜：包涵体
检查病毒性抗原
免疫荧光 / 固相放射免疫测定 / 酶免疫技术
检测特异性抗体的快速诊断,IgM
病毒核酸的检测真菌感染的微生物学检查法
直接镜检
皮屑、指（趾）甲和毛发等先用 10%的 KOH处理，然后进行镜检。观察孢子、菌丝或假菌丝。若怀疑新生隐球菌，墨汁负染后镜检，芽生菌体外围绕宽厚荚膜
分离培养
沙保弱培养基（ pH5.6，不适宜细菌生长），常加入放线（菌）酮、青霉素、链霉素或其他抑制性抗生素。
在 25℃ ～ 28℃ 下培养数日至数周，观察菌落特征
可疑深部真菌感染的标本可接种于血平板、肉渣培养基，分别在室温和 37℃ 培养数日至数周
血清学诊断
核酸杂交探针技术小结
细菌感染的微生物学检查法病原体检查 核酸的检测 抗原、抗体的检测
病毒感染的微生物学检查法电镜及免疫电镜 病毒的分离培养和鉴定核酸的检测 抗原、抗体的检测
真菌感染的微生物学检查法直接镜检 真菌的分离培养
