第五章 描述性动物毒性实验 描述性动物毒性实验是指通过对环境有害因素特别是外源化学物的毒理学基础研究，包括一定程序的实验动物选择、实验模型的制作、数量与剂量确定、染毒方法及毒性指标等，观察动物机体所产生的总体毒性效应，通过不断反复的资料积累作出毒理学评价并外推至人类，为防治暴露于环境有害因素的有害作用提出综合性措施的过程。 第一节 急性毒性试验 一、急性毒性 急性毒性(acute toxicity)是指机体(人或实验动物)一次或24h之内多次接触(染毒)外源化学物之后，在短期内所发生的毒性效应，包括引起死亡效应。 实验动物接触外源化学物所引发的急性毒性效应出现的快慢和毒性反应的强度，因外源化学物的性质（主要为化学结构与理化性质）和染毒剂量的大小而有很大差别。有的化学物在实验动物接触致死剂量后，几分钟之内即可产生中毒症状，甚至瞬间死亡，有的化学物则在接触致死剂量几天才出现明显的中毒症状或死亡。 所谓“一次或24内多次”接触或染毒的时间界定：一次是指瞬间染毒，如经口染毒、经注射途径染毒，但在经呼吸道与经皮肤染毒，则是指在一个特定的期间内持续地接触化学物的过程，所以“一次”含有时间因素。当外源化学物毒性过低，或一次染毒剂量受机体容量限制，需给予实验动物较大剂量时，则可在24h内分次染毒，即为“多次”。“短期内”，一般限定为7天内。 二、急性毒性试验的目的和方法 （一）急性毒性试验的目的 急性毒性研究的目的，主要是探求化学物的致死剂量，以初步评估其对人类的可能毒害的危险性。再者是求该化学物的剂量-反应关系，为其它毒性实验打下选择染毒剂量的基础。 （二）实验动物的选择 毒理学中研究外源化学物的基础毒性主要是进行体内试验，即是以实验动物为研究对象，最终向外源化学物毒害主体—-人类外推。虽然在一些国家由于动物保护运动的发展，进行整体动物研究受到一定限制，而促使体外试验的发展，但毕竟用离体组织、细胞、亚细胞器为标本时距整体接触化学物的毒性有差距，所以至今评价外源化学物基本毒性，还是以整体实验动物体内实验为主。 描述性动物实验研究采用的体外试验研究的模型标本包括某些离体脏器、组织切片、原代细胞、传代培养细胞、组织匀浆、亚细胞组分，甚至昆虫、细菌等。不同种属的动物对同一受试物的毒性作用表现可有很大的差别，要获得较可靠的实验结果，一般应选用两种以上的实验动物。常选用大白鼠和小白鼠。根据不同实验目的，可选用不同实验动物。例如，皮肤刺激实验，可选用家兔，因为家兔为皮肤刺激实验的敏感动物。动物应注明来源及品系。除特殊要求外，动物年龄一般选用初成年者：大白鼠、小白鼠为出生后2～3个月左右，体重分别为180～240g和18～24g；家兔为2～2.5kg，猫为1.5～2kg；狗为出生后一年左右。选用的动物体重差异不应超过平均体重的10%。动物的需用数量，大白鼠和小白鼠每组10只以上；较大的动物如狗、家兔等每组不少于3～5只。为判定受试物对不同性别动物的毒性反应有否差异，除特殊要求外，实验中一般均应采用两种性别动物进行试验。所用动物进入实验室后，于实验开始前应观察一周以上，以删除不健康的动物，并使实验动物适应环境。 （三）染毒途径和方式 基础毒性研究，不论是急性、亚慢性与慢性毒性研究，主要是经口、经皮肤及经呼吸道吸入三种染毒途径。 1、经口染毒 ① 灌胃 人工给实验动物灌入外源化学物是经常使用的经口染毒方法。此时外源化学物直接灌入胃内，而不与口腔及食道接触，故而给予的化学物剂量准确。但是，当待测化学物为气态或固体时均需用某种溶剂溶解，液态化学物往往也需用溶剂溶解。 灌胃体积依所用实验动物而定，小鼠一次灌胃体积在0.1～0.5ml/kg体重，大鼠在1.0ml/100g体重之内，家兔在5ml/kg体重之内，狗不超过50ml/10kg体重。 ② 喂饲 喂饲方法染毒是将化学物溶于无害的溶液中拌入饲料或饮用水中，使动物自行摄入含化学物的饲料或水，然后依每日食入的饲料与水在推算动物实际摄入化学物的剂量。 喂饲法的优点是接触化学物的方式符合人类接触污染食物与水的方式,方法简便、易操作。但是由于动物（尤其是啮齿类动物）进食时浪费、损失饲料很多，往往摄入的化学物量不准确，仅适用于动物数量较大的毒理学实验。如果化学物有异味，动物可能拒食，如果化学物在室温下可以挥发，或在饲料中和水中可以水解，则剂量也不准确，且有经呼吸道与皮肤交叉吸收的可能，喂饲法为了计算每只动物摄入化学物的剂量，一般要每只动物单笼饲养。由于此种方法更适宜进行多日染毒，急性毒性试验一般不用之。 ③ 吞咽胶囊 将所需剂量的受试化学物装入药用胶囊内，强制放到动物的舌后咽部迫使其咽下。此法剂量准确，尤其适用于易挥发、易水解和有异臭的化学物。兔、猫及狗等较大动物可用此法。 2、经呼吸道染毒 凡是气态或易挥发的液态化学物均有经呼吸道吸入的可能，在生产过程中形成气溶胶的化学物也可经呼吸道吸入。经呼吸道染毒有两种类型，一是动物自行吸收，一是人工动物气管注入。动物自行吸入呼吸道染毒又分静式吸入染毒与动式吸入染毒两种方法。 静式吸入染毒，即在一定容积的染毒柜内加入一定量受试物造成含一定浓度受试物的空气环境，使受试动物在规定时间内, 经吸入而达到染毒，故适用于短时间染毒的试验使用。 动式吸入染毒，即采用机械通风为动力，连续不断地将含有已知浓度受试物的新鲜空气送入染毒柜内，并排出等量的污染气体，使染毒浓度保持相对稳定，这样可使染毒时间不受染毒柜(室)容积的限制，也可避免动物缺氧、二氧化碳积聚、温度增加等对试验结果的可能影响，故适用于较长时间以及反复染毒的试验使用。 气管注入，将液态或固态外源化学物注入肺内。这是一个手术过程，仅适用于制造化学物对肺脏损伤模型的制备，而不用于一般毒性研究。 3、经皮肤染毒 液态、气态和粉尘状外源化学物均有接触皮肤的机会。外源化学物是否能经皮肤吸收导致机体中毒或仅在皮肤局部引起损伤与外源化学物的性质有关。能经皮肤吸收的化学物主要以扩散方式经过皮肤角质层屏障，在表皮角质细胞的间质中充满非极性的脂类物质。脂溶性化学物主要通过这种途径渗透入皮肤，所以角质层薄的皮肤部位更易吸收。表皮破损、皮肤水化或脱水，以及易于滞留于角质层的化学物，均可增加化学物的渗透。所以，研究外源化学物的经皮吸收时，皮肤接触化学物的面积、时间长短、环境中温、湿度均应控制统一的条件。再者，年龄老的动物表皮厚度改变、细胞成分也有变化，所以应选择成年动物为宜。此外，为保证不因皮肤部位不同而形成的化学物渗透率差异，一般大鼠、豚鼠、兔均使用背部皮肤。面积则依据选用动物及受试物的剂量和剂型而定。如，家兔可取5cm×6cm、豚鼠取3cm×4cm、大鼠取1.5cm～2.0cm直径的面积，小鼠取1.0cm～1.5cm直径的面积。实验前详细检查去毛部位皮肤有无擦伤、红肿、皮疹等异常现象，剔除不合格动物。染毒时按单位体重确定给予所需毒剂的容量，故要求配置成相应浓度的受试物。接触时间应与人实际接触该物质的时间相仿。但在做功能食品和药物的毒理学评价实验时，一般要求受试物接触时间适当延长，保证对人体不受危害。 4、其它途径染毒 有时需对外源化学物进行绝对毒性或比较毒性研究，或进行一些必要的特殊研究(如静脉注射毒物动力学、代谢研究、急救药物筛选等)，往往用注射途径染毒。注射途径包括静脉注射(大鼠、小鼠尾静脉，兔耳缘静脉)、肌肉注射、皮下注射及小动物腹腔注射染毒。但注射时应控制注射体积。 （四）毒性反应的观察与检查 根据急性毒性试验的目的，受试动物给予受试物后，应即刻密切观察各组动物发生的毒性反应（全身的或局部的）情况，中毒症状的特点和出现时间，中毒症状恢复时间，动物发生中毒死亡的时间及死亡数，死亡动物必须的病理解剖检查观察等。急性毒性试验一般不作病理组织学和化验检查，但是有时为了发现某些脏器或靶器官的损害情况，或根据对一些受试物的特殊要求，亦可依据要求选取有代表性的剂量组与对照组进行病理组织学显微镜检查和某些特异性指标的化验检查。 试验的观察期限，如受试动物于接触受试物后24～48h内中毒死亡，未发现有迟发中毒作用时，一般观察7～14d 即可。否则应适当延长观察期限，直到中毒症状基本恢复正常为止，延长观察需要2～4周。观察期限，特别要注意动物的饲养和管理，以防止与受试物无关的意外死亡情况发生。 三、常用指标和毒性分级 （一）急性致死毒性实验常用指标 表示急性致死毒性最常用的指标是LD50，它是经过统计处理计算得出的数值，与LD100、LD0等相比有更高的重现性；而且, 它反映受试群体中大多数动物易感性的平均情况，最后从剂量反应关系曲线上看，它处于曲线上升的中段, 是致死率对剂量变化最敏感的部位。但是，LD50只能表示一种外源化学物引起实验动物死亡一半的剂量(或浓度），即只能表示动物一半死亡，一半存活的剂量点的界限，所以是一个质化反应，而不能代表受试化合物的急性中毒特性，因此，应当注意到只用LD50(LC50)说明一个外源化学物的急性毒性是不够的。有时，根据实际需要还应进行联合毒性实验等其它有关参数，并仔细观察动物的中毒症状。 1、LD50的测定 测定LD50常选用成年小鼠和大鼠两个种属，有时需选用其它种属。无特殊要求，雌雄两性各半。在正式实验前，首先要了解受试化学物的化学结构和理化性质，查阅有关文献，找出与受试化学物化学结构近似或有共性基团化学物的毒性资料，确定预试剂量。预试一般每组4只动物，每次3组，以10倍为组距。根据第一次预试结果判定需要增加还是降低剂量，组距保持不变，直至粗略预测到LD100及LD0为止。正式试验时一般每组10只动物（使用兔或狗等大动物时不少于4～6只），在预测的LD100及LD0之间安排5～7个剂量组，各剂量组间间距应根据受试物毒性大小和预试结果而定，一般以0.65～0.85的等比级数为宜。 LD50值的计算有多种方法，大体上可以归纳为两大类，其一是死亡率—剂量反应相关要求为正态分配的，其中概率单位图解法和寇氏法(Karber)较为常用。另一类是不要求为正态分布的（非正态分布），计算时只查对有关表格即可得到LD50。如何使用这些方法，应当按照受试化学物的具体情况分别对待。这里简要介绍改进寇氏法（Karber）氏法，又称平均致死量法。适于此法的基本条件是，要求每个染毒组实验动物数相同，至少5个实验组，死亡率呈正态分布，最低剂量组死亡率小于20%，最高剂量组死亡率高于80%，所选剂量对数差值相等。该计算公式如下, 首先求出logLD50及其95%的可信限，再求出LD50。 ?  M = Xk – i(Σp – 0.05) Sm = pq  Σ n 式中: m— log LD50, Xk—最高剂量组剂量对数值, p— 死亡率(用小数表示)，Σp— 死亡率总和, q— 1–p, i— 相林两组剂量对数之差, n— 每组动物数， 在实验过程中，应在染毒后的头2～3h内，或在吸入染毒的过程中，仔细观察所出现的症状，并计算1～2周内的死亡数。对于存活动物应于第2周剖杀观察各内脏的病理改变。在引起立即死亡时，则直接观察死亡动物的呼吸器官及消化道，其它它它它它它器官可不作检查。由于中枢神经系统受抑而立即死亡的动物不易在该系统找到病变，故一般不检查神经系统。 2、急性毒性分级 为了粗略表示外源化学物急性毒性的强弱和其对人的潜在危害程度，国际上提出了外源化学物的急性毒性分级（acute toxicity classification）。但分级标准并未完全统一。我国目前除参考使用国际上几种分级标准之外，又于1978年提出了相应的暂行标准。无论我国或国际上急性分级标准都还存在着不少缺点，有待逐步改进。 我国在1991年提出的农药急性毒性分级标准（见表5-1），为四级毒性标准；在1978年对工业毒物提出了一个五级急性毒性分级标准建议（表5-2）。 我国《食品安全性毒理学评价程序和方法》(GB 15193.3-94)颁布的急性毒性（LD50）剂量分级标准见表5-3，WHO推荐的外源化学物急性毒性分级标准见表5-4。 ? 表5-1 农药的急性毒性分级  级 别 大鼠经口LD50（mg/kg） 大鼠经皮LD50（mg/kg·4h） 大鼠吸入LC50（mg/m3）2h  剧 毒 <5 <20 <20 高 毒 5 20 20 中等毒 50～500 200～2000 200～2000 低 毒 >500 >2000 >2000  ? 表5-2 工业毒物急性毒性分级标准  毒性分级 小鼠一次经口LD50（mg/kg） 小鼠吸入2hLC50（ppm） 兔经皮LD50（mg/kg）  剧 毒 <10 <50 <10 高 毒 11～100 51～500 11～50 中等毒 101～1000 501～5000 51～500 低 毒 1001～10000 5001～50000 501～5000 微 毒 >10000 >50000 >5000 ? 表5-3 急性毒性份级（LD50）剂量分级  急性毒性分级 大鼠口服LD50 相当于人的致死剂量  mg/kg mg/kg g/人  极 毒 <1 稍 尝 0.05 剧 毒 1～50 500～4000 0.5 中 等 毒 51～500 4000～30000 5.0 低 毒 501～5000 30000～250000 50.0 实际无毒 5001～15000 250000～500000 500.0  无 毒 >15000 >500000 2500.0 ? 表5-4 WHO推荐的外源化学物急性毒性五级分级标准  大鼠一次经口 6只大鼠吸入4h， 兔经皮LD50 对人可能致死的估剂量  毒性分级 LD50（mg/kg体重） 死亡2～4只的浓度（ppm） （mg/kg体重） g/kg体重 ① （g/60kg体重） ②  剧 毒 <1 <10 <5 <0.05 <0.1 高 毒 1～ 10～ 5～ 0.05～ 3.0 中等毒 50～ 100～ 44～ 0.5～ 30.0 低 毒 500～ 1000～ 350～ 5.0～ 250.0 微 毒 50000～ 10000～ 2180～ >15.0 >1000.0  注： ① 与 ② 大致相差60倍; WHO:（世界卫生组织） ? 总之，从上述表5-1至5-4可见，几种分级标准有相同之处，也有相异之点，都有明确的行业应用对象, 使用时应当特别注意。 3、LD50影响因素及应用 LD50值受试验动物的内外环境各种因素的影响，也受试验人员操作熟练程度和受试化学物的浓度或稀释倍数的影响。因此，比较不同外源化学物的LD50或比较同一个化学物不同实验室所测定的LD50时，要注意试验条件的同一性，剂量概念上应有等效性。即使如此，由于测定一种化学物LD50所使用的试验动物数，只是同一品系整体中的很小部分，而同一品系试验动物中这一群体与另一群体也会有一定的抽样误差。所以同一外源化学物在同一品系动物和同样接触途径所测定的LD50值也会有一定差异，甚至可有2～3倍的波动范围。 LD50虽然是重要的参数，但只能说明某一化学物引起试验动物半数死亡所需的剂量，并不能反映这个化学物引起的中毒特征。有助于补充LD50(LC50)不足的另一参数是化合物的急性毒作用带(acute effect zone，Zac)，一般是指化合物的毒性上限与毒性下限的比值，也就是引起实验动物的死亡剂量与最低毒作用剂量之间的剂量范围的宽窄。急性毒作用带(Zac)通常以LD50(LC50)代表毒性上限，以急性阈剂量(阈浓度)代表毒性下限。其公式为： ? LD50  Zac = 式中：LD50代表毒性上限，Limac 急性阈剂量代表毒性下限。 Limac Zac值的大小可反映急性阈剂量距离LD50的宽窄。Zac值越大表明化合物引起急性死亡的危险性越小，反之表明引起急性死亡的危险性越大。 （二）非致死性急性毒性 为了克服致死性急性毒性只能提供死亡指标这一缺点，非致死性急性毒性的概念显得比较重要，它可提供常规的非致死急性中毒的安全界限和对急性中毒的危险性估计。 1、评价指标及其意义 非致死性急性毒性试验首先要求测定急性毒作用阈（Limac）。毒性效应是一种或多种毒性症状或生理生化指标改变。对于某些生理生化的改变，如体重、体力或酶活性等，Limac是指均值与对照组比较时，其差异有统计学意义的最低剂量。对于对照组也可能出现的某些质效应，则是指其发生率与对照组的差异有统计学意义的最低剂量。无论毒性效应是量效应还是质效应，在Limac及其以上1～2个剂量组中应存在剂量-反应关系。Limac越低，该受检物的急性毒性越大，发生急性中毒的危险性越大。 2、非致死性急性毒性实验设计 非致死性急性毒性实验观察效应很多，首先明确观察效应。如果根据已有资料初步确定了靶器官，则应当观察与该器官损伤有关的特异指标。此外，还可以对体重、体力、行为以及对附加负荷（如化学物、物理因素、脑力与体力负荷等）的耐受性全身性生理状态的改变进行观察。对于这类效应的观察称为整体性指标。 在非致死性急性毒性试验中观察的指标要适当，以免漏去重要的毒性效应或增加不必要的工作量。 剂量设计, 一般是由LD0剂量开始按10倍的比例递减，先安排3～4个剂量对少数动物进行预试。经预试验后，设计3～4个按等比级数安排的剂量，每组10只动物(雌雄各半)进行正式试验。 第二节 蓄积性毒性试验 一、毒物蓄积性的定义及毒理学意义 外源化学物进人机体后，经过代谢转后化以代谢产物或者以未经代谢转化的原形母体化学物排出体外。但是当化学物反复多次染毒动物，而且化学物进入机体的速度或总量超过代谢转化的速度与排出机体的速度或总量时，化学物或其代谢产物就可能在机体内逐渐增加并贮留某些部位。这种现象就称为化学物的蓄积作用(cumulation)，大多数蓄积作用会产生蓄积毒性。 蓄积毒性（cumulative toxicity）是指低于一次中毒剂量的外源化学物，反复与机体接触一定时间后致使机体出现的中毒作用。用于观察研究上述致毒作用过程的实验称为蓄积毒性试验。当外源化学物连续、反复进入机体，而且进入的速度（或总量）超过代谢转化与排出的速度（或总量）时，该物质就有可能在体内积聚而产生蓄积毒性。一种外源化学物在体内蓄积作用的过程，表现为物质蓄积和功能蓄积两个方面。物质蓄积指外源化学物反复进入机体内，在体内的吸收量大于排出量，并在体内逐渐积累的过程，可以用化学方法测得机体内(或某些组织脏器内)存在该化学物母体或其代谢产物，例如重金属铅、汞、锰等，又如DDT代谢物。功能蓄积指不断进入机体的外源化学物，对机体反复作用并引起功能发生改变累积加重，最后导致出现损害作用的过程。功能蓄积往往测不出该物质，如某些有机溶剂、有机磷化合物等。物质蓄积和功能蓄积往往是同时存在又互为基础，在实际工作中常难于严格区别。因此，外源化学物在机体内所产生的蓄积作用是引起亚慢性毒性作用和慢性毒性作用的基础。人们在外源化学物毒理学评定的实际工作中，可根据受试物的蓄积毒性强弱作为评估它的毒性作用指标之一，也是制定卫生标准时选用安全系数大小的重要参考依据。 二、评价毒物蓄积性的方法 （一）蓄积系数法 蓄积系数是指多次染毒使半数动物出现毒性效应的总有效剂量(ED50（n）)与一次染毒的半数有效量（ED50（1））之比值，毒性效应包括死亡。蓄积系数法是以生物效应为指标，用经验系数(K)评价蓄积作用的方法。蓄积系数法的原理是在一定期限内, 以低于致死剂量(＜LD50)的剂量，每日给实验动物染毒，直至出现预计的毒性效应(如半数动物死亡)为止，然后计算蓄积系数(cumulative coe-fficient,Kcum)。半数有效量（media effective dose, ED50）指某一物质使50%的试验动物产生效应的剂量。由此可见，Kcum越小，表示受试物的蓄积毒性越大。Medved于1965年提出的按Kcum大小将蓄积毒性分为四级（5-5）。 ? 表5-5 蓄积毒性分级  Kcum 蓄积毒性强度  ﹤1 高度蓄积 1～ 明显蓄积 3～ 中等蓄积 5～ 轻度蓄积 ? 如果受试化学物在实验动物体内全部蓄积或每次染毒后毒性效应是叠加的，则LD50 (n)应相等于ED50时，即K＝l。如果反复染毒实验动物对受试化学物发生过敏现象，则可能出现K值＜1。若化学物产生部分蓄积，则K＞l。 虽然蓄积系数法评价化学物的蓄积作用有一定的使用价值，但是利用蓄积系数评价外源化学物潜在的慢性毒性还是应当慎重的。因为有些外源化学物的慢性毒性效应与系数K值是不一致的。例如有的化学物反复接触后引起免疫毒性，但其K值不一定很小。又如有机磷化合物往往K值很大，但是它的申枢神经系统的慢性危害与非胆碱能的毒性却仍表现出慢性毒性效应。再如丙烯腈的蓄积系数在小鼠K＞l2.8，但依然存在慢性危害。 蓄积系数法具体试验方案主要有以下两种。 1、固定剂量法：取大鼠或小鼠，以灌胃或腹腔注射给予受试化学物。先求其LD50，再以相同条件将40只或以上动物，雌雄各半，均分两组，一为染毒组，一为对照组。对受试动物按1/10～1/20 ED50（1）（LD50（1））的固定剂量，连续每天进行染毒一次，观察记录受试动物出现的某种毒性效应或反应情况，当染毒剂量累计达到相当5倍ED50（1）或LD50（1）以上时，若受试动物中出现某种毒性效应或死亡动物数未超过半数，此时的蓄积系数已大于5，表明该受试物的蓄积毒性作用不明显。如果染毒过程中受试物中相继出现某种毒性效应或死亡的动物数累计达到50%，此时算出受试物累计的染毒总剂量，按上述公式即可计算出受试物的蓄积毒性系数。 2、递增剂量法：此方案基本同上。以4d为一期，开始第一期每天染毒剂量为1/10 ED50或LD50，随后染毒剂量每隔4d按1.5倍递增一次，如表5-6所示。 表5-6 定期递增染毒剂量*表 染毒日期（天） 每日染毒剂量 每4天染毒总剂量 累计染毒总剂量  1～4 0.10 0.4 0.4 5～8 0.15 0.6 1.0 9～12 0.22 0.9 1.9 13～16 0.34 1.4 3.3 17～20 0.50 2.0 5.3  注：表中的递增染毒剂量*为×ED50或LD50 如果连续染毒已达20d，此时染毒的总剂量已累计达到5.30倍的ED50或LD50，受试动物中出现某种毒性效应或死亡的动物数未达到50%，则表示该受试物的蓄积毒性不明显，试验可以终止。如受试物在试验过程中，相继出现的某种毒性效应或死亡的动物数累积达到50%，即可计算出蓄积系数并可对蓄积毒性强度作出评估。 （二）生物半减期法 生物半减期（biological half time，简称T1/2）指进入机体的外来化学物质通过机体的生物转运和转化作用过程而被消除一半所需要的时间。生物半减期法是用毒物动力学原理来描述外源化学物的体内蓄积作用。外源化学物在机体内蓄积的速度和量与单位时间内机体对受试化学物的吸收速度、清除速度有关。任何一个化学物如果以相等的时间间距恒速地吸收入血，则化学物在低于致死剂量范围内在机体的蓄积不是直线地无限地增加，而是呈曲线型增加且有极限。因为化学物吸收进人机体的瞬间存在着化学物在体内的代谢转化过程与清除过程(包括血液中化学物向组织脏器的分配过程)。当化学物的吸收速率与代谢转化速率和清除速率达到平衡时，化学物的蓄积量就不再增加。外源化学物在体内生物半减期越长，表示越不易由体内消除，因而它在体内的蓄积作用就越大。 测定外源化学物在体内生物半减期的过程较为复杂，在实际观测中，常常仅以间接测定它们在血液、尿液或器官组织中的浓度（或量）降低一半所需的时间，来代表该物质的生物半减期。通常的方法是机体接触受试物后，在一定时间的间隔内，分别测定血液或尿液、器官组织中该物质的浓度（或量），依据所得结果按下式求出它的生物半减期。 生物半减期（T1/2）=（t2﹣t1）log2 /（log y1﹣log y2） 式中：y1和y2—分别为给受试物后在t1和t2时间取样测定的该物质的含量。根据测定生物半减期的长短，判定受试物的蓄积毒性大小。 （三）蓄积率测定法 蓄积率(cumulative percent)测定法，常用的动物为小鼠或大鼠。首先将受试动物分成蓄积和对照两大组，每组60～70只。蓄积组动物每次按一定剂量(低于最小致死量)按同一给毒途径预先给受试物，经过一定时间之后，按常规方法测定蓄积组和对照组的LD50，并按下式计算蓄积率: 蓄积率=（对照组LD50 - 蓄积组LD50）/ 蓄积组预给受试物的总剂量 × 100% 蓄积率应标明预先给受试物的时间及剂量，在相同时间及剂量条件下，蓄积率越大则表示该物质在体内的蓄积作用越强 ，反之则越弱。 第三节 亚急性、亚慢性和慢性毒性试验 通常情况下，人类对生活和生产和军事环境中的有害化学和生物因素接触水平较低，不至于发生急性中毒，却在长期反复接触中发生慢性中毒。另外，虽有些化学物测不出急性毒性或急性毒性极低，但却有慢性毒性。因此，查明化学物的亚慢性毒性与慢性毒性就显得十分重要。 一、基本概念 亚慢性毒性(也称亚急性毒性)指机体在相当于1/20左右生命期间，少量反复接触某种有害化学和生物因素所引起的损害作用。研究受试动物在其1/20左右生命时间的，少量反复接触受试物后所致损害作用的实验，称亚慢性毒性试验(subchronic toxicity test)或亚急性毒性试验(subacute toxicity test），亦称短期毒性试验(short term toxicity test)。所谓“少量”是相对的，没有明确的剂量范围的下限；但是剂量上限应小于相应的LD50值。在接触过程中，要求每次（日）接触的剂量一般相等。以大鼠为例，平均寿命为两年，即24个月，因此，亚慢性毒作用试验的接触期为1～2个月左右，试验目的是在急性毒性试验的基础上，进一步观察受试物对机体的主要毒性作用及毒作用的靶器官，并对最大无作用剂量及中毒阈剂量作出初步确定。此外，亚慢性毒性试验的结果，也可为慢性试验设计选定最适观测指标及剂量提供直接的参考。有时通过急性毒性试验和参考其它有关资料，已基本掌握受试物欲弄清的亚慢性毒性损害情况，则可省略亚慢性毒性试验而直接进行慢性毒性试验。 慢性毒性是指外源化学物质长时间（大于1/10生命期）少量反复作用于机体后所引起的损害作用。研究受试动物长时间少量反复接触受试物后，所致损害作用的试验称慢性毒性试验(chronic toxicity test），亦称长期毒性试验(long term toxicity test)。慢性毒性试验中，试验动物接触外源化学物的期限，依试验要求和试验动物种类而定。原则上, 要求试验动物生命的大部分时间或终生长期接触受试物。各种试验动物寿命长短不同，慢性毒性试验的期限也不相同。在使用大鼠或小鼠时，工业毒理学中一般要求慢性毒性试验进行6个月，而环境毒理学和食品毒理学一般要求接触1～2年。 考虑到试验动物寿命长短不同，而不同长短的接触期折合为相当于人类的接触期就会有很大的差异。表5-7将各种动物的不同接触期折合为其生命周期的百分数和相当于人类寿命的时间（按大鼠平均寿命2年、兔6年、狗10年、猴15年、人类平均寿命70岁计算），可为慢性毒性试验提供参考。表5-7列出了各种试验动物不同接触期限折合生命周期的百分数和相当人类寿命的时间。 慢性毒性试验的主要目的是确定化学物毒性下限，即确定机体长期接触该化学物造成机体受损害的最小作用剂量(阈剂量)和对机体无害的最大无作用剂量。为制定外源化学物的人类接触安全限量标准提供毒理学依据。如最大容许浓度，每日容许摄入量（acceptable daily intake，简称ADI，以mg/kg体重d表示）等。 二、毒性参数 (一)阈值 (threshold) 在亚慢性与慢性毒性试验中，阈值是指在亚慢性或慢性染毒期间和染毒终止，实验动物开始出现某项观察指标或实验动物开始出现可察觉的轻微变化时的最低染毒剂量。 ? 表5-7 试验动物接触期限的推算 接触期限 大 鼠 兔 狗 猴 相当寿命 相当于人 相当寿命 相当于人 相当寿命 相当于人 相当寿命 相当于人  月 （%） （%） （%） （%） （%） （%） （%） （%） 1 4.1 34 1.5 12 0.82 6.5 0.55 4.5 2 8.2 67 3.0 24 1.6 13.4 1.1 9.0 3 12.0 101 4.5 36 2.5 20.0 1.6 13.0 6 25.0 202 9.0 72 4.9 40.0 3.3 27.0 12 49.0 404 18.0 145 9.8 81.0 6.6 53.0 24 99.0 808 36.0 289 20.0 162.0 13.0 107.0  (二)最大耐受剂量 (MTD) 在亚慢性或慢性试验条件下，在此剂量下实验动物无死亡，且无任何可察觉的中毒症状；但是实验动物可以出现体重下降，不过其体重下降的幅度不超过同期对照组体重的10%的最大剂量。最大耐受量在概念上与急性最大耐受量有所区别。 (三)慢性毒作用带(chronic effect zone，Zch)) 以急性毒性阈值(Limac)与慢性毒性阈值(Limch)比值表示外源化学物慢性中毒的可能性大小。比值越大表明越易于发生慢性毒害。 三、实验设计的原则 (一)试验动物 亚慢性试验、慢性试验首先要考虑对受试物敏感的动物种属和品系，同时要考虑急性毒性试验选用的动物一致。此外，也应考虑到被选用的动物供应方便，价格适中，易于饲养管理。最常用的动物有大鼠、小白鼠、狗和家兔，其次猫、琢鼠、猴等亦可供使用。一般要求选择两种试验动物，啮齿类和非啮齿类各一种，以便于更全面地了解受试物的毒性作用。目前对啮齿类动物首选大鼠，非啮齿类动物是狗与灵长类。最好慢性试验使用的实验动物与亚慢性试验动物相同，有利于研究的连续性。 选择每组实验动物的数量，不但应当最低限度满足对试验结果进行统计分析上的要求，也与选用的动物种属和试验目的要求有关。如使用啮齿类动物的数量需多些，因试验持续时间较长，试验期间往往会产生与毒物无关的意外死亡，需较多的动物才能保证在试验结束时仍有足够数量(不少于10只)存活的动物供观测；通常试验要观察毒性作用的进展情况和恢复情况，于试验的不同阶段要宰杀部分动物作观测，需要较多数量的动物。3个月以内的毒性试验每组动物数:大鼠和小鼠分别为20只；大动物(如家兔、狗、猴等)4～6只。3个月以上的毒性试验每组动物数:大鼠和小鼠分别为40～60只；大动物8～12只。试验动物的性别一般要求雌雄各半。长期毒性试验，应选用年幼、初断奶的动物作为试验对象。如大白鼠为出生后4周，体重在60～80g，小白鼠为出生后3周，体重在10～12g，家兔的体重为2kg,猫的体重在1～2kg,狗的体重应在6～8kg左右。短期毒性试验可适当延长动物年龄。使用幼年的动物，一方面是便于在发育较快的时间内利于观察受试动物是否对生长发育有影响，另一方面也可使动物摄入受试物的时间得到充分延长，以满足本试验要求的染毒时间。试验期间，动物最好采用单笼饲养，且要求各组动物饲养条件(笼子、温度、光照、饲料等)严格一致。 (二)试验分组及剂量选择 亚慢性毒性试验和慢性毒理试验均设对照组。亚慢性毒性试验设3～4个剂量组，剂量范围很难统一规定,一般认为上限应控制在试验动物在接触受试物的整个过程中,不发生死亡，或仅有少数或个别死亡，同时能引起较为明显的中毒症状，或靶器官出现一定程度的典型损伤。例如某些生物化学的改变、生理学或病理组织学改变等。实际工作中常以急性毒性的阈剂量为亚慢性毒性试验的最高剂量，或者以受试物的急性LD50值的1/10～1/5为最高剂量。最低剂量组动物应不出现毒性反应，接近亚慢性阈剂量水平，中间设1～2个剂量组，动物出现轻微但较明显的中毒效应。各剂量组间的剂量至少应相差两倍或两倍以上。一般以LD50的1/5～1/100范围内来考虑剂量分组。 慢性毒性试验设4～5个剂量组。剂量选择可依据两个途径。一个是以亚慢性毒性效应的1/5～1阈剂量为慢性毒性试验的最高剂量，以亚慢性毒性效应的1/50～1/10阈剂量为预计慢性阈剂量，以其1/100为最低剂量，在最高剂量与预计慢性阈剂量之间再加1～2个剂量组，另一途径是以急性毒性效应为出发点，以LD50 (或LC50)为基础，以l/10 LD50为最高剂量，以1/100LD50为预计慢性阈剂量，以1/1000 LD50为最低剂量。在1/10 LD50与1/100 LD50之间再加1～2个剂量组。 (三)接触途径 自然摄入。但是如受试物有异味或易水解时，也可以用灌胃方式。为了保证给受试物的精确度，目前一般采用灌胃法，每日灌胃应当定时进行。经呼吸道吸入，每日吸入期时间的长短依试验要求而定。对工业毒物进行慢性毒性试验时，通常要求每日吸入4～6h。环境污染物一般要求每日吸入8h，甚至24h。 经皮肤接触。一定要注意在每日固定的时间内给相同的量。另外，根据人类接触受试物的实际途径，还可采用皮下、肌肉、静脉、腹腔注射等，这些方法均可保证给予受试物较精确的量。受试物最好是每周7d连续给予，如试验期超过3个月时也可采用每周给6d。每天给受试物时间相同。 四、指标观察与测量 有害环境因素特别是外来化学物引起机体的损害作用是多方面的，而且又可能具有一定的特异性，因此，合理选择试验观察指标和检测方法显得特别重要。观察指标的选择，主要包括下列几点。 (一)一般状况指标的观察 1、中毒症状的观察 中毒症状不仅能反映受试物对全身的作用，而且也可能同时从现象上揭示受试物对机体主要受累的系统和器官作用的选择性。动物的中毒症状，一般只能从观察其行为改变和客观征象的异常来作判断。 2、体重测量 动物在生长发育期体重的增长情况，是综合反映动物全身健康状况的最基本指标之一，测量动物体重简单易行。亚慢性试验 (包括慢性试验) 应重视对实验动物的体重观察。它是非特异性的、反映动物机体中毒效应的综合性指标。实验动物体重增加的抑制或减轻是受多种毒性效应影响的，包括食欲、食物吸收、消化功能、代谢和能量消耗的变化等。如果各试验组体重增长抑制呈剂量一效应关系，则可以肯定，这是一种综合毒性效应。一般来说，实验开始的第1～3个月，每周称量一次体重，以后可每2～4周称量一次。动物的体重在一天内不同时间有一定差异，一般选在上午同一时间内称重。 3、水和食物摄入量的观测 有些化学物会影响动物的饮水量与进食量。在分析评价进食量的影响时，通常是根据进食量和体重增长值来计算出食物利用率（即动物每摄入100g饲料所增长的体重克数）并进行比较。比较染毒组与对照组食物利用率，有助于了解受试化学物的毒性效应。如染毒化学物影响动物食欲，则每日进食量减少，体重增长减慢，但食物利用率不一定有改变。若染毒化学物干扰了食物的吸收或代谢，此时食欲不一定受影响，而体重增长减慢，则食物利用率也发生变化。例如给大鼠喂饲被溴甲烷熏蒸过的饲料两个月，喂饲组与对照组的食物利用率大致相等 (分别为25.2与25.6)，但试验组体重仅相当对照组平均体重的86.6%，说明被溴甲烷熏蒸过的饲料基本上不影响食物的吸收利用，但可能影响了大鼠的食欲。 (二)生物化学指标的观测 根据生化指标显示的功能变化,不仅可发现受试物作用的器官和系统，为病理学检查提供线索, 也可为阐明受试物毒作用机制提供依据。由于生物化学指标繁多, 在试验观测时，必须依据受试物可能产生的毒性作用，有目的地加以选择。 1、肝脏功能 肝脏是外源化学物在体内进行生物转化的主要器官，外源化学物的亚慢性和慢性毒作用引起肝脏损害时会在血清中出现一系列相关酶的变化。如谷丙转氨酶多发生在实验的初期，碱性磷酸酶改变多发生于实验的中期或后期。与肝脏功能有关的指标有: 天门冬氨酸基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT)、碱性磷酸酶（ALP)、总蛋白（TP)、白蛋白（ALB)、血糖（GLU)、总胆红素（T-BIL)、总胆固醇（T-CHO)等。 2、肾脏功能 肾脏是外源化学物及代谢产物的主要排泄器官，通过肾功能生化指标的检测可大致了解化学物对肾功能的影响。肾脏的生化检查,目前尚缺乏早期、灵敏的指标。现常用的指标有血清尿素氮(BUN)、血清非蛋白氮(NPN)和肌酐(Crea)等。 3、血液学指标的检测 可按临床常规方法进行，主要检测指标有: 红细胞计数或网织红细胞、血红蛋白(Hb)、白细胞总数及其分类、血小板、凝血时间。 4、生物材料中受试物及其代谢产物的检测 可供检测的生物材料样品,一般包括血液、尿液、粪、毛发、呼气及各种器官组织。除器官和组织样品外，其它样品均可自整体动物反复采样进行动态观测。采取受试动物的生物材料，检测其中受试物及其代谢产物的含量情况，对了解受试物进入体内的生物转运和转化过程，明确受试物对机体作用的靶器官和靶组织，探讨受试物毒作用机理等有重要意义。 (三)病理学检查 1、系统尸解 首先应当注意肉眼观察，特别注意联系中毒表现以及与受试物直接接触的器官和解毒、排泄器官如消化道、肺、肝、肾、淋巴腺、眼、皮肤等，记录有无肉眼可见的异常变化，系统尸解应全面细致，为组织学检查提供依据。 2、脏器系数 是指某个脏器与单位体重之比值或称脏/体比值。单位体重通常以100 g体重计, 如肝/体比，即指 (全肝湿重/体重)×100。这个指标是一个经济的、实用的指标，往往能提供受试化学物靶器官的重要线索。其依据是实验动物在到达成年末期或老年期之前, 尤其是小动物均随着年龄的增加体重增长, 且各脏器与体重之间的重量比值有一定规律。若某脏器受到受试化学物损害, 此比值将发生改变。一般包括心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、甲状腺、睾丸、子宫、脑、前列腺等。在排除称重前的失水、年龄、性别、营养不良等因素的影响后, 脏器系统增大, 表示脏器充血、水肿或增生肥大性变化等；脏器系数减小, 表示脏器萎缩、退行性变化等。脏器系数的观测可依据实验要求加以选用。 但使用脏/体比值指标时应注意排除假象。如果受试化学物在试验期间明显抑制动物体重增长，虽然某脏器没有受到明显损伤，则也会出现脏/体比值增大。故此时应同时比较试验组与对照组动物各脏器的绝对湿重,进行校正。再者，需注意摘取动物脏器后，在称重前应洗去脏器表面的血污，且用滤纸吸千表面水分，再精确称重，但是同时要防止脏器风干、失水。 3、组织学检查 在试验期间死亡和濒死的动物需及时作病理组织学检查，对照组和高剂量组的动物及尸检异常者要详尽检查，其它剂量组在高剂量有异常性改变时才进行检查。必要时选择脏器做组织化学或电镜检查, 其中包括：肾上腺、胰腺、胃、十二指肠、回肠、结肠、垂体、前列腺、脑、脊髓、心、脾、胸骨(骨和骨髓)、肾、肝脏、肺、淋巴结、膀胱、子宫、卵巢、甲状腺、胸腺、睾丸(连附睾)、视神经等。其它指标和器官组织应根据受试物的用途和作用特点，必要时增删相应指标。 (四)分子生物学和免疫学指标的测定 分子生物学和分子免疫学的快速发展，相继发现了许多具有毒理学意义的指标，如，很多环境有害因素可导致活性氧增加，造成细胞膜、蛋白质（包括酶）和核酸的损伤，其中有些或为非遗传性损伤，或为致死性损伤，或发生细胞凋亡，或引起免疫功能异常。选择相关指标进行测定，有利于深入探讨有害作用的机理和安全性评价，也有利于提出有效的防护措施。 （五）检测指标的时间 试验期在3个月以内时，在最后一次给药24h后和恢复期结束时进行相关指标的检测,主要包括生物化学、组织病理学和分子生物学和免疫学指标及某些特异性指标的测定；试验大于3个月时，可在试验中间按动物比例数活杀少量动物(高剂量组和对照组)，检测指标。 (六)恢复期观察 最后一次给受试物后每次取2/3动物检测各项指标，留下1/3动物继续观察2～4周，再活杀检查，了解毒性反应的可逆程度和可能出现的延迟性毒性反应。在此期间, 除不给受试物外，其它观察内容与给受试物期相同。 五、各国测试标准比较 亚慢性毒性试验、慢性毒性试验测试标准并未完全统一，各国都有自己的标准，但大体上比较一致。表5-8 列出了几个国家的大鼠经口亚慢性毒性试验的测试标准。从表中分析，选用动物数方面，FDA和中国每组为20只，其余为10只。除EPA外，一般均在实验结束时做血液和临床生化分析。一般不做尿液分析，组织器官病理检查大致相同。从表5-8可看出，中国的测试标准与美国FDA的测试标准较为接近。 第四节 评价联合毒性的方法 联合毒性(joint action或combined effect)指两种或两种以上毒物同时或前后相继作用于机体而产生的毒性作用，已在第四章阐述。评价多种化学物的联合作用类型时，常用的方法如下。 (一)联合作用系数法  系数(K)是先求出各化学物各自的LD50，假定各化学物的联合作用是相加作用，则可得公式： 1 fA fB fN  LD50M LD50A LD50B LD50N 式中,fA、fB……fN分别为A、B、……N化学物混合的比例,以小数表示, 即： fA十fB十…… 十fN＝l；LD50A、LD50B……LD50N；LD50M分别为A、B、……N 化学物及混合化学物预期LD50。 表5-8 大鼠经口亚慢性毒性试验测试标准比较 项目 EPA OECD FDA 英国 日本 中国 动物年龄（周） ＜6 ＜8 ＜6 ＜6 成年 6～8 最短实验时间（d） 90 90 90 90 30～90 ＜90 最少试验组数 3 3 3 3 3 3 空白对照 Y Y Y Y Y Y 赋形剂对照 Y Y Y Y Y Y 给药途径 喂饲 Y Y Y Y Y NS 灌胃 Y Y Y Y Y Y 胶囊吞咽 Y Y Y Y Y NS 饮水 Y Y Y Y Y NS 每组动物数（不包括中期杀死） 10 10 20 10 10 20 每周记录体重 Y Y Y Y Y Y 每周食物消耗 Y Y Y Y Y Y 高剂量允许死亡率 ＜10% NS NS NS NS NS 血液和临床生化 试验前 Y N N N N N 每月 Y N N N N N 试验中期 Y N N N N N 试验结束 Y Y Y Y Y Y 采血最少动物数 NS NS 10 NS NS 15 尿液分析 N N N N Y(末期) N 器官称重（终期） 肝 Y Y Y Y Y Y 肾 Y Y Y Y Y Y 心 N N N N Y Y 性腺 Y Y Y Y Y Y 脑 Y N N N Y Y 肾上腺 N Y Y Y Y Y 大体尸检（所有动物组织、 Y Y Y Y Y Y 高、中、低剂量） 肝 Y N Y Y Y Y 肾 Y N Y Y Y Y 心 Y N Y N Y Y 较大病灶 Y Y Y Y Y Y 靶器官 Y Y NS Y Y Y 肺 Y Y NS Y Y Y 注：NS：不一定；Y：必要；N：不必要；EPA：美国环境保护局；OECD：经济合作发展组织；FDA：美国食品与药品管理局。 通过动物试验测定混合物的LD50，再求出混合物的预期LD50与实测混合物LD50的比值，此比值即为K值。如果各化学物是相加作用，则理论K值应等于1，但由于测定LD50本身会有一定波动，所以K值也会有一定波动(K＝l±)。一般认为K值在0.4～2.5之间表示相加作用；＜0.4表示拮抗作用；＞2.5表示协同作用。 (二)等效应线图法 这种方法只能评定两个化学物的联合作用，具体步骤如下。 1、在同种试验动物和相同接触途径条件下, 分别算出两种化学物(A和B)的LD50及其95%可信限，以纵座标表示化学物A的剂量范围，以横座标表示化学物B的剂量范围，分别将两种化学物在纵座标与横座标上的LD50值及95%可信限的上下限值连成三条直线。 2、以等效应剂量求出两个化学物混合后的LD50值。 3、根据混合LD50，求出两个化学物各含的实际剂量，分别在相应的座标线上找到各自的剂量位置，并由相应剂量点作垂直线，视其交点所落的位置进行评定。 4、如交点正好落在两个化学物95%可信限的上下两条线之间，表示为相加作用。如交点落到95%可信限下限以下，则表示为协同作用。如交点在95%可信限上限直线以外，则表示拮抗作用。 ? mg/kg A 上限 化 LD50 拮抗 合 相加 物 下限 协同 下限 LD50 上限 B 化合物 mg/kg 联合作用等效曲线图 ? ?  ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 多种化学物对机体的联合毒性作用是相当复杂的，其作用机制尚未完全阐明，试验方法也需进一步完善，其实际意义极为重要。