第八章 环境有害因素致畸作用 生殖发育是哺乳动物衍繁种族的正常生理过程，其中包括生殖细胞(即精子和卵细胞)发生、卵细胞受精、着床(imbed，或称植入implantation)、胚胎形成、胚胎发育、器官发生(organogenesis）、分娩和哺乳过程。生殖发育也可称为繁殖过程(reproduction)。外源化学物或其它环镜因素与机体接触后，可干扰生殖发育任何环节，并造成损害作用。外源化学物对生殖发育的影响：①生殖发育过程较为敏感，②对生殖发育过程影响的范围广泛和深远。近年来随着毒理学和生命科学的深入发展，外源化学物对生殖发育损害作用的研究又进一步分为两个方面：①对生殖过程的影响，即生殖毒性(reproductive toxicity)的探讨，②对发育过程的影响, 即发育毒性(developmental toxicity)研究。两个方面都逐渐发展成为毒理学的分支科学；前者称为生殖毒理学(reproductive toxicology)，后者称为发育毒理学(developmental toxicology）。 生殖毒理学主要涉及外源化学物对生殖细胞发生、卵细胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳过程的损害作用及其评定，评定方法即为生殖毒性试验。发育毒理学主要研究环境有害因素对胚胎发育以及出生幼仔发育的影响及其评定，评定方法称为发育毒性试验。其中主要为致畸试验。文献中也有人将生殖毒性以及生殖毒理学和发育毒性以及发育毒理学统称为繁殖毒性和繁殖毒理学。本章将对发育毒性着重进行讨论。 第一节 基本概念 －、发育毒性 某些化合物可具有干扰胚胎的发育过程，影响正常的发育作用，即发育毒性。发育毒性的具体表现可分为：1、生长迟缓(growth retardation)，即胚胎的发育过程在有害环境因素影响下，较正常的发育过程缓慢。2、致畸作用(teratogenicity)，由于外源化学物的干扰，胎儿出生时，某种器官表现形态结构异常。致畸作用所表现的形态结构异常，在出生后立即可被发现。3、功能不全和异常，即胎仔的生化、生理、代谢、免疫、神经活动及行为的缺陷或异常。大多在出生后一定时间才被发现，因为正常情况下，有些功能在出生后一定时间才发育完全。4、胚胎致死作用(embryolethality)，某些外源化学物在一定的剂量范围内、可在胚胎发育期间对胚胎具有损害作用，并使其死亡。具体表现为自然流产或死产，死胎率增加。在一般情况下，引起胚胎死亡的剂量较致畸作用的剂量为高，而造成发育迟缓的剂量往往低于胚胎毒性作用的剂量，但高于致畸作用的剂量。以上四种发育毒性的具体表现并非一定在一种外源化学物作用下同时出现，有时只出现其中的一种或一部分。此外有些外源化学物通过胎盘与发育中的胚胎接触还可引起子代肿瘤发生率增高。 致畸作用在外源化学物发育毒性具体表现中，对存活后代机体影响较为严重，往往是一种不可逆过程，具有重要的毒理学意义，有些文献中，将致畸作用称为发育毒性，可以理解为发育毒性的狭义概念。发育毒性以及致畸作用是有害环境因素对机体损害作用的一种表现。 二、畸形、畸胎和致畸物 器官形态结构的异常称为畸形（malformation）。胎儿出生时即具有整个身体或某一部分的外形或器官的解剖学上的形态结构异常称为先天畸形（congenital malformation）畸形的胚胎，称为畸胎（terate）。凡在一定剂量下，能通过母体对胚胎正常发育过程造成干扰，使子代出生后具有畸形的化合物称为致畸物（teratogen）或致畸原。评定外源化学物是否具有致畸作用的试验，称为致畸试验。 三、胚胎毒性作用 胚胎毒性作用（embryotoxicity）一般公认的概念系指外源化学物引起胎仔生长发育迟缓和功能陷缺不全的损害作用。其中不包括致畸和胚胎致死作用。文献中也有将生长发育迟缓、功能缺陷不全和胚胎致死统称为胚胎毒性者；并有将外源化学物引起的胎仔形态结构异常，即致畸作用称为胚胎毒性者。 四、母体毒性作用 母体毒性（matermal toxicity）作用是指有害环境因素在一定剂量下，对受孕母体产生的损害作用，具体表现包括体重减轻、出现某些临床症状，直至死亡。进一步的概念，可分为轻度和严重母体中毒。轻度母体中毒的表现应限于母体体重下降、正常增长受到抑制，被抑制的程度不超过接触受试物对照组动物的10%。肝重可略有增加，但生殖机能正常。严重者可出现体重增长大幅度抑制、持久性呕吐、过度安静或活动过度、呼吸窘迫、生育机能明显受损及其它中毒症状，甚至死亡。 由于有害环境因素的致畸作用和母体毒性作用部分与受孕母体有关，而且往往二者同时出现，所以应该特别重视母体毒性作用与致畸作用的关系。母体毒性与致畸作用的关系有下列几种情况： 1、具有致畸作用,但无母体毒性出现,此种受试物致畸作用往往较强，应予特别注意。 2、出现致畸作用的同时也表现出母体毒性。此种受试物可能既对胚胎有特定的致畸机理，同时也对母体具有损害作用，但二者并无直接联系。 3、不具有特定致畸作用机理，但可破坏母体正常生理稳态，以致对胚胎具有非特异性的影响，并造成畸形。 4、仅具有母体毒性，但不具有致畸作用。 5、在一定剂量下，既不出现母体毒性，也未见致畸作用。此种情况较为复杂，在实际工作中应特别认真对待。在未表现致畸作用情况下，是否具有母体毒性极为重要。实际有两种可能；一种是受试初确实不具有致畸作用，而且也不具有母体毒性；另一种情况是动物接触的剂量未达到致畸作用的最小有作用剂量，即致畸阈剂量，并非真正不具有致畸作用。严格的概念，在一定剂量下，能引起母体毒性作用，但未观察到致畸作用，才可以认为不具致畸作用。母体毒性与致畸作用的剂量关系之间，并无固定比值；一般情况下，致畸作用剂量较母体毒性作用剂量为低。 五、畸形与变异 在胚胎出现的器官形态结构异常，有些对子代机体的生命存在威胁，例如露脑、无脑等可以称为严重畸形(major malformation）。另外，有些对生命并无危害如唇裂、缺趾等，可称为轻度畸形(minor malformation）。与畸形可能同时出现的还有变异。机体的形态结构或生理功能，在同一物种的子代与亲代或子代的个体之间，有时出现较大差异的现象，即为变异(variation)。一般认为, 某些变异并不影响正常生理功能，更不危及生命。变异是生命的一种特征，在生物学上具有适应与进化的意义，变异并非畸形，但有时与畸形难于严格区分。一般情况下，变异出现率较低，而且不呈现剂量与效应或反应关系。但是在致畸试验中，如果某种变异出现较多，而且呈现一定剂量效应或反应关系，即使不作为畸形，也应另行记录，并在试验结果评定时，作具体分析。 第二节 致畸作用的机理 有很多因素可以诱发畸形，例如辐射能和某些病毒感染都具有致畸作用，但主要是化学因素，即某些外源化学物。人类对外源化学物致畸作用的认识和研究，虽然已有30年以上历史。但关于其确切机理尚待阐明，未能形成系统化理论。 一、先天畸形的发生方式 受精卵中含有构件个体的全部信息，发育涉及储存在DNA内遗传信息的逐步表达，由此产生各种细胞、组织的分化，各具不同的代谢、形态结构和功能。这一过程由许多不同的调节机制控制，同时也受环境因素以及邻近组织诱导作用的影响。这一过程都是很严格地进行的，若其中一个环节受到干扰，均可导致畸形。有学者把发生畸形方式归纳如下： 1、不发育(agenesis) 由于某些重要的原基组织(primordial tissue)不存在或缺乏邻近组织或前体组织的正常诱导而使原基组织不发生，结果某个器官或躯体部分发生或完全缺如。 2、发育不全(hypoplasia) 这种畸形常在名词前冠以“小”字，如小头、小眼等。此外，亦有软骨发育不全等。 3、发育受阻 某器官或结构发育至半途时受阻而停止，可分为四类： ①不合并(non-fusion）；②不分裂(non-division），如动脉干永存；③抑制迁移(sup-pressed migration）；④暂时性结构的保存(persistence of transitory structure），如肛门闭锁、憩室等。 4、相邻原基粘连 如马蹄肾，或原基分裂，如分裂输尿管。 5、生长过度（overgrowth） 如多指、巨指或先天性角化过度等。 6、错位（misplacement） 如内脏错位等。 7、错误迁移（incorrect migration） 如卵巢迁移到外生殖器，并耳等。 8、不典型分化(atypical differentiation） 包括先天性肿瘤的形成、异位和分化。 9、返祖（atavism） 常见的有多毛、复乳等。 二、畸形的引发机制 关于其确切机理尚待阐明，尚未能系统化，现归纳如下： 1、基因突变和染色体畸变，有些外来出合物作用于生殖细胞或体细胞，都可诱发基因突变和染色体畸变，以致DNA的结构和功能受损，造成胚胎正常发有障碍，出现畸形,并具有遗传性。特别是在常规的致畸试验中，胚胎与受试物接触，已进入器官发生期。仅只能作用于体细胞，与生殖细胞无关。 但对此也有不同的意见。有人观察到发生染色体畸变的细胞，与透过胎盘的外源化学物接触后，一般24h内已消失。即使存在稳定的畸变，如小缺失(small deletion)、倒位(inversion)、和相互易位（reciprocal translocation）等，经过几个细胞分裂周期也不再存在，所以认为染色体畸变或突变可能并非致畸的直接原因。可能是由于外源化学物对胚胎组织中DNA损害引起的DNA合成减少。 2、核酸复制转录及细胞有丝分裂过程受到干扰，也可引起畸变。 3、细胞内必需的能量和前体物(precursor)供应不足或代谢过程受到干扰。母体中维生素和无机盐营养失调、低血糖、缺氧等都可造成畸形。由于胚胎组织增值速度极快，在短时间内需要消耗大量代谢能量，当能量代谢环节，例如三羧酸循环受到破坏和外源化学物对生物合成前体物呈现竞争性抑制，也可造成畸形。 4、在细胞分化增值过程中，一些重要酶类的抑制或破坏，将影响胚胎正常发育过程，并引起畸形，例如核糖核酸酶、DNA聚合酶、碳酸苷酶等。 5、在细胞膜正常结构以及渗透性等生物物理性质改变的情况下，也可出现畸形。 近年来, 随着生命科学的进展, 对致畸机理认识逐渐深入,虽然尚未能系统全面阐明，但可能更为概括和深入。有人将致畸作用机理，归纳为下列四个方面： 1、致畸物的细胞毒性作用 由于致畸物对细胞复制、转录和翻译或细胞分裂等过程的干扰，影响细胞的增殖，即表现出细胞毒性作用，引起某些组织细胞死亡，因此, 在出生时形成畸形。如果接触致畸物的剂量较低,也可引起细胞死亡，但速度及数量可被存活细胞的增殖所补偿，因此出生时未能形成畸形。若致畸物剂量较高，在短期内造成大量细胞死亡，胚胎出现无法代偿的严重损伤，则表现出胚胎致死作用。只有接触超过致畸阈剂量一定范围的胚胎，细胞增殖速度才降低。不能对受损组织进补偿，但并不危及生命，所以出生时有畸形出现。在某些情况下，同一剂量外源化学物的损害作用，在各窝之间或每窝幼仔之间，同时出现胚胎致死和致畸作用。可能是由于外源化学物在不同胚胎体内生物转运和代谢情况不同；不同窝内或同一窝内，不同胚胎发育阶段存在一定差异结果。 2、细胞分化过程的某一特定阶段、步骤或环节受到干扰 此种机理与上述细胞毒性作用引起坏死机理不同。例如, 除草醚(nitrofen)其立体结构与甲状腺激素相似,可引起心脏、隔、肾畸形和肺发育不全，其作用机理主要是干扰甲状腺激素功能。除草醚在母体及胚胎体内代谢产物为4-羟基-2，5-二氯-4’-氨基二苯基醚（4-hydroxy-2，5-dichloro-4’-aminodiphenyl ether），此种代谢物具有甲状腺激素T3的活性,T3不能透过胎盘,但此种代谢物能透过胎盘，以致引起胚胎早熟以及心脏等畸形。 3、母体及胎盘稳态的干扰 母体必需的某种营养素,例如维生素A和叶酸的缺乏，某些重要营养素的拮抗物的作用(例如EDTA，为某些微量元素的拮抗物）、母体营养失调(例如蛋白质和热能供给不足)、营养素由母体至胚胎的转运受阻、子宫和胎盘血液循环障碍包括高血压症和接触5—羟色胺、麦角胺、肾上腺素等作用于血管的化学物都可破坏母体及胎盘稳态，造成畸形，甚至胚胎死亡和生长迟缓。 4、非特异性发育毒性作用也是发育毒性作用机理之一 此机理主要与生长迟缓和胚胎死亡有关，不涉及畸形作用。此种非特异性细胞毒性作用的特点是对全部胚胎组织细胞基本生命现象的干扰。一旦细胞内能量代谢的降低超过一定程度．全部组织将受到损害，并引起胚胎全面生长迟缓，甚至胚胎死亡；不存在靶部位或靶组织。也不可能有部分组织受损与畸形幼仔出生。 上述四种说法，尚未能对致畸机理作出系统而有说服力的阐述，而且实际情况可能更复杂，有些致畸物可能同时存在两种作用机理，即致畸作用以及发育毒性作用，尚需不断深入探讨。近年来细胞通讯和程序化细胞死亡的障碍或干扰及遗传毒性的研究很受重视，正在深入研究中。现将这两个热点问题做一简要介绍： 细胞死亡被认为是正常胚胎形态发生的一部分，并且是很多致畸物诱导哺乳动物发育异常的一个重要的致病机制。如给小鼠孕11天腹腔注射甲基硝基亚硝基胍(MNNG)所诱发的畸形是四肢畸形，且后肢多于前肢，左肢多于右肢，观察肢芽细胞死亡情况可得到同样的规律。说明肢体畸形与肢芽细胞的死亡有关。根据细胞死亡的模式不同，可分为坏死（necrosis）和调亡（apoptosis）两种。70年代经过电镜和细胞计数的证实，生理性死亡是易受致畸物干扰而引起畸形的过程，致畸物可诱导或抑制细胞死亡，造成靶器官的缺失、发育不良或生长过度。近期研究表明，磷酰胺芥子气、N-乙酰基-2-乙酰胺基芴等诱发的化学致畸作用中，细胞调亡至少是细胞死亡的主要形式。 这一观点认为遗传毒性是化学物诱发致畸或其它发育毒性的重要机制。很多致畸物有遗传毒性，化学物的致畸性与致突变性之间也有良好的相关性，也已发现某些致畸物可引起不同阶段胚胎细胞的突变。近年来研究发现，诱发发育基因和发育调控基因的损伤可导致胚胎的死亡和胎儿畸形。通过转基因技术, 将某一基因插入内源性基因，或用基因打靶技术导致某一基因失效等方法诱发不同基因损伤，可引起不同阶段胚胎的死亡。同样也发现某些发育基因或发育调控基因因损伤而导致畸形。 第三节 致畸作用的特点 －、发育阶段致畸效应的特异性 胚胎所处的发育阶段不同，对于致畸作用呈现不同的敏感性。有性生殖动物的着床前胚泡(blastocyst)对致死作用较为易感，对致畸作用较差。在胚胎发育后期和新生儿期的发育毒性表现为，生长迟缓和神经、内分泌以及免疫系统机能的改变。胎儿对致死作用的易感性虽较胚胎为低。 在致畸作用中，最敏感的阶段是器官发生期，一般称为危险期或关键期(critical period）。致畸物与胚胎接触，可能造成器官发生期的形态结构异常。同一剂量同种致畸物在敏感期中与胚胎接触，可因胚胎所处发育阶段不同而出现不同的畸形。例如在受精后第8至12日期间，以20mg/kg体重剂量每日给予小鼠环磷酰胺,畸形种类可因给予的日期不同而分别为多趾、并趾、缺趾和无趾。各种不同器官对致畸作用的敏感时间存在很大差异。大鼠器官发生期为受精后9至17天，但眼的敏感期在受孕后9天，心脏和主动脉弓约为9～10天，脑约在第10天，头与脊椎骨约在第11天，泌尿生殖器官约在15天。 明确致畸作用敏感期的意义，在于致畸试验中必须正确掌握动物接触受试物的时间-器官发生期，否则不能得到正确的试验结果。 二、致畸的剂量与效应关系 1、剂量效应关系复杂的表现及原因 （1）机体在器官形成期间与具有发育毒性的化合物接触，可以出现畸形，也可引起胚胎致死。当剂量增加时，毒性作用增强，但二者效应程度并不一定成比例，往往胚胎致死作用增强更明显。由于胚胎死亡增加，畸胎数将因而减少。 （2）在同等条件下某种致畸物可以引起畸形，剂量增加时并不出现同一类型的畸形。可能由于较高剂量造成较为严重的畸形，严重畸形有时可将轻度畸形掩盖。例如一种致畸物在低剂量时，可以诱发多趾；中等剂量时则诱发肢体长骨缩短，高剂量时可造成缺肢或无肢。 （3）许多致畸物除具有致畸作用外，还有可能同时出现胚胎死亡和生长迟缓，使剂量效应关系极为复杂。 2、致畸作用的剂量反应关系的曲线较为陡峭，斜率较大。最大无作用剂量与100% 致畸剂量间距离较小，一般相差1倍。往往100％致畸剂量即可引起胚胎死亡，剂量再增加，引起母体死亡。还有人观察到致畸作用最大无作用剂量与引起 100%胚胎死亡的最低剂量相差2～3倍。例如，按剂量5～10mg/kg体重的环磷酰胺给予受孕小鼠后不表现致畸作用，但剂量增加到40mg/kg体重，引起100%胚胎死亡。 3、致畸作用最大无作用剂量问题尚有不同意见。一般认为，机体接触低于致畸阈剂量的致畸物时，先天畸形、胚胎致死和生长迟缓发生率的自然本底数值并不增高，表明这一剂量即为最大无作用剂量。但也有人认为，对于低剂量致畸物的作用与畸形自然发生率的本底值，尚不能明确区分，所以致畸作用的最大无作用剂量问题并未解决。 另外，评定一种致畸物对人体危害时，应充分考虑人体可能实际接触的剂量。 三、致畸的物种个体差异 任何环境有害因素的损害效应都存在物种及个体差异。但在致畸作用中较突出。例如，杀虫剂西维因（carbaryl）对豚鼠具有致畸作用，对家免和仓鼠并不致畸。农药敌枯双对大鼠致畸作用明显，但未得到人群调查的证实资料。曾用于治疗妊娠反应的反应停，由于在人类以及其它灵长类动物具有强烈致畸作用后，停止使用，但小鼠和家兔即使接触较大剂量，其致畸作用极为轻微。同一物种动物的不同品系对一种致畸物敏感性的差别很大，例如，脱氢皮质酮和生物染料锥虫蓝以及反应停都有这种现象。 物种及种间差异，可能由于同一致畸物在不同物种和同一物种的不同品系动物的代谢过程有一定差异；再有由于致畸物主要是通过母体胎盘作用于胚胎，而不同物种动物胎盘构造也不相同。这些差异可能是由于遗传因素，即基因型差异。 致畸作用物种品系差异的存在，在实际工作中具有重要意义。环境有害因素的致畸作用以及发育毒性的评定，主要通过动物试验得出评定结果后推论到人类。致畸作用物种品系差异，可能存在对动物不具致畸, 但对人类有致畸作用，动物致畸试验结果推论到人类造成某些困难。所以对致畸作用的全面评定，必须采用两种动物进行试验，还要进行人群调查。 第四节 发育毒性的评定 致畸是发育毒性中最重要的一种表现。所以发育毒性的评定，主要是通过致畸试验。传统常规致畸试验是评定致畸作用的标准方法，近年来随着毒理学和生命科学的进展，也有一些新的方法出现，也略作介绍。 一、传统常规致畸试验 1、动物选择 致畸试验中动物应选择，食性和对受试物代谢过程与人类接近，体型小、驯服、容易饲养和易繁殖及价廉外，还应特别注意妊娠过程较短、每窝产仔数较多和胎盘构造与人类接近的动物。 致畸试验可选用二种哺乳动物，一般首先考虑大鼠，此外为小鼠或家兔。大鼠受孕率高，易于得到足够标本数，而且大鼠对大多数外源化学物代谢过程、基本与人类近似。但不足之处是大鼠对一般外源化学物代谢速度很高，对致畸物耐受性强、易感性低，有时出现假阴性结果。例如, 锥虫蓝可以干扰大鼠卵黄囊胎盘对胚胎的正常营养过程而导致畸胎，出现阳性结果。而人类胎盘不具有卵黄囊胎盘阶段，所以有时此种结果对人类为假阳性。 小鼠自然畸形发生率较大鼠高。对形成腭裂的致畸物更较为敏感。家兔为草食动物，与人类代谢功能差异较大，妊娠期不够恒定，自然发生率也较高。鸡胚也可进行致畸试验，可同时得到大量鸡胚，胚胎发育条件也较易控制。但鸡胚不是哺乳动物，缺乏受试物与母体的相互作用。 2、剂量分组 致畸试验中剂量分组是极为关键与复杂的问题。在确定剂量时，一方面要求找出最大无作用剂量以及致畸阈剂量；同时还要保持母体生育能力，不致大批流产和过多胚胎死亡和避免母体死亡。一般应先进行预试。预试的目的是找出引起母体中毒的剂量，一般用孕鼠8～10只，在妊娠5～16天内给予受试物。如出现较严重的母体中毒、流产或胚胎大量死亡，将剂量略为降低，直到找出引起母体轻度中毒一般症状的剂量。根据预试结果进一步确定正式试验剂量。 正式试验最少应设3个剂量组，另设对照组。如受试物溶于某种溶剂中给予动物，则另设溶剂对照组。有时为了更好地验证试验结果，另设阳性对照组。原则上，最高剂量组该剂量一般不超过LD50的1/5-1/3，应引起母体轻度中毒，即进食量减少、体重减轻、死亡不超过10%；最低剂量组可为LD50的1／100～l/30，不应观察到任何中毒症状，；中间剂量组可以允许母体出现某些极轻微中毒症状，其剂量与高剂量和低剂量成等比级数关系。最高剂量组能引起母体轻度中毒，仍未观察到致畸作用，则可确认为该因素不具有致畸作用。如已掌握或能估计人体实际接触量，也可将实际接触量作为低剂量，并以其10倍左右为最高剂量。凡急性毒性较强的受试物，所采用剂量应稍低，反之可较高。 致畸试验的分组可因试验目的不同而有所变化。如欲观察剂量效应（反应）关系，则设计剂量组数适当增加。 3、动物交配处理 将性成熟雌雄动物按雌雄1:1或2:1的比例同笼交配。每日将已确定受孕雌鼠随机分入各剂量组和对照组。确定受孕方法是阴栓检查或阴道涤片精子检查，出现阴栓或精子之日即为受孕“0”日，也有人作为第l日。 接触受试物的方式与途径应与人体实际接触情况一致。对于外源化学物，一般多采用灌胃方式给予。在特殊情况下，也可采用腹腔注射法，效果与经口近似。大鼠和小鼠一般可自受孕后第5天开始接触受试物，每日一次，持续到第15天。如欲研究器官易感性，则应在上述期间增加动物组数，将受试物每日分别给予不同组的动物，根据畸形出现的情况，确定受试物的敏感时间和靶器官。 试验期间每天称取母鼠体重。根据体重增长，随时调整剂量，观察受孕动物的妊娠情况和胚胎发育情况。受孕动物的体重如持续增长，则表示妊娠过程及胚胎发育正常。 4、胎仔检查 自然分娩前1～2日将受孕动物处死剖腹，取出子宫及活产胎仔，记录死胎及吸收胎。一般大鼠在受孕后第19～20天，小鼠第18～19天，家免在第29天。胎仔在临近出生期间，发育进展极为迅速。相差半日，发育情况即有显著差异，骨骼发育尤为显著。 孕鼠处死后，从子宫顶端依次取出其中活产幼仔、死胎以及吸收胎，并记录编号。大鼠和家免还应取出卵巢，记录黄体数用来代表排卵数。活产胎仔取出后，先检查性别，逐只称重，并按窝计算平均体重，然后由下列几方面进行畸形检查：①外观畸形肉眼检查，例如露脑：②肉眼检查内脏及软组织畸形，如腭裂；③骨骼畸形检查，例如颅顶骨缺损等。畸形检查只限活产胎仔。一般可将活产胎仔进行肉眼检查，然后将其中2/3经过固定、透明和茜素红（alizarin red）染色等步骤，观察骨骼畸形。另外经鲍音氏（Bouin） 表8-1胎仔活产、死亡和吸收的特征  种类 颜色 器官外形 自然运动 对机械刺激的反应 胎盘  活产胎仔 肉红色 完整成形 有 有运动反应 红色，较大 晚期死胎 灰红色 完整成形 无 无运动反应 色灰红，较小 早期死胎 乌紫色 未完整成形 无 —— 暗紫 吸收胎 暗紫或浅 不能辨认胚胎 —— —— 不能辨认胚胎  色点块 和胎盘 和胎盘 溶液固定2周以上，再检查内脏及软组织异常情况。近年来，认为关于胎仔中1/3检查内脏，2/3检查骨骼，缺乏足够的理论和依据。因此多改为将两个子宫角的胎仔各1/2，随机分配于骨骼和内脏组畸形检查。也有人主张将试验雌鼠保留近1/4，待其自然分娩，并将出生幼仔饲养观察，至少到断奶，以便检查可能存在的先天缺陷和生理功能异常。 为保证哺乳机会，一般主张每窝保留8只幼仔，并尽量雌雄数量相等。 5、结果评定 致畸试验结果的评定，主要是计算畸胎总数和畸形总数。畸胎总数：每一活产幼仔出现一种或一种以上畸形均作为一个畸胎；畸形总数：在同一幼仔每出现一种畸形，作为一个畸形。如出现二种或二个畸形，则作为二个畸形计，并依此类推。 常用作致畸结果的评定指标： （1）活产幼仔平均畸形出现数，见下式： 　 活产幼仔平均畸形出现数=畸形总数/活产幼仔总数 （2）畸形出现率，见下式： 畸胎出现率=出现畸形的胎仔总数/活产胎仔总数×100% （3）母体畸胎出现率，同一母体无论出现多少畸形胎仔或多少种畸形，一律按一个出现畸胎的母体计算，见下式： 母体畸胎出现率=出现畸胎的母体数/妊娠母体数×100% 还可计算各组动物受孕率、雌性动物平均体重和妊娠期增长体重数。 妊娠期增长体重数相当于（处死时体重）一（妊娠第6天体重）－（处死时子宫及胎仔重量）。此外以窝为单位计算每窝平均活产胎仔数、死胎率、吸收胎率、平均胎仔体重（雌雄分别计算），活产胎仔雄雌性别比例（雄性胎仔数／雌性胎仔数）和每窝活产胎仔平均体重。 6、致畸物以及发育毒性作用物危险度评定对于致畸物危险度及致畸作用机理尚未充分阐明。评定方法方法较多。虽然各有一定的根据，但都具有一定的经验性质，而且缺乏大规模的实际验证。现择要介绍几种，供实际工作中参考。 （l）欧洲经济共同体(EEC)和经济合作与发展组织(OECD)建议的致畸物分级标准，可简称EEC和OECD致畸物分级标准。主要根据动物试验和人群调查资料,具体分级标准如表8-2： （2）致畸指数：母体LD50与胎仔最小致畸作用剂量之比,这一比值愈大，致畸作用愈强，一般认为比值10在以下者，不具致畸作用，10～100具致畸作用，100以上致畸作用强烈。 ? 表8-2致畸物的参考分级标准  级 别 分 级 依 据 对人类危险性  1 已确定人类母体接触后可引起子代先天性缺陷 已证实对人致畸 2A 对动物肯定致畸，但对人类致畸作用尚未确定 对人可能致畸 因果关系 2B 动物试验结果肯定致畸，但无人类致畸资料 对人可能致畸 3 尚无结论性肯定致畸证据或资料不足 可以认为对人无致畸 作用，但应继续研究 4 动物试验阴性，人群中调查结果未发现致畸 对人无致畸作用 ? （3）相对致畸指数（RTI）：成年动物最小致死剂量（LD01）与引起5%活产胎仔出现畸形的剂量（tD50）之比值。 （4）母体毒性与发育毒性比值：即对母体最低损害作用剂量(A)与胎仔最低损害作用剂量(D)之比(A／D)。一般认为A／D比值≥3，具有发育毒性危险性。比值越大，危险性越高，≤3者，相对危险性较低或不具危险性。 利用V/D比值评定某一外源化学物或其它环境有害因素致畸危险性时，还可将人体实际接触的剂量考虑在内。有人提出、A／D比值中母体最低损害作用剂量的测定，应在妊娠动物进行，否则不够精确。 二、致畸物体内筛检试验法 体内筛检试验法主要研究筛检对象为受孕小鼠或大鼠。实验最少设两个剂量组和一个对照组。高剂量组给予未孕鼠最小有作用剂量，允许产生明显母体毒性。在妊娠6-15日期间，每日记录母鼠体重，待其自然分娩。 本法是利用孕鼠对外源化学物是否具有致畸作用,进行初步筛检的体内试验。除可初步观察大体畸形外。还可观察胚胎致死、生长迟缓等其它发育毒性表现，其特点是简单易行，不进行传统常规致畸试验中需要的检查，时间、费用和人力都较节约，可满足大量外源化学物进行致畸试验的需要。此外，还可确定生长发育迟缓是否为可逆性。 三、其它试验 近年来随着客观形势的需要和细胞组织和器官培养技术的进步。建立了全胚胎培养、胚胎的某一器官(例如肺、牙齿、肾等)培养和细胞培养的体外试验法。发育过程本身包括细胞增殖分化等极为复杂的各种过程，致畸作用的机理也尚未充分阐明，所以选择适当观察指标极为重要。几种重要的体外试验方法如下： 1、全胚胎培养法系将试验动物的全胚胎在一定的培养基中进行培养，观察在接触受试物的情况下，是否呈现致畸作用以及发育毒性。胚胎可来自大鼠、小鼠和家兔。 2、器官培养法系将胚胎或胎仔组织、器官或器官的一部分在体外培养，观察外源化学物对其发育过程的影响。 3、细胞培养法传代细胞株(cell line)和原代细胞都曾用于外源化学物致畸作用评定。主要根据是致畸物可以干扰细胞的正常生长过程。但细胞株经长期传代培养，往往失去细胞原有特性。根据目前的经验，肢芽细胞培养法对外源化学物致畸作用预测准确度可达到89%，神经元培养法为85％。 四、生殖毒性和发育毒性三阶段一代试验法 为60年代后期美国食品药物管理局（FDA）首先提出的一种试验法。其中包括三个试验阶段，各有一定的试验目的，可以分别单独进行。一般称为三阶段一代繁殖试验（three segment reproduction test）：第一阶段和第二阶段分别与生殖毒性试验和传统常规致畸试验相似（表8-3）。但其第三阶段试验系观察外源化学物对胚胎后期和出生后发育的影响： 表8-3大鼠行为致畸实验程序  检查或测定项目 检查（测定）日期（日龄） 检查或测定项目 检查（测定）日期（日龄） 检查每窝仔鼠的数目 1 视觉发育 16-21 和性别 断乳 21 每窝随意选8-12只 1 神经组织学检查 21 仔鼠作为观察对象 分窝饲养 25 实验动物编号 1 转轮试验（运动量） 曾试验者 未试验者 称重 1、7、14、21 30-51 — 张耳 1至全部仔鼠张耳 开阔场试验及情动 — 40-43 出牙（门齿） 1至全部仔鼠出牙 试验 向前运动的发育情况 1至全部完成 旋转轮试验 60-61 — 平面翻正反射 3至全部完成 （协调动作机能） 断崖回避反射 3至全部完成 食饵辨别试验 — 65至全部完成 游泳发育 6-20 主动躲避 65至全部完成 — 回转运动 7 被动躲避 — 80—82 听觉惊愕反射 8至全部完成 脑重量 90 90 神经组织学检查 90 90 ? 1、第一阶段试验即生育力与生殖功能试验目的是检验外源化学物对受孕能力和生殖功能的影响。在性成熟的雄鼠开始接触受试物60天后，雌鼠在接触14天，并进行交配。上述接触或可以包括全部精子发生期和排卵期。一般分为2～3个剂量组和一个对照组。高剂量组可引起母体轻度中毒，不能出现严重中毒症状或10％以上的死亡。低剂量组只能出现受试物可能引起对人体的生理预应、药理学治疗效应或能对组织中某些酶的活力造成一定的影响，但不应出现中毒症状。中间剂量与高剂量和低剂量成等比级教，只能出现极为轻微的中毒或无任何症状。每组雌性动物20只，雄性10只，最好选用两种哺乳动物。在妊娠接触有害环境因素，第14天时，将一半受试孕鼠处死，剖开子宫，观察记录黄体数、着床数和吸收胎数，并分别计算着床前死亡率和着床后死亡率。另一半孕鼠继续接触受试物，直到分娩和哺乳结束。 2、第二阶段试验致畸作用和胚胎毒性的评定每组雌鼠20只．在妊娠6至15日接触受试物。自然分娩前1天，处死孕鼠，取出胎仔，称重、鉴定性别并检查内脏和骨骼有无畸形。 3、第三阶段试验围产期及出生后发育情况试验受孕动物在妊娠期的第15天开始接触受试物，直到幼仔断奶，以评定受试物可能对胎仔发育后期、母体妊娠、分娩和受乳以及幼仔在新生期间存活和生长发育的影响。观察指标有受孕率、幼仔性别比例或雌雄两性各占幼仔总数的百分率、出生存活率、哺育成活率等。此外观察生长指数，即雌性和雄性幼仔在出生时和出生后4、7、14、及21天的平均作重。第三阶段试验还可能发现第二阶段试验中来被检出的畸形，例如某些心肺畸形可在第二阶段内造成死胎，而未被检出。 在生殖毒性与发育毒性三阶段一代试验法中，第一阶段和第二阶段虽然试验方法一般生殖试验和传统常规政畸试验基本相似，但生殖试验只进行一代，仅适用于药物等接触时间较短的外源化学物。至于人体长期接触的外源化学物，还应进行两代生殖试验，才较为可靠。 五、人群调查 关于对外源化学物生殖毒性和发育毒性作用评定，除进行动物试验外，还应利用流行病学调查方法，在接触外源化学物的人群中进行调查。调查中的观察指标可参照有关的临床诊断检验指标，例如：①男性精液检查。②女性月经、妊娠情况。③男女双方性腺功能和性生活情况。④子代有无先天缺陷、新生儿体重不足。还可进行染色体畸变检查。具体进行方法可参照流行病学的人群调查方法。 （赵康涛 海春旭）