第六章 环境有害因素致突变作用 第一节 基本概念和类型 一、基本概念 生物的个体和各代之间存在着种种差异，我们通常称之为变异（variation）。基于染色体和基因的变异才能够遗传，而遗传变异称为突变（mutation）。突变的发生及其过程就是致突变作用（mutagenesis）。突变可分为自发突变(natural或sporadic mutation)和诱发突变(induced mutation）。各物种的自发突变频率较低, 而诱发突变比较常见, 诱发突变指由于物理、化学、生物等环境因素引起的突变。至今, 已发现相当数量的外源化学物能损伤遗传物质，从而诱发突变，这些物质称为致突变物或诱变剂（mutagen），也称为遗传毒物(genotoxic agent）。 二、突变的类型 按作用后果或遗传物质损伤的性质等可将诱发突变分类。一般根据遗传物质的损伤能否在显微镜下直接观察到分为染色体畸变(chromosome aberration)和 基因突变(gene mutation)两类：染色体损伤大于或等于0.2微米时，可在光学显微镜下观察到，称为染色体畸变；若小于这一下限，不能在镜下直接观察到，要依靠对其后代的生理、生化、结构等表型变化判断突变的发生，称为基因突变(gene mutation），亦称点突变(point mutation）。 (一)基因突变 分子水平遗传物质的改变，包括碱基置换(base substitution)、移码突变(frame-shift mutations)和大段损伤。 1、碱基置换 碱基置换是首先在DNA复制时由于互补链的相应配位点配上一个错误的碱基，而这一错误的碱基在下一次DNA复制时发生错误配对(mispairing),错误的碱基对置换了原来的碱基对，亦即产生最终的碱基对置换(base-pair substitution)或称碱基置换。它包括转换和颠换两种情况：原来的嘌呤被另一嘌呤置换或原来的嘧啶被另一嘧啶置换，我们称之为转换(transition）；若原来的嘌呤被嘧啶置换或原来的嘧啶被嘌呤置换，我们则称之为颠换(transversion）。无论是转换还是颠换都只涉及一对碱基，其结果可造成一个三联体密码子的改变, 可能出现同义密码、错义密码和终止密码。由于错义密码所编码的氨基酸不同，表达的蛋白质可能发生改变；如果错义密码为终止密码，可使所编码的蛋白质的肽链缩短。 2、移码突变 移码突变是DNA中增加或减少不为3的倍数的碱基对所造成的突变。碱基序列三联体密码子相互间并无标点符号。移码突变能使密码子的框架改变，从原始损伤的密码子开始一直到信息末端的核酸序列完全改变，也可能使读码框架改变其中某一点形成无义密码，于是产生一个无功能的肽链片段。如果增加或减少的碱基对为3的倍数，则使基因表达的蛋白质肽链增加或减少一些氨基酸。由于移码可以产生无功能肽链，故其易成为致死性突变。 3、大段损伤 大片段损伤是指DNA链大段缺失或插入。这种损伤有时可跨越两个或数个基因，但所缺失的片段仍远小于光镜下所能观察到的染色体变化，故又可称为小缺失。 （二）染色体畸变 染色体的畸变包括染色体的结构异常和数目改变。其在丝裂期的中期才能观察到，对于精子细胞的某种特定畸变则须在减数分裂期的中期Ⅰ期进行观察。 1、染色体结构异常 染色体结构异常是染色体或染色单体受损而发生断裂，且断段不发生重接或虽重接却不在原处；这种作用的发生及其过程称为断裂作用（clastogenesis）。使其断裂的物质称为断裂剂（clastogen）；可分为两种，大多数如紫外线，只能诱发DNA单链断裂，故称为拟紫外线断裂剂，这种断裂必须经过S期的复制，才能在中期相细胞出现染色单体型畸变，故又称为S期依赖断裂剂(S-dependent slastogen)；少数像电离辐射一样，可诱发DNA双链断裂，我们称之为拟放射性断裂。其可在G0期和G1期作用，经S期复制，在中期呈现染色体型畸变，故我们称之为S期不依赖断裂剂(S-independent clastogen)。但是，任何情况下的染色单体型畸变都会在下一次细胞分裂时转变为染色体型畸变。 染色体型畸变（chromatid-type aberration）是染色体中两条染色单体同一位点受损后所产生的结构异常，有多种类型： （1）裂隙和断裂（gap and brake）：都是指染色体上狭窄的非染色带，其所分割的两个节段保持线状连接为裂隙，否则为断裂。 （2）无着丝粒断片和缺失(acentric fragment and deletion)：一个染色体发生一次或多次断裂而不重接，且这些断裂的节段远远分开会出现一个或多个无着丝粒断片和一个缺失了部分染色质并带有丝粒的异常染色体。细胞再次分裂时会形成微核或微小体。 （3）环状染色体（ring chromosome）：染色体两臂各发生一次断裂，其带有着丝粒的节段的两断端连接成一个环，称之为环状染色体。 （4）倒位(inversion)：当染色体发生两次不同部位断裂时，中间节段倒转1800再重接，为倒位。 （5）插入和重复(insertion and duplication)：当一个染色体发生三处断裂，带有两断段的断片插入到另一臂的断裂处或另一染色体的断裂处重接称为插入，若缺失的染色体和插入的染色体是同源染色体，且各有一处断裂发生于同一位点，则出现两段相同节段，称为重复。 （6）易位(translocation)：从某个染色体断下的节段连接到另一个染色体上称为易位。两染色体各发生一次断裂，只一个节段连到另一染色体上为单方易位，相互重接为相互易位，若发生3处以上的断裂，其交换重接称为复杂易位。 染色单体型畸变(chromosome-type aberration)指某一位点的损伤只涉及姐妹染色单体中的一条，它也有裂隙、断裂和缺失；此外，还有染色单体的交换(chromatid exchange),是两条或多条染色单体断裂后变位重接的结果，分为内换和互换。而姐妹染色单体交换(sister chromatid exchange,SCE)则是指某一染色体在姐妹染色单体之间发生同源节段的互换，两条姐妹染色单体都会出现深浅相同的染色（而正常的则是一深一浅），但同源节段仍是一深一浅，这种现象就是SCE。 2、染色体数目异常 以动物正常细胞染色体数目2n为标准，染色体数目异常可能表现为整倍性畸变(euploidy aberration)和非整倍性畸变(aeuploidy aberration)。前者即出现单倍体或多倍体；而后者指比二倍体多或少一条或多条染色体，例如，缺体(nullisome)是指缺少一对同源染色体，而单体或三体则是某一对同源染色体相应地少或多一个。 染色体数目异常是由于染色体行态异常或复制异常，其原因有四方面:(1)不分离： （nondisjunction）指在细胞分裂的中期和后期，某一对同源染色体或姐妹染色单体同时进入一个子细胞核为不分离； (2)染色体遗失(chromosome loss): 在细胞分裂的中后期，如果一个染色体未能进入下一个子细胞核，使子细胞缺少一个染色体；(3)染色体桥(chromosome bridge)的影响：染色体畸变中出现的双着丝粒染色体在细胞分裂后期如不能被拉断，就会在两核之间形成染色体桥，它使细胞不能分裂，出现四倍体。（4）核内再复制(endoreduplication):四倍体的细胞核进入下一个分裂周期，恢复正常复制与分离，出现四条染色单体排列的现象，称为核内再复制。 表6-1染色体畸变描述方式 描述方式 含 义  -1 丢失一个1号染色体 +7 获得额外的一个7号染色体 2q-或de/2q 2号染色体长臂部分缺失 4p 4号染色体短臂增加遗传物质 t(9;22) (q34;q11) 9号和22号染色体相互易位，断裂 点在9号染色体长臂第3区第4带 和11号染色体长臂第1区第1带 iso(6p) 等臂染色体，其两臂来源为6号 染色体的短臂 inv(16) (p13q22) 16号染色体长臂第1区第3带至 第2区第2带间倒位 ?  第二节 致突变的分子机制 无论化学或物理、生物因素都有致突变作用，我们以化学因素为例进行阐述。 一、DNA的损伤 目前染色体畸变和基因突变的分子机理有两种：一是以DNA为靶，直接诱变，另一则是不以DNA为靶的间接诱变。 1、直接以DNA为靶的诱变 (1) 碱基类似物的（base analogue）取代 有些化学物的结构与碱基非常相似，它能在S期与天然碱基竞争并取代其位置。取代后的碱基类似物出现异构互变（tautomerism）,发生错误配对而造成碱基置换。 (2)烷化剂(alkylating agent)的影响 烷化剂是对DNA和蛋白质都具有强烈烷化作用的物质，除连接戊糖的氮原子外，其对于多核苷酸链全部氧和氮原子，都能在中性环境中产生烷化作用。目前认为，最常发生烷化作用的是鸟嘌呤的N-7位，其次是O-6位。而腺嘌呤的N-1、N-3和N-7也易烷化。在烷化作用时，烷化基团甚至整个烷化剂分子可与碱基发生共价结合，形成加合物。鸟嘌呤发生烷化后可从DNA上脱落，出现空缺，导致移码突变；亦可随机在互补位置上配任一碱基，使碱基置换。有的烷化剂可同时提供两个或三个烷基，称为双功能或多功能烷化剂。这些多功能的烷化剂常使DNA链内、链间或DNA与蛋白质之间发生交联(cross linkage)也常发生染色体或染色单体断裂，并易发生致死性突变。 （3）致突变改变或破坏碱基的化学结构 有些化学物可对碱基产生氧化作用，从而破坏碱基的结构，有时还可引起链断裂。还有些物质可在体内形成有机氧化物或自由基，可间接使嘌呤的化学结构破坏，容易出现DNA链断裂。 （4）平面大分子嵌入DNA链 有些大分子能以静电吸附形式嵌入DNA单链的碱基之间或DNA双螺旋结构的相邻多核苷酸链之间，称为嵌入剂(intercalating agent)。它们多数是多环的平面结构，恰好是DNA单链相邻碱基距离的两倍。如果嵌入到新合成的互补链上。就会缺失一个碱基；如果嵌入到两模板链的碱基之间，就会使互补链插入一个碱基，造成移码突变。 2、不以DNA为靶的间接诱变 化学物的间接诱变作用可能是通过对纺锤体作用或干扰与DNA合成和修复有关酶系统造成的。 ??????? 表6-2 直接以DNA为靶的各种致突变物及其诱发的损伤和突变类型 致突变物种类 DNA损伤类型  降低碱基结合力 破坏碱基 碱基错配 交联 嵌入 烷化剂 单功能 + + + 双功能 + + + 多功能 + + 错配剂 Brdu + + 2-AP + 亚硝酸根 + + 羟胺 + 有机过氧化物和自由基形成 甲醛 + 乌拉坦 + 乙氧咖啡 + 嵌入剂 吖啶 + 菲啶 + 多环烃类 + 无鸟嘌呤裂隙 链断裂 ??????????????????????????????????????????????????????????????????? ??????????????????????????? 突变类型????????????? ??????? 单链式双链断裂 点突变 染色体畸变 移码 ?   染色体畸变 （1）纺锤体抑制 一些化学物作用于纺锤体、中心粒或其它核内细胞器，从而干扰有丝分裂过程。对纺锤体作用的分子机理大致分为如下几点:Ⅰ与微管蛋白二聚体结合，防 碍微管的正确组装，引起细胞分裂完全抑制。Ⅱ与微管上的巯基结合，这种结合有明显的化学结构特异性，可引起多种后果，但常不至使细胞分裂完全抑制。Ⅲ 破坏已组装完成的微管，不同的物质对微管的作用方式不同，秋水仙碱直接使之解体，而灰黄霉素破坏其聚-解动态平衡，有些物质则通过蛋白质变性作用破坏微管，但其结果都是使对于组装微管极为重要的β微管蛋白与其它组装成分之间的关键反应受到影响。此外，氨基甲酸酯类使微管失去定向能力，其机制尚不清楚。Ⅳ 防碍中心粒移动，秋水仙碱能防碍分裂早期两队中心粒的分离和移向两极。Ⅴ 其它作用，N2O亦可产生与秋水仙碱同样的后果，但其机制尚不清楚。 （2）对酶促过程的作用 对DNA合成和复制有关的酶系统作用也可间接影响遗传物质。例如，一些氨基酸类似物可使与DNA合成有关的酶系统遭受破坏而诱发突变；铍和锰除可直接作用于DNA外，还可与酶促防错修复系统相作用而诱发突变。 二、DNA损伤的修复 遗传信息之所以能长期保持高度保真(fidelity)即重现精度，是由于细胞能够①通过对DNA损伤的修复以保护亲代DNA链，使之避免由于外来因素的作用而发生改变；②执行高度保真的复制，即对复制中发生的错误及时修复以达到高度保真性。现已证明突变频率与各种酶性DNA修复和防错系统的效率呈负性相关。但也有一些是易错(error-prone)修复系统。 1、复制前的修复 (1)光复活(photoreactivation）这是一种修复紫外线损伤所产生的胸腺嘧啶二聚体的功能。波长200-300nm的短波紫外线，特别是260nm，能使DNA的碱基形成二聚体，嘧啶对紫外线的损伤要比嘌呤易感10倍，最常见的紫外线对DNA损伤是相邻两个嘧啶形成的二聚体。在大肠杆菌中，光复活是通过phr基因所编码的光裂合酶(photolyase)利用长波紫外线或短波可见光线的能量对嘧啶二聚体进行单体化，从而达到修复作用。光复活是一步完成的，光裂合酶从原核生物到真核生物广泛存在，但光裂合酶并非普遍存在于各种生物细胞中，生物进化程度越高，这种修复能力似乎越弱。 (2)“适应性”反应 这是另一种一步完成的修复系统。研究发现，对DNA的烷化作用可以诱导一种具有专一作用的蛋白质的合成。这种蛋白质称为烷基转移酶或烷基受体蛋白质。该蛋白能将O6-烷基鸟嘌呤的烷基转移至酶本身半胱氨酸上的巯基，从而恢复鸟嘌呤的本来结构。最新研究认为有可能存在对不同位置烷化作用有专一性的转移酶或受体。在多种细胞中，包括哺乳动物细胞，都发现“适应性”的反应活性。 (3)切除修复(excision repair) 切除修复是一个多步骤修复过程。70年代末，有人将其分为碱基切除修复和核苷酸切除修复,认为两者涉及的酶系统有差异，目前看区别不明显。 第一步参与修复的酶是转葡萄糖基酶或称为N-糖基化酶。该酶能识别异常碱基，并使异常嘌呤的N9和异常嘧啶的N3与脱氧核糖之间的键发生水解，于是，DNA链上形成无嘌呤或无嘧啶位点；二者可统称为无嘌呤嘧啶位点，在大肠杆菌中发现最少有7种转葡萄糖基酶，每一种都能特异地识别一种或少数几种异常碱基。 切除一个异常碱基后，可能有两种方法完成修复。一种是由插入酶(insertase)将正确的碱基插入AP位点，另一种办法是由AP核酸内切酶(Apendonuclease) 在AP位点或其旁边的5′端将DNA切开一个缺口，使一端成为5′-磷酸基，另一端成为3′-OH基，随之核酸外切酶(exonuclease)切除一些碱基，再由多聚酶(polymerase)重新合成正确的碱基，最后由连接酶(ligase)将其连接。 除AP内切核酸酶外，还发现对某些DNA损伤有着特异性的核酸内切酶。其中比较特殊的是UV核酸内切酶切除紫外线产生的嘧啶二聚体的情况。该酶可作出两个切口，一个在二聚体5′侧的第8个磷酸二酯键，一个在二聚体3′侧的第4或第5个磷酸二酯键。表明该酶不仅能内切，还能外切。UV核酸内切酶不仅能作用于嘧啶二聚体，还能作用于许多较大的螺旋扭曲变形损伤。由于该酶还有外切作用，有时称之为“切除核酸酶”（excinuclease）。 2、与复制有关的修复 复制前的修复绝大多数准确无误，故有人称为复制前错误改正。如果损伤保留至复制时才修复，则可能有多种方式发生错误，因而产生突变。产生错误的方式与损伤的特点有关。例如甲基化的碱基能诱发在其对面插入错误的碱基，从而导致碱基置换。一般认为在切除修复中这种烷基化的碱基很易修复，即使不是完全无误修复，其发生错误的机会也较保留至复制时才修复大为减少。 有些物质，特别是诱发移码的物质ICR191和单功能烷化剂甲基 -N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)对大肠杆菌在对数生长期中的作用主要是在复制叉附近引起的损伤。这种损伤可长期保留至复制时才可被修复，从而发生错误。 在大肠杆菌中有一个错配修复系统能在复制时改正错误。该系统有一种由dam基因编码的酶使GATC序列的腺嘌呤6位甲基化。在该酶完成甲基化之前，DNA处于低甲基化状态。此时有几个mut基因编码的错配修复系统能从新合成的DNA链上切除错配的碱基，并以正确配对的碱基替代之。dam基因的突变体缺乏6-嘌呤甲基化酶，比野生型产生更多的错误，认为是由于不能有效地识别新链和旧链而无法排除错配。 在复制过程中多聚酶起重要作用。其中Pol I的三种活性，特别是矫正读码功能的3′→5′核酸外切酶的的活性，对确保无误修复非常重要。他能识别刚刚错配的碱基，在多聚酶向前移动和核酸链继续延长之前，立即将之切除，以确保新的正确插入。多聚酶属于含Zn2+酶类，而且需要有Mg2+存在，才能顺利完成其催化任务，因此当Zn2+或Mg2+被Be2+、Mn2+、Co2+等二价金属置换上时，复制的正确性就会降低，这一点很可能金属在体内诱变的机理。 3、SOS修复 在修复前有几种修复系统能正确排除损伤予以修复。如果损伤保留至复制时，仍有一些与复制有关的系统可将一部分损伤消除。此外，60年代末期有人提出还有一套复制后修复的系统。这是指模板链上的非编码损伤导致DNA互补链向前延长受阻时，在排除这种损伤时，可通过两条子链间的重组性交换来填补所留下的空隙。对大肠杆菌的研究表明这种修复系统尚未查清，仅假设为一种延迟的“旁路”修复。 70年代中期提出一个完全不同的假说。其根据是大肠杆菌如经轻度紫外线照射，并将照射的λ噬菌体传染(transfection)λ菌,则λ噬菌体存活率大为提高。如大肠杆菌未经照射，就没有这种效果。认为对大肠杆菌的轻度照射使整个细胞处于一种危害状态，诱发了一系列的修复活动，故按当时国际通用的呼救密码SOS，称为SOS 修复系统。这一修复系统必须在损伤因素的诱导下才能发生，而且修复虽可使生物体从致死效应中解除，却容易出错。所以是一种易错修复(error-prone repair)，该系统能在复制前的切除修复中起作用，但主要是在复制时起作用。该系统是由recA和lexA两个基因调节控制，整个SOS修复过程可分为4个阶段。 (1)诱导前期 细胞在DNA受损前lexA基因处于较高活动水平，其基因产物lexA蛋白质是对lexA基因座本身、recA基因座、umuDC操纵子，以及包括uvrA、uvrB和uvrC在内的其他8个基因座的抑制物(repressor)。因此这些基因的产物通常都处于低水平。 (2)致突变因素作用期 致突变因素作用于DNA所产生的某些损伤可作为致突变因素的第二信使，诱导SOS修复系统的反应。能够作为第二信使的损伤有N-3-烷化腺嘌呤，寡核苷酸，裂隙DNA，单链DNA片段以及可能尚未阐明的损伤。 (3)诱导过程 在第二信使和和ATP同时存在下，RecA蛋白质可被活化为蛋白酶，具有裂解LexA蛋白质的能力。一旦LexA蛋白质被裂解，所有参与SOS反应的基因都将充分表达。可以想象recA、uvrA、uvrB和uvrC基因充分表达对SOS修复中可能需要的重组、切除修复等作用都将更为有效。其中recA的表达将产生更多的RecA蛋白质，只要第二信使依然存在，RecA蛋白质作为蛋白酶的作用就会持续下去，直至修复完成。 (4)SOS终止 随着第二信使被排除，RecA蛋白质的诱导信号亦同时解除，LexA蛋白质水平又再度上升，并作为阻抑物与操纵基因结合，关闭操纵子，终止SOS过程。 总之，任何DNA损伤，只要修复无误，突变就不会发生；如果修复错误或未经修复，损伤就得以固定(fixed)下来,于是发生突变。因此诱发突变是一个受控制的过程，失控才真正发生突变。一般来说从DNA损伤到损伤固定需要几次细胞分裂周期才能形成。 第三节 突变的后果 致突变物对机体的作用是通过靶细胞实现的。当靶细胞是体细胞而不是生殖细胞时，其影响仅能在直接接触该物质的亲代身上表现出来，而不可能遗传到子代；只有靶细胞为生殖细胞时，其影响才有可能遗传到子代（图6-1）。 一、体细胞突变的后果 体细胞突变的后果中最受注意的是致癌问题，将在下一节叙述。其次，胚胎体细胞突变可能导致畸胎，当然，畸胎的发生还与亲代的生殖细胞突变有关。据报道人类妊娠最初3个月流产中有60%有染色体畸变，在一定程度上这是致突变物透过胎盘作用于胚胎体细胞所致，而不完全是亲代生殖细胞突变的后果。 体细胞突变也可能与动脉粥样硬化症有关。因为对于正常动脉壁细胞中的葡糖-6-磷酸脱氢酶有两种变异体，而从动脉粥样硬化症同一斑块取下的细胞在电泳中只表现为同一种变异体，故认为动脉粥样硬化斑块是单克隆来源。 体外培养的人类非恶性转化细胞，其寿命都有限。这些细胞在传代过程中，细胞遗传学异常率逐渐增高，而有丝分裂逐渐下降，因此可以推测，体细胞突变是衰老的起因，最低限度在体外如此。另外，DNA修复能力缺陷与成熟的早衰老综合征也有一定关系。 二、生殖细胞突变的后果 如果突变发生在生殖细胞，无论其发生在任何阶段，都存在对后代影响的可能性，其影响后果可分为致死性和非致死性两种。致死性影响可能是显性致死和隐性致死。显性致死即突变配子与正常配子结合后，在着床前或着床后的早期胚胎死亡。隐性致死要纯合子或半合子才能出现死亡效应。 如果生殖细胞突变为非致死性，则可能出现显性或隐性遗传病，包括先天性畸形。在遗传性疾病频率与种类增多时，突变基因及染色体损伤，将使基因库负荷增加。 基因库(gene pool)是指一种物种的群体中生殖细胞内具有的、并能传给后代的基因总和。 遗传负荷(genetic load)系一种物种群体中每一个体携带的可遗传给后代的有害基因的水平。 第四节 致突变性评价方法 检测外来化学物的致突变性一般通过致突变实验来进行。其目的主要有两点：①检测外源化学物的致突变性，预测其对哺乳动物和人的致癌性；②检测外源化学物对哺乳动物生殖细胞的遗传毒性，预测其对人体的遗传危害性。实验方法的研究很快，原有方法日益完善，新方法也不断建立，对每个实验所反映的事件的认识不断深化。目前，已有致突变实验两百余种，但常用的较重要的仅十余种。 一、遗传学终点和实验配套 有许多致突变实验所观察到的现象并不能反映基因突变和染色体畸变, 而仅仅能反映诱发突变过程中的其它现象。因而，我们常将观察到的现象所反映的事件，称为遗传学终点（genetic end point）。1979年，国际环境致突变物致癌物防护委员会(ICPEMC)将遗传学终点分为四类：①基因突变，②染色体畸变，③不分离，④原发性DNA损伤；1983年又把遗传学终点分为①DNA完整性的改变，②DNA重排或交换，③DNA碱基序列改变，④染色体完整性改变，⑤染色体分离改变。对于一种化学物是否具有致突变作用，仅用一种试验方法得到的结果是不能肯定的，因此，对于化学物的致突变试验要用多种实验配套。目前，人们对配套试验有多种认识，如有人提出包括体细胞和生殖细胞；体内试验和体外试验，包括原核生物和真核生物等。按照ICPEMC的观点就是配套应当包括反映5 种遗传学终点（图6-2）。为此，选择4 种试验即可满足要求；如Ames试验、微核试验、枯草杆菌DNA修复试验和SCE试验。而生殖细胞致突变在遗传危害评价时，才会考虑。此外，为了将试验结果外推于人，我们还应尽可能选用真核细胞作体内试验。 正常DNA 细胞屏障  接触环境有害因素 DNA损伤① 无误  修复  DNA修复过程①  易错 未修复的  修复 DNA   细胞分裂 ? 损伤表达 染色体  分离异常  重组④② 断裂的②  事件 DNA分子  SCE 染色体④ 基因③ 细胞 非整倍体⑤  有丝分裂性交换 结构异常 突变 死亡 多倍体 　 ?  注：图中所示数字为遗传学终点 图6-2突变发生过程中的事件及遗传学终点的关系 二、重要的致突变试验 1、细菌回复突变试验 细菌回复突变试验简称细菌回变试验，使用鼠沙门氏伤寒杆菌或大肠杆菌进行，分别称为Ames试验和大肠杆菌回变试验，这两种细菌的野生型即原养型能自行合成组氨酸或色氨酸和乳糖，其突变体则缺乏这些能力，在相应的营养缺乏培养基中不能生长，若在受试物的作用下，能生长成菌株，则说明受试物使之发生了回变。 2、哺乳动物细胞正向突变试验 通过对哺乳动物细胞体外培养试验的研究，已发现有十几个基因座(locus)可出现各种突变类型的突变体(mutant)，但常利用抗药性的出现作为突变试验的观察点。由于抗药性是对正常基因座诱发的突变性状，故称为正向突变试验(forward mutation test)。最常用的基因座有hprt基因座、tk基因座和ouar基因座三种，其中最常用的是hprt基因座，因其有关结构基因或调节基因发生碱基置换、移码、小缺失甚至X染色体重排，都能引起嘌呤类似物抗性。但是，乌本苷抗性的表达需要该蛋白质的质量完整，因此碱基置换以外的严重损伤都将导致细胞死亡，而不是突变体细胞的出现。 3、果蝇伴性隐性致死试验 果蝇伴性隐性致死试验(SLRL)所用的果蝇是黑腹果蝇。SLRL能检出各类点突变，其原理是利用隐性基因在伴性遗传中的交叉特征，由于X染色体的隐性突变基因在F1代雌蝇为杂合体，不能表达，而在F2代雄蝇为半合体，能表达出来，如果雄蝇接触受试物后X染色体出现隐性致死性突变，结果其F2代雄蝇数目较雌蝇少一半。 4、小鼠特异基因座试验 特异基因座试验(SLT)是利用两种品系的小鼠，一种为T型，其有几个与毛色、眼色和耳型有关的隐性突变基因的纯合子；另一种为3H1或C57BL系，不具有这些基因的野生型，使后一种小鼠接触受试物，使之与T系交配。如果受试物未能使相应位点发生突变，则杂交一代为杂合子，T系的隐性基因不能表达，如果发生了突变，则相应的隐性基因可于出生时或断乳时表达。因此，本试验又称多隐性突变试验。但本试验耗费极大，目前尚未展开。 5、染色体分析 观察染色体形态结构和数目变化称为染色体分析。在国外常称为细胞遗传学试验(cytogenetic assay)，广义包括微核试验和SCE试验。主要观察染色体的结构畸变（裂隙、断裂、断片、微小体、染色体环、粉碎、双着丝粒染色体和射体、缺失和易位）和数目畸变。体细胞的染色体分析可作体内和体外试验，体内试验多观察骨髓细胞，体外试验常用中国仓鼠肺细胞（CHL）、卵巢细胞（CHO）及V79等细胞系。如进行染色体数目观察，要考虑使用原代或早代细胞，如人外周淋巴细胞。 6、微核试验 细胞质中的微核来源有二：一是断片或无着丝粒染色体环在细胞分裂后期不能定向移动，遗留在细胞质中；二是有丝分裂的作用使个别染色体或带着丝粒的染色体环和断片在细胞分裂后期被留在细胞质中。因此微核试验即能检出断裂剂又能检出有丝分裂毒物。由于微核观察技术简单而省时，近年大有取代染色体分析之势。传统的微核试验是体内试验，对多红细胞进行观察，方法是多次染毒后，观察细胞质中的微核情况。也可用CHL等细胞系或外周淋巴细胞进行体外试验。 7、姐妹染色单体交换（SCE）试验 姐妹染色单体交换这一现象最初是通过用3H—胸苷标记染色体所发现，后来建立了简易可行的姐妹染色单体差示染色法，使得SCE能作为致突变试验的一个观察指标，并利于试验推广。这种差示染色法的基本原理是使细胞在低浓度的Brdu中生长2个周期。由于Brdu是嘧啶类似物，可于合成期中掺入DNA互补链，所以在下一个中期染色体姐妹染色单体之间各有一条互补链掺入了Brdu，于是Brdu对两姐妹单体染色造成同等的干扰，其染色并无区别。但到了第二个周期的中期相，每个染色体中只有一个染色单体保留了原来不带Brdu的模板链，而另一条染色单体则是上一周期带Brdu的互补链成为模板链。于是经两个周期的Brdu掺入互补链可使两姐妹染色单体所含Brdu量不相等，从而也现染色差别。如果Brdlt仅在第1周期掺入。第2周期不掺入，则第2中期似可见姐妹染色单体染色有差别。如果DNA单链发生了断裂，而且在修复过程中发生重排，就在第2周期可见到姐妹染色单传同位节段的相互交换。 由于有些化学物既可引起染色体结构畸变，又可引起SCE，特别是发现SCE有时发生于染色体断裂部位，因此曾认为SCE也是染色体断裂所产生的现象。但是，目前已有充分地证据表明，SCE并非起源于染色体断裂。在一些以染色体断裂为特征的遗传性疾病中，有些表现为SCE正常，而且SCE与染色体畸变在细胞中的分布也不一致。然而在显微镜下直接观察到的SCE，只能认为是染色体完整性受损，而SCE反映DNA交换或重排则仅为推测。由于姐妹染色单体差示染色法可准确判断每一个见到的中期相细胞是第1，第2或第3周期的，因此有人将SCE试验和染色体分析合并进行。 8、显性致死试验 显性致死试验(dominant lethal test， DlT)是使雄性大鼠或小鼠接触受试物，然后使之与未接触该物的雌性大鼠或小鼠交配，观察胚胎死亡情况。一般认为染色体断裂是显性死亡的原因，因为这将导致缺失，或者同时还发生染色体重排或不分开，从而引起染色体不平衡的分离，其结果是形成单体型或三体型，但本试验往往漏检三体型。至于着床前死亡，则认为是精细胞DNA受到多处损伤的结果。阳性结果显示受检物可通过血—睾屏障并使生殖细胞发生突变，显然胚胎死亡这一结果并不表示下一代的基因库受影响，但其出现表示存活的胚胎可能同时有基因突变或染色体畸变。 9、小鼠可遗传易位试验 小鼠可遗传易位试验(heritable translocation test，HTT)是对雄小鼠染毒，使之与未染毒的雌鼠交配，检查F1代雄小鼠生殖细胞相互易位的存在。由于在相互易位过程中，并无遗传物质丢失。胚胎也不至死亡，并成为易位的携带者。对非同源染色体的相互易位可观察初级精母细胞以检出单倍体、三倍体或四倍体。当两个以上染色体发生相互易位时，还可检出六倍体、八倍体和十倍体。 由于，易位杂合体的携带者可能出现不育或半不育，因而在观察前先将F1代雄小鼠与正常生育的雌小鼠交配，以选出可疑的易位携带者来进行染色体分析，从而减少染色体分析的工作量。 10、细菌DNA修复试验 细菌DNA修复试验是使野生型及其相应修复缺陷突变型菌株同时接触受试物。如果发生DNA损伤，则修复缺陷突变型细菌较野生型易于死亡。观察终点是两种菌株在受试物的存在下生长受抑的差异，并以此来推断为DNA完整性受损。如果生长受抑是DNA损伤以外的毒物所致，则两菌株受抑程度一致。常用的菌株有大肠杆菌、枯草杆菌和沙门氏菌，其中枯草杆菌在我国应用较其他菌株普遍。由于枯草杆菌在本试验中涉及重组修复基因，因此试验结果显示了受试物可为重组修复所矫正，故又称为重组试验(Rec-assay)。本试验对检测能与DNA形成加合物或嵌入作用的化学物较为敏感；对于阻滞DNA促旋酶(gyrase)；诱发DNA与蛋白质交联、碱基置换和移码的化学物也可检出。 11、程序外DNA合成试验 基本方法是测定S期以外3H-胸苷掺入胞核的量，这一掺入量可反映DNA损伤后修复合成的量。由于此种合成发生在DNA正常复制合成主要时期以外，故称为程序外DNA合成(unschedule DNA synthesis，UDS)试验或DNA修复合成试验。一般用人淋巴细始胞或啮齿动物肝细胞等不处于正在增殖的细胞较为方便，否则就需要人为地将细胞阻断于Gl期，使增殖同步化。然后在药物的抑制下使残存的半保留DNA复制降低到最低限度，才能避免掺入水平很高的半保留复制对掺入水平很低的程序外DNA合成的观察。 12、精子畸形试验 本试验检查精子头部和尾部的形态异常。精于的成熟和正常形态发育受多基因控制。这些基因的任一个发生突变都会导致精子畸形率增高。某些特殊染色体发生重排，如性—常染色体易位，是化学物诱发精子畸形的主要机理。但是变态反应、缺血、体温升高、感染等其它因素也可导致精子畸形。因此染毒后发现精子畸形率增高并非一定意味着受试物诱发了精细胞发生突变，但精子畸形率增高本身具有生殖毒理学意义。 三、致突变试验中的一些问题 1、体外试验中受试物的活化 有些致突变物是需要经过生物转化使之活化才能呈现致突变作用，为避免因体外和体内活化能力的差异而出现假阴性结果，体外试验常需加入下列模拟代谢系统： （1）无细胞系统，可分为三种，常用的是大鼠肝S9、肝微粒体组分、纯化的酶，是使细胞活化不可缺少的组分，但各有缺点。 （2）哺乳动物细胞，使用完整的细胞，例如大鼠肝原代细胞，与测试细胞或细菌一起培养。其优越性是细胞结构完整，各种酶和内源性辅助因子都较完整，由此发生的代谢过程与体内更为相似。缺点是技术难度较大。 （3）宿主介导试验，受试物和测试细胞或细菌同时输入动物体内，可使生物转化和突变都在体内进行。受试物吸收、分布、代谢、排泄的毒物动力学参数都是体内真实情况。缺点是作为宿主的动物可能作用于测试细胞或细菌，而且技术难度超过上述两类试验系统，灵敏度也差，因此国内尚未见使用。 以上模拟代谢系统和体内试验一样，都存在物种间酶活性的差异，而且除宿主介导试验外，还有一个组织间酶活性和酶种类的差异问题，因为受试物的靶器官不一定是肝脏，而无细胞系统或哺乳动物细胞系统都仅涉及肝脏。 2、试验结果的评定 各种致突变试验都有其特定的观察终点，但实验结束后都面临一个共同的问题， 即所取得的数据表示阳性结果或表示阴性结果。在评定阳性或阴性之前，应首先检查实验的质量控制情况。 阳性结果应当具有剂量-反应关系，即剂量越高，致突变效果越明显，并在观察值与阴性对照之间有显著差异。阳性结果的判定条件是：①最高剂量应包括受试物溶解度许可或灌胃量许可的最大剂量。如该剂量毒性很大，则体内试验和细菌试验应为最大耐受量，使用哺乳动物细胞进行体外试验，常选LD50或LD80为最大剂量。溶解度大，毒性低的化学物，在细菌试验中往往以5000μg／皿作为最高剂量。②各剂量的组间差距不应过大，以防漏检仅在非常狭窄范围内才有突变能力的某些外源化学物。 3、遗传危害评价 对化学物进行遗传危害评价时，应在常规致突变性测试中任一试验出现阳性结果后，再进行标准试验，以评价是否真正具有遗传危害。1983年，ICPEMC将小鼠特异基因座试验、小鼠可遗传易位试验和显性致死试验列为哺乳动物遗传危害标准试验。我国目前常用显性致死试验、精母细胞MI期或精原细胞染色体分析、果蝇伴性隐性致死试验和精子畸形试验。近年来，人们注意到人类有些遗传性疾病与染色体非整倍性有关，因此，专门检出染色体非整倍性的新方法或原有方发的改进纷纷出现，但其可靠性有待验证。