Chapter9 遗传的分子基础
本章要点求
9.1 DNA作为主要遗传物质的证据
9.2 DNA的结构、复制及其损伤修复
9.3 基因的概念与发展
9.4 遗传信息的表达与调控
9.5 核酸研究技术简介
9.6 人类基因组计划简介
9.7 遗传工程及其应用
复习思考题
本章要求
? DNA是主要遗传物质的间接证据与直接证据；
? DNA分子一级结构及双螺旋结构模型要点，
DNA复制的基本模型 (半保留半不连续性 )；
? 遗传信息传递的中心法则与发展；
? 转录、翻译的基本过程及机理；
? 基因概念的发展历程；
? 常用核酸研究技术；
? 基因工程的概念及其基本步骤。
9.1 DNA作为主要遗传物质的证据
9.1.1 染色体组成
9.1.2 遗传物质必须具备的条件
9.1.3 DNA是遗传物质的间接证据
9.1.4 DNA是遗传物质的直接证据
? 细菌转化试验
? 噬菌体侵染与繁殖试验
? 烟草花叶病毒拆合实验
9.1.1 染色体组成,
不同生物或同种生物不同组织细胞中染色体各成份
的含量是有差异的。
染色体
DNA
Pr
RNA 非组蛋白
组蛋白
如,豌豆 染色体 DNA（ 36.5%） Pr（ 44.9%）
RNA（ 9.4%） 非组蛋白（ 7.4%）
组蛋白（ 37.5%）
大鼠肝细胞 染色体
DNA∶ 组蛋白 ≈1∶1
DNA∶RNA ≈1∶0.1
DNA∶ 非组蛋白 ≈1∶0.6
?普遍性
?具有世代延续性
?具有相对稳定性和可塑性
?具有多样性
9.1.2 遗传物质必须具备的条件
9.1.3 DNA是遗传物质的间接证据
?DNA普遍存在于生物体内含量恒定。
?配子中 DNA的含量恰好是体细胞的一半。
?DNA结构的变化与突变具有一致性。
?DNA在代谢上较稳定。
?DNA能自我复制，具有世代的延续性。
9.1.4 DNA是遗传物质的直接证据
1928年，英国微生物学家 Griffith.F做了肺炎双球菌的转化实验
② Avery的转化实验
说明 DNA不受
蛋白酶, 多糖
酶和核糖核酸
酶 （ Rnase）
的影响, 而只
能为 DNA酶所
破坏, 首次证
明了遗传物质
是 DNA。
（二）,噬菌体侵染与繁殖试验 (Hershey和 Chase 1952） ? 噬菌体侵染与繁殖试验
该实验
表明在
不含 DNA
的某些
病毒中，
RNA是遗
传物质。
?烟草花叶病毒拆合实验
(Heinz Fraenkel-Conrat和 B,Singre,1957)
9.2 DNA的结构、复制及其损伤修复
9.2.1 DNA的结构
9.2.2 DNA的复制 —— 半保留半不连续复制
9.2.3 DNA的损伤修复
?光复活
?切除修复
?重组修复
?诱导修复和应急反应（ SOS修复）
9.2.1 DNA的结构
? DNA结构的确定
?1869年 Miescher测定淋巴细胞中蛋白，发现和定
名 Nuclein 核素 ； 1875年提出核素的实验式。
?Altman建立了制备不含蛋白的核素的方法，并定
名为 Nucleic acid。
?Kessel研究了核酸的化学组成，分离出 四种 碱基。
明确提出核酸具有含氮碱基 (1910年获诺贝尔奖 )。
?1909年 Levene.P.A发现酵母的核酸含有核糖，以
后他又发现脱氧核糖，正确指出了核酸的糖基组
成, 核苷、核苷酸的分子结构。
Levene 的四核苷酸假说
1950年,Chargaff.E推翻了四核苷酸假说
Chargaff’s 定则
? 当量定律,A＋ G=T+C
? DNA碱基组成具有物种特异性，而无组织特异性。
? DNA 双螺旋结构的发现
对 DNA 双螺旋结构的发现作出重大贡献的四位科学家
物理学家 Francis Crick
生物学家 James Watson
物理学家 Maurice Wilkins
化学家 Rosalind Franklin
由于 Franklin 过早的去世, 1962年，诺贝尔生理和医
学奖只授给了前面 Crick, Watson 和 Wilkins三位。
Frankeline 早期所拍
的 DNA X光结构照片
1953年,Watson和 Crick确立了
正确的碱基分子 A和 T,C和 G的
配对模型，并从 X光照片确认，
两条骨架链是反平行的，从而
创建了 DNA双螺旋结构模型。这
一模型，也得到 WILkins和
Franklin的认可。当年 4月 25日，
自然杂志发表了 Crick 和
Watson的论文，同时也发表了
Wilkins 和 Franklin与他们的
合作者分别写的两篇实验结果
的论文。
? DNA 双螺旋结构的发现
Watson,Crick的 DNA双螺旋结构
DNA双螺旋结构
9.3 基因的概念与发展
?1865年,Mendel—— 遗传因子
?1909年，丹麦 Johanssen—— 基因
?1915～ 1928年,Morgan等认为基因是以念珠
状直线排列在染色体上的三维一体的一种化
学实体。即基因是功能的基本单位、是突变
的基本单位、是交换的基本单位，基因是不
可再分的。
?1944年,G.Beadle和 E.Tatum 通过研究脉胞
菌突变，提出,一基因一酶 假说。
9.4 基因的概念与发展
? 1944年,Avery首次证实基因的化学本质是 DNA。
? 1953年提出了 DNA双螺旋结构模型，认为基因是具有一
定遗传效应的 DNA片段。
? 1955年,Benzer通过顺反互补测验（确定两次不同的
基因突变是否发生在同一基因内）发现一个基因内部
的许多位点都可以发生突变，并且也可能在这些位点
间发生交换，说明一个基因并不是一个突变单位和一
个交换单位。因而又把基因称为顺反子。
Benzer （ 1955） 的互补实验
基因的顺反子测试示意图
基因内互补作用机理图解
?One Gene,One Protein； One Gene,One Polypeptide Chain
研究血红蛋白时发现，正常 HbA有四条多肽链（ 2条 ?链，两条 ?
链） Vernon M.Ingram证明 ?链第六位氨基酸 HbA是谷氨酸,HbS
是缬氨酸（ 镰刀形细胞贫血症）。
这是证明基因与氨基酸之间存在直接对应关系的第一个直接证据。
?操纵子的发现修正了有一个基因就有一条多肽或决定
一个蛋白质功能的就是一个基因的说法。
?60年代,Jacod和 Monod研究细菌基因调控时发现基因
是可分的，功能上是有差别的。
结构基因 —— 决定合成某种蛋白质
调节基因 —— 编码阻遏或激活结构基因转录的蛋白质
基因
无翻译产物的基因
?新的发现 —— 断裂基因，重叠基因，跳跃基因
?比较 DNA序列和成熟 mRNA—— 内含子和外显子
9.4 基因的概念与发展
9.4 基因的概念与发展
综上所述，对基因可作如下描述,
①基因是实体，它的物质基础是 DNA（ 或 RNA）；
② 基因是具有特定遗传效应的 DNA片段 （ DNA分子中的特
定核苷酸序列）；
③ 基因是遗传信息传递和性状分化发育的依据；
④ 基因是可分的，按其功能（基因的产物）基因可分为
编码蛋白质的基因（结构基因 +调节基因）
无翻译产物的基因（如 rRNA, tRNA, snRNA ）
不转录的 DNA区段（如启动子，操纵基因等）
9.4 遗传信息的表达与调控
9.4.1 DNA的功能
9.4.2 RNA的种类和功能
9.4.3 遗传密码及其特点
9.4.4 遗传信息的转录与 RNA的加工
9.4.5 蛋白质的生物合成
9.4.6 中心法则及其发展
9.4.7 基因表达调控
一、蛋白质的结构和功能
（一）蛋白质的一级结构与功能的关系
（二）蛋白质的高级结构与功能的关系
（三）分子构象病
氨
基
酸
一
级
结
构
二级结构
结构域
三
级
结
构
四
级
结
构
二,DNA的功能
?自体催化 —— 复制
?异体催化 —— 转录
9.4.1 DNA的功能
核酸的研究历史和重要性
? 1869 Miescher从脓细胞的细胞核中分离出了一 种含磷酸
的有机物, 当时称为核素 （ nuclein）,后称为核酸 （
nucleic acid） ； 此后几十年内, 弄清了核酸的组成及在
细胞中的分布 。
? 1944 Avery 等成功进行肺炎球菌转化试验； 1952年
Hershey等的实验表明 32P-DNA可进入噬菌体内, 证明 DNA是
遗传物质 。
? 1953 Watson和 Crick建立了 DNA结构的双螺旋模型, 说明
了基因的结构, 信息和功能三者间的关系, 推动了分子生
物学的迅猛发展 。
? 1958 Crick提出遗传信息传递的中心法则 。
? 60年代 RNA研究取得大发展 （ 操纵子学说,遗传密码,逆转
录酶 ）,
核酸的研究历史和重要性
? 70年代 建立 DNA重组技术，改变了分子生物
学的面貌，并导致生物技术的兴起。
? 80年代 RNA研究出现第二次高潮：
ribozyme,反义 RNA,“RNA世界”假说等等
。
? 90年代以后 实施人类基因组计划（ HGP）,
开辟了生命科学新纪元。生命科学进入后基因
时代,
功能基因组学（ functional genomics）
蛋白质组学（ proteomics）
结构基因组学（ structural genomics）
RNA组学（ Rnomics） 或核糖核酸组学（
ribonomics）
三,RNA的种类和功能 9.4.2 RNA的种类和功能
? tRNA—— 在蛋白质合成过程中转运 AA
? rRNA—— 与蛋白质结合形成核糖体的前体
? mRNA—— 携带并传递 DNA中的遗传信息
? snRNA—— DNA转录及 hnRNA→mRNA 过程中起
调控作用。
tRNA的二、三级结构
Small RNAs
9.4.3 遗传密码及其特点
?遗传密码 —— DNA分子中核苷酸的排列
顺序与蛋白质中氨基酸排列顺序之间
的对应关系。遗传密码是由三个碱基
组成的，因此叫三联体密码。
?遗传密码的特点
?简并现象
?具有起始密码子和终止密码子
?具有连续可读性和不重叠性
?普遍通用性
AUG（ Met）
f-Met
GUG（ Val）
UAA
终止密码子 UAG
UGA
UAA,UAG,UGA
也可能编码 硒半胱
氨酸或 吡咯赖氨酸
遗传密码表
遗传密码通用性的例外情况
9.4.4 遗传信息的转录与 RNA的加工
?mRNA的转录（ mRNA的合成）
?mRNA合成后的加工
① 原核生物 —— 边转录边合成 Pr,无转录后加工
② 真核生物
A,hnRNA的加工剪接
B,mRNA的加帽和甲基化
C,mRNA的加尾
D,mRNA的转运
真
核
细
胞
信
息
流
动
9.4.5 蛋白质的生物合成
?合成场所
?合成体系 (合成起始、肽链延伸、翻译终止）
?合成后的加工与修饰 （肽链中 AA残基的化学修
饰,N端部分 AA的切除，信号肽的切除，肽链
的折叠，切除前体中功能不需要的肽段，二硫
键的形成等）
?合成后的贮存、转运与功能行使
翻译示意图
9.4.6 中心法则及其发展
?中心法则 —— 遗传信息从 DNA转录到 mRNA再翻译成蛋
白质，以及遗传信息从 DNA到 DNA的复制过程，这就是
分子生物学的中心法则。这一法则提示了基因的两个
基本属性：自我复制和控制蛋白质合成。
?尚需解决的问题
① hnRNA转录后加工？？？ mRNA
② mRNA 翻译 多肽？？？？ 蛋白质或亚基
？？？？
高级结构
逆转录过程中 cDNA的合成
9.4.7 基因表达调控
?原核生物基因表达调控
①正调控和负调控
② 乳糖操纵子
③色氨酸操纵子与衰减作用
④基因表达的时序调控
⑤ DNA序列重排的调控
?真核生物基因表达调控
① DNA及染色体水平的调控
②转录水平的调控（顺式作用元件和反式作用元件）
③转录后水平的调控（ RNA编辑,mRNA前体的选择性
拼接，反义 RNA的调控）
9.5 核酸研究技术简介
9.5.1 核酸分子杂交
9.5.2 DNA重组技术
9.5.3 基因文库与 cDNA文库
9.5.4 聚合酶链式反应 （ PCR）
9.5.5 核酸分子标记技术
9.5.6 DNA芯片 (DNA Chip)技术
9.5.7 蛋白质技术和核酸技术的相互增强
9.5.8 肽核酸及其性质
DNA杂交原理示意图 9.5.1 核酸分子杂交
? Southern印迹法
DNA分子 限制片段
限制性酶切
割
琼脂糖电泳
转移至硝酸纤维素膜
上
与放射性标记
DNA探针杂交
放射自显影
带有 DNA
片段的凝
胶
凝胶
滤膜
用缓冲
液转移
DNA
吸附有
DNA片段
的膜
? 原位杂交法 —— 筛选 DNA重组体 图解
复印至硝
酸纤维素
膜上
用 NaOH菌体裂
解 DNA变性
杂
交
放射自显影
32P-cDNA
与放射性 cDNA
杂交的菌落的
斑点
细菌菌落
单链 DNA
结合到膜
上
染色体, 原位抑制, 杂交 （ chromosome in situ suppression,CISS)
FISH,(Fluorescent In Situ Hybridization)
Foreign DNA to be
inserted
Plansmid
vector
Joining
Recombinant DNA
molecule
Introduction into host cells
by transformation of viral
infection
Host chromateme
Slection for cells coteining a
recombinant DNA molecule
Cloning
+
9.5.2 DNA重组技术
pBR322质粒的结构 Ti质粒结构
植物冠瘿
瘤
?噬菌体感染大肠杆菌的途径
胰岛素原的人工合成
胰脏
(A)n
胰岛素原 mRNA cDNA 重组质粒
转化细菌
mRNA
反转录酶
胰岛素原基因
与质粒
连接
感染
E.coli
胰岛素原
Ti质粒为载体的同源重组
I 二元载体系统
II 载体系统
III T-DNA的转移
与整合
Ti辅助质粒 Ti辅助 DNA给体质粒
Ti辅助 DNA给
体质粒
pBR型质粒（
给体质粒）
宿主特
异性
外源基因
宿主特
异性
整合
带有外源基
因的 Ti质粒 植物 DNA
Ti质粒转移并
插入植物 DNA
9.5.3 基因文库与 cDNA文库
?基因文库,是指整套由基因组 DNA片段插入克隆载体获得的
分子克隆之总和。应用 DNA重组技术，可以将各种生物体全
部基因组的遗传信息，贮存在可以长期保存的稳定重组体中
，以备需要时应用。好象将文献资料贮存于图书馆一样，所
以称其为 genomic library。
基因文库中应包含多少 DNA克隆才能使任意所需要的基因以极
高的概率存在于该文库中？其计算公式如下,
N=ln(1-p)/ln(1-f)
N ? 基因文库所包含克隆的数目；
p ? 任意所需基因存在于基因文库中的概率，要求大于 99%
f ? 克隆的 DNA片段大小（ bp） 占基因组大小 (bp)的分数。
现在已构建的基因组文库主要有
?BAC(细菌人工染色体 )，以细菌作为对象，将
DNA片段与质粒重组后转入细菌中繁殖。
?YAC(酵母人工染色体 )，以酵母作为对象。
? PAC(噬菌体人工染色体 ),以噬菌体作为对象。
?TAC(可转化的细菌人工染色体 )
? MAC(哺乳类人工染色体）
?cDNA文库
真核细胞基因是断裂的，在基因最后产物中表达的
编码序列（外显子）被非编码序列（内含子）分隔开，
需经 RNA转录后加工过程才使编码序列拼接在一起。真
核生物基因不能在原核生物中表达，只有将加工成熟的
mRNA反转录成 cDNA （ complemental DNA） 接上原核生
物表达控制元件，才能在原核生物中表达。再有，真核
生物的基因通常只有一小部分进行表达，由于 mRNA的不
稳定性，对基因表达和有关 mRNA都通常通过对其 cDNA来
进行研究的。 将细胞全部 mRNA反转录成 cDNA并被克隆的
总和称为 cDNA文库 。 RNA病毒的基因组是 RNA,也必须
将 RNA先转录成 cDNA,再建立文库。
为使低丰度的 mRNA的 cDNA克隆存在的概率大于 99%，
cDNA文库应含的克隆数的计算公式如下,
N=ln(1-p)/ln(1-1/n)
N? cDNA文库所包含克隆的数目；
p ? 低丰度 cDNA存在于基因文库中的概率,要求其
大于 99%；
1/n ? 每一种 低丰度的 mRNA占总 mRNA的分数。
?cDNA文库
基因文库和 cDNA文库的建立
引入大肠杆菌
组织
可克隆的 DNA
载体
DNA
cDNA
mRNA
部分或完全
酶解 DNA
DNA长度分级 甲基化，双链 接头 DNA
DNA与载体连接
鉴定文库的滴度和特性
扩增后供
长期储存
筛选出所需
要的克隆
基
因
文
库
的
构
建
9.5.4 聚合酶链式反应（ PCR）
?PCR原理
1985年, Mullis 发明了 PCR（ polymerase chain
reaction） 快速扩增 DNA的方法 。 该法模仿体内 DNA的复
制过程, 首先使 DNA变性, 两条链解开, 然后使引物模
板退火, 二者碱基配对, DNA聚合酶随即以 4种 dNTP为底
物, 在引物的引导下合成与模板互补的 DNA新链 。 重复
此过程, DNA以指数方式扩增 。 扩增的公式为,
Y=(1+X)n
式中, Y一产量 ; X--扩增效率 ; n一循环次数 。
?用于合成特异探针；
?用于 DNA的测序；
?将逆转录与 PCR相偶联（ RT-PCR）；
?用于基因定位诱变；
?未知序列的 PCR扩增；
?基因组序列的比较研究；
?用于临床诊断。
?PCR的应用
9.5.5 核酸分子标记技术
?限制性片段长度多态性 （ RFLP,restriction fragment length
polymorphism）
?随机扩增多态 DNA（ RAPD,random amplified polymorphic
DNA）
?扩增片段长度多态性 （ AFLP,amplified fragment length
polymorphism）
?简单串联重复序列 （ SSR,simple sequence repeat）
?单核苷酸多态性 （ SNP,simple nucleotide polymorphism）
? RFLP （ restriction fragment length polymorphism）
由限制性内切酶把很大的 DNA分子降解成许多长短不同
的较小片段，其数目和长度反映了限制性内切酶的切点在
DNA分子上的分布，它能作为某 DNA或含这种 DNA生物所
特有的“指纹”，不同个体的等位基因之间碱基代换、重排
、插入、缺失等都会引起这种“指纹”的多态性。
对于复杂的真核基因，要检测限制性片段长度多态性必
须借助于放射性同位素 (通常用 32p)或非放射性物质 (如地高辛
等 )标记的探针,与经限制性内切酶消化的基因组 DNA杂交,再
通过电泳显示限制性酶切片段的大小来检测不同遗传位点的
等位变异 (多态性 )。
例 1：人的 RFLP指纹分析
A为父亲的 DNA指纹图
谱,B为母亲的 DNA指纹
图谱,C为子 \女可能出现
的 DNA指纹图谱。图左、
右两侧的箭头表示子女
DNA指纹图中分别与其父
、母的 DNA指纹图谱中相
对应的分子杂交条带。
F1
A C B
♀ ♂
例 2：系统发育的 RFLP分析
A植物的 DNA限制性内切酶图谱
13 5 6 2 8
如果植物 A与祖先植物种相比变化很小，假设它发生了两个突变，一
个突变是形成植物 B的过程中产生了一个 9kp和 4kp的片段；另一个突变
是形成植物 C的过程中，一个限制性内切酶位点消失，产生一个 11kp的
内切酶片段，而 5kp和 6kp两条带消失。可以根据这些变化列出如右侧的
系统发育图。
A B C
13
2
4
11
8 9
6
5
琼脂糖电泳图谱
A B C
系统发育图谱
?RAPD （ random amplified polymorphic DNA）
RAPD是 1990年由 Williams等发明的。其方法是用一个随
机核苷酸序列（ 9-10bp） 为引物对基因组的 DNA进行 PCR扩
增，产生不连续的 DNA产物，再通过凝胶电泳来观察扩增片
段的多态性，获得特异分子标记。
RAPD只产生显性标记（即有或没有），所以不能用来鉴
定杂合体。 RAPD也不能单独的用来对没有基因标记的生物
进行遗传图谱分析，因为它所产生的多态性是随机的。
然而 RAPD比 RFLP有一定的优点：随机引物可在实验室空
间进行交换；免去 DNA分子杂交；对低拷贝序列同样灵敏；
操作自动化，可成为遗传图谱构建的普遍方法。
?AFLP （ amplified fragment length polymorphism）
AFLP是 RFLP和 PCR技术相结合产生的一种新技术。用限制
性内切酶消化基因组 DNA,由于不同材料的 DNA的酶切片段存
在差异，用特定引物选择性地扩增基因组限制性酶切片段，
再用凝胶电泳分离就可以观察基因组 DNA的多态性。该法避免
了使用繁杂的 DNA杂交技术，同时具有多态性丰富、不受环境
影响、无复等位效应、灵敏度高、快速高效等特点。
?简单串联重复序列 (simple sequence repeat, SSR)
这是一类由 1-5个核苷酸为重复单位组成的长达几十个
核苷酸的串联重复序列 （ 微卫星 DNA） 。 同一类微卫星 DNA
可分布在整个基因组的不同座位上, 由于重复次数不同或
重复程度不完全而形成每个座位的多态性, 这种多态性的
信息量是比较高的 。 在每个微卫星两端 DNA的序列多是相
对保守的单拷贝序列, 因此可以根据两端的序列设计一对
特异的引物, 扩增每个位点的微卫星序列,再经 PAGE电泳
,比较扩增产物的长短变化, 即可显示不同基因型的个体
在每个微卫星 DNA位点的多态性 。
? 单核苷酸多态性
(single nuclotide polymorphism,SNP ）
SNP是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异或
只有小的片段插入、缺失等。 据估计,每 500～ 1000个单核苷酸
会出现 1个单核苷酸多态性 (slngle nuclotide polymorphism
,SNP)。 实际上,所有遗传多态性的基础都是核苷酸的差异，
SNP有可能在密度上达到人类基因组多态位点数目的极限。
SNP与 RFLP和 SSR等 DNA标记的主要不同点是不再以长度的差
异作为检测手段，而直接以序列上单个核苷酸的变异为标记。
理论上,SNP可在核苷酸水平上把序列图、物理图与遗传图有
机地整合、统一起来。
DNA芯片 (DNA chip)技术是采用寡核苷酸原位合成或显微
打印手段，将数以万计的 DNA探针片段有序地固化于支持物表
面上，产生二维 DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，
反应结果通过检测杂交信号的方法（同位素法、化学荧光法、
化学发光法或酶标法）显示，再用精密的扫描仪或 CCD摄象技
术记录，通过计算机软件分析，综合成可读的 IC总信息，来
实现对生物样品的快速、并行、高效地检测或诊断。
芯片分析实际上也是传感器分析的组合。芯片阵列中的每
一个单元微点都是一个传感器的探头，所以传感器技术的精
髓往往都被用于芯片的发展。阵列检测可以大大提高检测效
率，减少工作量，增加可比性，所以芯片技术也是传感器技
术的发展。
9.5.6 DNA芯片技术简介
DNA芯片工作示意图
emission
Laser 1 Laser 2
computer
analysis
DNA clones test
reverse
transcription
Label with
fluor dyes PCR
amplification
purfication
hybridize target
to microarray
robotic
printing
reference
9.5.7 蛋白质技术和核酸技术的相互增强
插入表达载体 转化寄主细胞
推导出
AA顺序 制备合成肽 制备对所编码蛋白 专一的抗体 基因或cDNA
蛋白质
蛋白质
测定出
AA顺序
合成 cDNA
探针
制备专一的抗体 用 Western印迹法制备 DNA文库
用 Southern印迹法
筛选 DNA文库
基因或
cDNA
9.5.8 肽核酸
199l 年 Michael Egholm,Peter Nielen,Ole
Buchardet和 Rolf Berg在丹麦的哥本哈根大学将代表 DNA、
RNA遗传信息的碱基连在肽骨架上,由此诞生了一类新的分
子 — 肽核酸 （ Peptide Nucleic Acid,PNA） 。 肽核酸以其
特异性和稳定性高的优势, 在很多领域已取代了寡核苷酸如
作为探针, 反义药物等, 并开拓了一些新领域 。
? PNA的分子结构
? PNA的杂交性质及特点
? PNA的分子生物学效应
? PNA在分子生物学研究中的应用
? PNA在基因诊断和基因治疗中的研究
?PNA的分子结构
主链基本结构单位,
(2-氨基乙基 )甘氨酸
H2
DNA PNA
亚甲基羰基
? PNA的性质
?PNA与核酸结合的特点
?以 平行 或反平行方式与核酸结合
?高度的特异性 与亲和性（ Tm值高）
?不被核酸酶和蛋白酶所降解
?常以 链侵袭 （ Stand invasion） 方式与核酸结合
?PNA的 杂交性质
PNA能识别含互补碱基的靶序列，可与单链 DNA
(ssDNA),双链 DNA(dsDNA)及 RNA序列特异性杂交。
?PNA的杂交性质
? 与单链 DNA或 RNA杂交
PNA-DNA(或 RNA )
双螺旋
(嘌呤嘧啶混合
或纯嘌呤序列
PNA)
PNA-DNA(或 RNA)-
PNA 三螺旋
(纯嘧啶序列 PNA)
? 与双链 DNA杂交
(高比例胸腺嘧啶
的纯嘧啶序列
PNA)
PNA2-DNA三螺旋
(纯嘌呤序列 PNA)
PNA-DNA双螺旋
(富含胞嘧啶 PNA)
PNA-DNA2三螺旋
平行 PNA-DNA杂交链
P
P
B
B
5'
3'
PNA的链侵袭作用
DNA双螺旋 DNA\PNA
双螺旋 D环
DNA\PNA2
三螺旋 D环
PNA PNA
? PNA的分子生物学效应
?对核酸序列识别蛋白的影响
?对转录的调节 (反基因性质 )
?对基因表达的调节 (反义性质 )
?对逆转录抑制作用
? PNA介导的 dsDNA转录序列专一的 S1酶切割
DNA
PNA
核 酸 酶 S1 切 割 位点
DNA
PNA
核 酸 酶 S1 切 割 位 点
? PNA介导的转录
RNA聚合酶利
用 D环进行转
录 PNA
DNA
转录
在两段 PNA链与
dsDNA同一链结合
产生的 D环进行转录
转录
在两段 PNA链与
dsDNA相对链结合
产生的 D环进行转录
转录
转录
? PNA在分子生物学研究中的应用
?PNA杂交实验
?增强固相柱或生物磁粒亲和捕获力
?控制限制性内切酶的切割位点
?为反义研究提供新方法
?不测序列的点突变分析
? PNA在基因诊断和基因治疗中的研究
? 基因诊断
? PNA杂交探针
? DNA结构分析
? 点突变部位分析
? 基因治疗
? PNA进入细胞的方式 研究
? 基因治疗
? 基因调节药物研究
? 经载体的 PNA跨摸运送
受体单克
隆抗体
亲合素
生物素
PNA
生物素化 PNA和亲
合素转铁蛋白受体
单克隆抗体结合
PNA转铁蛋白复合
体与受体结合
受体介导 PNA
跨摸运送
9.6 人类基因组计划简介
（ Human Genome Project,HGP）
9.6.1 HGP大事记
9.6.2 HGP的科学目标
9.6.3 HGP的导向性意义
9.6.4 HGP面临的挑战
9.6.1 HGP大事记
?1985年,R.Sinsheime 在加州大学 Santa Cruz分校主持
会议, 讨论将人类基因组全部测序的可行性；同年,
Mullis发明了 PCR技术 。
?1986年,3月,美国能源部 (Department of Energy，
DOE)在新墨西哥州召开会议,讨论人类基因组测序计划 。
第一台 DNA自动测序仪问世 。
?1990年,NRC和 DOE宣布这一年的 10月 1日为人类基因组计
划的正式启动时间 。
?1992年：美国和法国的两支研究队伍分别完成了人类Ｙ
染色体和第 21条染色体的第一张物理图谱；随后又分别
完成了鼠和人的遗传图谱 。
9.6.1 HGP大事记 (续 )
?1993年,位于英国剑桥的 Sanger中心加入人类基因
组计划，并成为一个重要的测序中心。
?1994年：美国与法国完成了人类基因组中的第一个完
整遗传连接图谱
?1996年,各国科学家聚集在百慕大群岛，讨论并通
过了充分体现 HGP精神（全球共有，国际合作，即时
公布，免费共享）的百慕大原则。
?1997年：大肠杆菌基因组（ 5Mb） 全部测序完成，毛
细管测序仪上市。
?1998年,Venter宣布成立 Celera公司，并宣称将采
用, 全基因组鸟枪法”完成人类基因组的全部测序。
从此，人类基因组测序在, 公”, 私”之间展开了
激烈竞争； 同年,线虫基因组测序完成。
?1999年：中国获准参加 HGP,承担测定人类基因组 1%测序任务；
英国日本和美国共同完成了第一条人染色体 — 第 22条染色体的全
部测序工作。
?2000年,6月 26日, HGP与 Celera公司的领导人在白宫的庆祝仪
式上共同宣布了人类基因组工作框架图的完成, 并约定将双方的
研究成果同时发表 ; Celera公司完成了果蝇基因组 (180Ｍｂ )的
全部测序工作, 证明了, 全基因组鸟枪法, 的可行性；德国和日
本的科学家公布了人类第 21条染色体的测序结果；第一个植物基
因组 — 拟南芥基因组 （ 125Mb） 被全部测序 。
?2001年,HGP将人类基因组工作框架图发表在,Nature,上；
Celera公司则将其成果发表在,Science,上。, 工作框架图,
已能覆盖人类基因组的 97%，其中至少 92%的序列已组装得准确无
误，并显示其中只有 3万到 4万个编码蛋白质的基因，这是人类基
因组研究的一个重要里程碑。
9.6.1 HGP大事记 (续 )
9.6.2 HGP的科学目标
HGP使人类对自身的认识达到了一个前所未有的高度，其主要
的科学目标是绘制四张图,这四张图组成人类不同层次的、分子
水平的“第二张解剖图”，将成为人类认识自我的知识源泉。
? 遗传图
? 物理图
? 转录图
? 序列图
随着该目标的日趋实现，“功能基因组学”兴起,HGP研究
的重心逐步由结构向功能转移，即基因组功能信息的提取、鉴
定和开发利用，以及与此相关的数据资料和技术手段的储存和
使用。
? 遗传图
以具有遗传多态性的遗传标记为路标,以遗传学距离为图
距绘制的基因组图 。 此处的遗传多态性定义为在某个遗传位
点上具有一个以上的等位基因,且其在群体中出现的频率均高
于 1%。 而遗传学距离则是指在减数分裂事件中,两个位点之间
进行交换, 重组的百分率,并规定 1%的重组率为 1ｃＭ 。
多态性标志
第一代,限制性酶切片段长度多态性（ restriction
fragment length polymophism,RFLP）
第二代,简单序列长度多态性（ simple sequence length
polymophism,SSLP）
第三代,单个核苷酸多态性（ sequence tagged site,SNP）
? 物理图
以一段已知核苷酸序列的 DNA片段为标记,以 Mb
或 Kb作为图距绘制的基因组图 。 该 DNA片段称序列
标记位置 (sequence tagged site,STS)。
物理图的意义在于 STS可把经典遗传学与细胞遗
传学的位点信息转化为基因组位点的物理信息, 基
于 STS位点信息的相连片段群又提供了研究区域的
实验材料, 以这些片段的材料便可进行该区域的基
因组研究或在该区域寻找新基因 。
? 转录图
把 mRNA先分离、定位，再转录成 cDNA,这就
构成一张人类基因的转录图,cDNA片段又称表达
序列标签 (exprossed sequence tag,EST),因此
转录图也称为表达序列图。
由于 cDNA具有组织、生理与发育阶段的特异
性，因此 EST除提供序列信息外，同时也提供了该
基因表达的组织、生理状况与发育阶段的信息。
? 序列图
人类基因组核苷酸序列图即是分子水平的最高
层次的, 最详尽的物理图, 由总长度为 1ｍ左右,
约由 31亿核苷酸组成 。 当前, 人类基因组全序列
图实际上是一个, 代表性人类个体, 的序列图,
因为所有人类基因个体的基因位点都是相同的,不
同族种, 不同个体的基因差异,以及, 正常, 与,
致病, 基因的差异,只是同一位点上的等位基因的
差异 。
3,HGP对生命科学与生物产业发展的的导向性意义
?规模化
?序列化
?信息化
?产业化
?医学化
?人文化
9.6.4 HGP面临的挑战
?基因的隐私权问题
?基因组图谱和信息的使用与人的社会权利问题
?基因资源问题
?基因知识的滥用问题
9.7 遗传工程及其应用
9.7.1 基因工程
9.7.2 细胞工程
9.7.3 染色体工程
9.7.4 细胞器工程
9.7.1 基因工程的基本步骤及实施要点
?目的基因的制备
①鸟枪法（ shot gun）
②化学合成
③从 cDNA库中分离
④从基因组文库中分离
?载体的构建
①载体的选择
②限制性内切酶的选择
?目的基因与载体的重组
?重组体的导入
?目的基因的表达及筛选
①转化或转染
②高压电穿孔法
③ PEG(聚乙二醇 )介导
的原生质体转化法
④磷酸钙或 DEAE-葡聚
糖介导的转染
⑤原生质体融合
⑥脂质体法
⑦细胞显微注射法
复习思考题
本章要点求
9.1 DNA作为主要遗传物质的证据
9.2 DNA的结构、复制及其损伤修复
9.3 基因的概念与发展
9.4 遗传信息的表达与调控
9.5 核酸研究技术简介
9.6 人类基因组计划简介
9.7 遗传工程及其应用
复习思考题
本章要求
? DNA是主要遗传物质的间接证据与直接证据；
? DNA分子一级结构及双螺旋结构模型要点，
DNA复制的基本模型 (半保留半不连续性 )；
? 遗传信息传递的中心法则与发展；
? 转录、翻译的基本过程及机理；
? 基因概念的发展历程；
? 常用核酸研究技术；
? 基因工程的概念及其基本步骤。
9.1 DNA作为主要遗传物质的证据
9.1.1 染色体组成
9.1.2 遗传物质必须具备的条件
9.1.3 DNA是遗传物质的间接证据
9.1.4 DNA是遗传物质的直接证据
? 细菌转化试验
? 噬菌体侵染与繁殖试验
? 烟草花叶病毒拆合实验
9.1.1 染色体组成,
不同生物或同种生物不同组织细胞中染色体各成份
的含量是有差异的。
染色体
DNA
Pr
RNA 非组蛋白
组蛋白
如,豌豆 染色体 DNA（ 36.5%） Pr（ 44.9%）
RNA（ 9.4%） 非组蛋白（ 7.4%）
组蛋白（ 37.5%）
大鼠肝细胞 染色体
DNA∶ 组蛋白 ≈1∶1
DNA∶RNA ≈1∶0.1
DNA∶ 非组蛋白 ≈1∶0.6
?普遍性
?具有世代延续性
?具有相对稳定性和可塑性
?具有多样性
9.1.2 遗传物质必须具备的条件
9.1.3 DNA是遗传物质的间接证据
?DNA普遍存在于生物体内含量恒定。
?配子中 DNA的含量恰好是体细胞的一半。
?DNA结构的变化与突变具有一致性。
?DNA在代谢上较稳定。
?DNA能自我复制，具有世代的延续性。
9.1.4 DNA是遗传物质的直接证据
1928年，英国微生物学家 Griffith.F做了肺炎双球菌的转化实验
② Avery的转化实验
说明 DNA不受
蛋白酶, 多糖
酶和核糖核酸
酶 （ Rnase）
的影响, 而只
能为 DNA酶所
破坏, 首次证
明了遗传物质
是 DNA。
（二）,噬菌体侵染与繁殖试验 (Hershey和 Chase 1952） ? 噬菌体侵染与繁殖试验
该实验
表明在
不含 DNA
的某些
病毒中，
RNA是遗
传物质。
?烟草花叶病毒拆合实验
(Heinz Fraenkel-Conrat和 B,Singre,1957)
9.2 DNA的结构、复制及其损伤修复
9.2.1 DNA的结构
9.2.2 DNA的复制 —— 半保留半不连续复制
9.2.3 DNA的损伤修复
?光复活
?切除修复
?重组修复
?诱导修复和应急反应（ SOS修复）
9.2.1 DNA的结构
? DNA结构的确定
?1869年 Miescher测定淋巴细胞中蛋白，发现和定
名 Nuclein 核素 ； 1875年提出核素的实验式。
?Altman建立了制备不含蛋白的核素的方法，并定
名为 Nucleic acid。
?Kessel研究了核酸的化学组成，分离出 四种 碱基。
明确提出核酸具有含氮碱基 (1910年获诺贝尔奖 )。
?1909年 Levene.P.A发现酵母的核酸含有核糖，以
后他又发现脱氧核糖，正确指出了核酸的糖基组
成, 核苷、核苷酸的分子结构。
Levene 的四核苷酸假说
1950年,Chargaff.E推翻了四核苷酸假说
Chargaff’s 定则
? 当量定律,A＋ G=T+C
? DNA碱基组成具有物种特异性，而无组织特异性。
? DNA 双螺旋结构的发现
对 DNA 双螺旋结构的发现作出重大贡献的四位科学家
物理学家 Francis Crick
生物学家 James Watson
物理学家 Maurice Wilkins
化学家 Rosalind Franklin
由于 Franklin 过早的去世, 1962年，诺贝尔生理和医
学奖只授给了前面 Crick, Watson 和 Wilkins三位。
Frankeline 早期所拍
的 DNA X光结构照片
1953年,Watson和 Crick确立了
正确的碱基分子 A和 T,C和 G的
配对模型，并从 X光照片确认，
两条骨架链是反平行的，从而
创建了 DNA双螺旋结构模型。这
一模型，也得到 WILkins和
Franklin的认可。当年 4月 25日，
自然杂志发表了 Crick 和
Watson的论文，同时也发表了
Wilkins 和 Franklin与他们的
合作者分别写的两篇实验结果
的论文。
? DNA 双螺旋结构的发现
Watson,Crick的 DNA双螺旋结构
DNA双螺旋结构
9.3 基因的概念与发展
?1865年,Mendel—— 遗传因子
?1909年，丹麦 Johanssen—— 基因
?1915～ 1928年,Morgan等认为基因是以念珠
状直线排列在染色体上的三维一体的一种化
学实体。即基因是功能的基本单位、是突变
的基本单位、是交换的基本单位，基因是不
可再分的。
?1944年,G.Beadle和 E.Tatum 通过研究脉胞
菌突变，提出,一基因一酶 假说。
9.4 基因的概念与发展
? 1944年,Avery首次证实基因的化学本质是 DNA。
? 1953年提出了 DNA双螺旋结构模型，认为基因是具有一
定遗传效应的 DNA片段。
? 1955年,Benzer通过顺反互补测验（确定两次不同的
基因突变是否发生在同一基因内）发现一个基因内部
的许多位点都可以发生突变，并且也可能在这些位点
间发生交换，说明一个基因并不是一个突变单位和一
个交换单位。因而又把基因称为顺反子。
Benzer （ 1955） 的互补实验
基因的顺反子测试示意图
基因内互补作用机理图解
?One Gene,One Protein； One Gene,One Polypeptide Chain
研究血红蛋白时发现，正常 HbA有四条多肽链（ 2条 ?链，两条 ?
链） Vernon M.Ingram证明 ?链第六位氨基酸 HbA是谷氨酸,HbS
是缬氨酸（ 镰刀形细胞贫血症）。
这是证明基因与氨基酸之间存在直接对应关系的第一个直接证据。
?操纵子的发现修正了有一个基因就有一条多肽或决定
一个蛋白质功能的就是一个基因的说法。
?60年代,Jacod和 Monod研究细菌基因调控时发现基因
是可分的，功能上是有差别的。
结构基因 —— 决定合成某种蛋白质
调节基因 —— 编码阻遏或激活结构基因转录的蛋白质
基因
无翻译产物的基因
?新的发现 —— 断裂基因，重叠基因，跳跃基因
?比较 DNA序列和成熟 mRNA—— 内含子和外显子
9.4 基因的概念与发展
9.4 基因的概念与发展
综上所述，对基因可作如下描述,
①基因是实体，它的物质基础是 DNA（ 或 RNA）；
② 基因是具有特定遗传效应的 DNA片段 （ DNA分子中的特
定核苷酸序列）；
③ 基因是遗传信息传递和性状分化发育的依据；
④ 基因是可分的，按其功能（基因的产物）基因可分为
编码蛋白质的基因（结构基因 +调节基因）
无翻译产物的基因（如 rRNA, tRNA, snRNA ）
不转录的 DNA区段（如启动子，操纵基因等）
9.4 遗传信息的表达与调控
9.4.1 DNA的功能
9.4.2 RNA的种类和功能
9.4.3 遗传密码及其特点
9.4.4 遗传信息的转录与 RNA的加工
9.4.5 蛋白质的生物合成
9.4.6 中心法则及其发展
9.4.7 基因表达调控
一、蛋白质的结构和功能
（一）蛋白质的一级结构与功能的关系
（二）蛋白质的高级结构与功能的关系
（三）分子构象病
氨
基
酸
一
级
结
构
二级结构
结构域
三
级
结
构
四
级
结
构
二,DNA的功能
?自体催化 —— 复制
?异体催化 —— 转录
9.4.1 DNA的功能
核酸的研究历史和重要性
? 1869 Miescher从脓细胞的细胞核中分离出了一 种含磷酸
的有机物, 当时称为核素 （ nuclein）,后称为核酸 （
nucleic acid） ； 此后几十年内, 弄清了核酸的组成及在
细胞中的分布 。
? 1944 Avery 等成功进行肺炎球菌转化试验； 1952年
Hershey等的实验表明 32P-DNA可进入噬菌体内, 证明 DNA是
遗传物质 。
? 1953 Watson和 Crick建立了 DNA结构的双螺旋模型, 说明
了基因的结构, 信息和功能三者间的关系, 推动了分子生
物学的迅猛发展 。
? 1958 Crick提出遗传信息传递的中心法则 。
? 60年代 RNA研究取得大发展 （ 操纵子学说,遗传密码,逆转
录酶 ）,
核酸的研究历史和重要性
? 70年代 建立 DNA重组技术，改变了分子生物
学的面貌，并导致生物技术的兴起。
? 80年代 RNA研究出现第二次高潮：
ribozyme,反义 RNA,“RNA世界”假说等等
。
? 90年代以后 实施人类基因组计划（ HGP）,
开辟了生命科学新纪元。生命科学进入后基因
时代,
功能基因组学（ functional genomics）
蛋白质组学（ proteomics）
结构基因组学（ structural genomics）
RNA组学（ Rnomics） 或核糖核酸组学（
ribonomics）
三,RNA的种类和功能 9.4.2 RNA的种类和功能
? tRNA—— 在蛋白质合成过程中转运 AA
? rRNA—— 与蛋白质结合形成核糖体的前体
? mRNA—— 携带并传递 DNA中的遗传信息
? snRNA—— DNA转录及 hnRNA→mRNA 过程中起
调控作用。
tRNA的二、三级结构
Small RNAs
9.4.3 遗传密码及其特点
?遗传密码 —— DNA分子中核苷酸的排列
顺序与蛋白质中氨基酸排列顺序之间
的对应关系。遗传密码是由三个碱基
组成的，因此叫三联体密码。
?遗传密码的特点
?简并现象
?具有起始密码子和终止密码子
?具有连续可读性和不重叠性
?普遍通用性
AUG（ Met）
f-Met
GUG（ Val）
UAA
终止密码子 UAG
UGA
UAA,UAG,UGA
也可能编码 硒半胱
氨酸或 吡咯赖氨酸
遗传密码表
遗传密码通用性的例外情况
9.4.4 遗传信息的转录与 RNA的加工
?mRNA的转录（ mRNA的合成）
?mRNA合成后的加工
① 原核生物 —— 边转录边合成 Pr,无转录后加工
② 真核生物
A,hnRNA的加工剪接
B,mRNA的加帽和甲基化
C,mRNA的加尾
D,mRNA的转运
真
核
细
胞
信
息
流
动
9.4.5 蛋白质的生物合成
?合成场所
?合成体系 (合成起始、肽链延伸、翻译终止）
?合成后的加工与修饰 （肽链中 AA残基的化学修
饰,N端部分 AA的切除，信号肽的切除，肽链
的折叠，切除前体中功能不需要的肽段，二硫
键的形成等）
?合成后的贮存、转运与功能行使
翻译示意图
9.4.6 中心法则及其发展
?中心法则 —— 遗传信息从 DNA转录到 mRNA再翻译成蛋
白质，以及遗传信息从 DNA到 DNA的复制过程，这就是
分子生物学的中心法则。这一法则提示了基因的两个
基本属性：自我复制和控制蛋白质合成。
?尚需解决的问题
① hnRNA转录后加工？？？ mRNA
② mRNA 翻译 多肽？？？？ 蛋白质或亚基
？？？？
高级结构
逆转录过程中 cDNA的合成
9.4.7 基因表达调控
?原核生物基因表达调控
①正调控和负调控
② 乳糖操纵子
③色氨酸操纵子与衰减作用
④基因表达的时序调控
⑤ DNA序列重排的调控
?真核生物基因表达调控
① DNA及染色体水平的调控
②转录水平的调控（顺式作用元件和反式作用元件）
③转录后水平的调控（ RNA编辑,mRNA前体的选择性
拼接，反义 RNA的调控）
9.5 核酸研究技术简介
9.5.1 核酸分子杂交
9.5.2 DNA重组技术
9.5.3 基因文库与 cDNA文库
9.5.4 聚合酶链式反应 （ PCR）
9.5.5 核酸分子标记技术
9.5.6 DNA芯片 (DNA Chip)技术
9.5.7 蛋白质技术和核酸技术的相互增强
9.5.8 肽核酸及其性质
DNA杂交原理示意图 9.5.1 核酸分子杂交
? Southern印迹法
DNA分子 限制片段
限制性酶切
割
琼脂糖电泳
转移至硝酸纤维素膜
上
与放射性标记
DNA探针杂交
放射自显影
带有 DNA
片段的凝
胶
凝胶
滤膜
用缓冲
液转移
DNA
吸附有
DNA片段
的膜
? 原位杂交法 —— 筛选 DNA重组体 图解
复印至硝
酸纤维素
膜上
用 NaOH菌体裂
解 DNA变性
杂
交
放射自显影
32P-cDNA
与放射性 cDNA
杂交的菌落的
斑点
细菌菌落
单链 DNA
结合到膜
上
染色体, 原位抑制, 杂交 （ chromosome in situ suppression,CISS)
FISH,(Fluorescent In Situ Hybridization)
Foreign DNA to be
inserted
Plansmid
vector
Joining
Recombinant DNA
molecule
Introduction into host cells
by transformation of viral
infection
Host chromateme
Slection for cells coteining a
recombinant DNA molecule
Cloning
+
9.5.2 DNA重组技术
pBR322质粒的结构 Ti质粒结构
植物冠瘿
瘤
?噬菌体感染大肠杆菌的途径
胰岛素原的人工合成
胰脏
(A)n
胰岛素原 mRNA cDNA 重组质粒
转化细菌
mRNA
反转录酶
胰岛素原基因
与质粒
连接
感染
E.coli
胰岛素原
Ti质粒为载体的同源重组
I 二元载体系统
II 载体系统
III T-DNA的转移
与整合
Ti辅助质粒 Ti辅助 DNA给体质粒
Ti辅助 DNA给
体质粒
pBR型质粒（
给体质粒）
宿主特
异性
外源基因
宿主特
异性
整合
带有外源基
因的 Ti质粒 植物 DNA
Ti质粒转移并
插入植物 DNA
9.5.3 基因文库与 cDNA文库
?基因文库,是指整套由基因组 DNA片段插入克隆载体获得的
分子克隆之总和。应用 DNA重组技术，可以将各种生物体全
部基因组的遗传信息，贮存在可以长期保存的稳定重组体中
，以备需要时应用。好象将文献资料贮存于图书馆一样，所
以称其为 genomic library。
基因文库中应包含多少 DNA克隆才能使任意所需要的基因以极
高的概率存在于该文库中？其计算公式如下,
N=ln(1-p)/ln(1-f)
N ? 基因文库所包含克隆的数目；
p ? 任意所需基因存在于基因文库中的概率，要求大于 99%
f ? 克隆的 DNA片段大小（ bp） 占基因组大小 (bp)的分数。
现在已构建的基因组文库主要有
?BAC(细菌人工染色体 )，以细菌作为对象，将
DNA片段与质粒重组后转入细菌中繁殖。
?YAC(酵母人工染色体 )，以酵母作为对象。
? PAC(噬菌体人工染色体 ),以噬菌体作为对象。
?TAC(可转化的细菌人工染色体 )
? MAC(哺乳类人工染色体）
?cDNA文库
真核细胞基因是断裂的，在基因最后产物中表达的
编码序列（外显子）被非编码序列（内含子）分隔开，
需经 RNA转录后加工过程才使编码序列拼接在一起。真
核生物基因不能在原核生物中表达，只有将加工成熟的
mRNA反转录成 cDNA （ complemental DNA） 接上原核生
物表达控制元件，才能在原核生物中表达。再有，真核
生物的基因通常只有一小部分进行表达，由于 mRNA的不
稳定性，对基因表达和有关 mRNA都通常通过对其 cDNA来
进行研究的。 将细胞全部 mRNA反转录成 cDNA并被克隆的
总和称为 cDNA文库 。 RNA病毒的基因组是 RNA,也必须
将 RNA先转录成 cDNA,再建立文库。
为使低丰度的 mRNA的 cDNA克隆存在的概率大于 99%，
cDNA文库应含的克隆数的计算公式如下,
N=ln(1-p)/ln(1-1/n)
N? cDNA文库所包含克隆的数目；
p ? 低丰度 cDNA存在于基因文库中的概率,要求其
大于 99%；
1/n ? 每一种 低丰度的 mRNA占总 mRNA的分数。
?cDNA文库
基因文库和 cDNA文库的建立
引入大肠杆菌
组织
可克隆的 DNA
载体
DNA
cDNA
mRNA
部分或完全
酶解 DNA
DNA长度分级 甲基化，双链 接头 DNA
DNA与载体连接
鉴定文库的滴度和特性
扩增后供
长期储存
筛选出所需
要的克隆
基
因
文
库
的
构
建
9.5.4 聚合酶链式反应（ PCR）
?PCR原理
1985年, Mullis 发明了 PCR（ polymerase chain
reaction） 快速扩增 DNA的方法 。 该法模仿体内 DNA的复
制过程, 首先使 DNA变性, 两条链解开, 然后使引物模
板退火, 二者碱基配对, DNA聚合酶随即以 4种 dNTP为底
物, 在引物的引导下合成与模板互补的 DNA新链 。 重复
此过程, DNA以指数方式扩增 。 扩增的公式为,
Y=(1+X)n
式中, Y一产量 ; X--扩增效率 ; n一循环次数 。
?用于合成特异探针；
?用于 DNA的测序；
?将逆转录与 PCR相偶联（ RT-PCR）；
?用于基因定位诱变；
?未知序列的 PCR扩增；
?基因组序列的比较研究；
?用于临床诊断。
?PCR的应用
9.5.5 核酸分子标记技术
?限制性片段长度多态性 （ RFLP,restriction fragment length
polymorphism）
?随机扩增多态 DNA（ RAPD,random amplified polymorphic
DNA）
?扩增片段长度多态性 （ AFLP,amplified fragment length
polymorphism）
?简单串联重复序列 （ SSR,simple sequence repeat）
?单核苷酸多态性 （ SNP,simple nucleotide polymorphism）
? RFLP （ restriction fragment length polymorphism）
由限制性内切酶把很大的 DNA分子降解成许多长短不同
的较小片段，其数目和长度反映了限制性内切酶的切点在
DNA分子上的分布，它能作为某 DNA或含这种 DNA生物所
特有的“指纹”，不同个体的等位基因之间碱基代换、重排
、插入、缺失等都会引起这种“指纹”的多态性。
对于复杂的真核基因，要检测限制性片段长度多态性必
须借助于放射性同位素 (通常用 32p)或非放射性物质 (如地高辛
等 )标记的探针,与经限制性内切酶消化的基因组 DNA杂交,再
通过电泳显示限制性酶切片段的大小来检测不同遗传位点的
等位变异 (多态性 )。
例 1：人的 RFLP指纹分析
A为父亲的 DNA指纹图
谱,B为母亲的 DNA指纹
图谱,C为子 \女可能出现
的 DNA指纹图谱。图左、
右两侧的箭头表示子女
DNA指纹图中分别与其父
、母的 DNA指纹图谱中相
对应的分子杂交条带。
F1
A C B
♀ ♂
例 2：系统发育的 RFLP分析
A植物的 DNA限制性内切酶图谱
13 5 6 2 8
如果植物 A与祖先植物种相比变化很小，假设它发生了两个突变，一
个突变是形成植物 B的过程中产生了一个 9kp和 4kp的片段；另一个突变
是形成植物 C的过程中，一个限制性内切酶位点消失，产生一个 11kp的
内切酶片段，而 5kp和 6kp两条带消失。可以根据这些变化列出如右侧的
系统发育图。
A B C
13
2
4
11
8 9
6
5
琼脂糖电泳图谱
A B C
系统发育图谱
?RAPD （ random amplified polymorphic DNA）
RAPD是 1990年由 Williams等发明的。其方法是用一个随
机核苷酸序列（ 9-10bp） 为引物对基因组的 DNA进行 PCR扩
增，产生不连续的 DNA产物，再通过凝胶电泳来观察扩增片
段的多态性，获得特异分子标记。
RAPD只产生显性标记（即有或没有），所以不能用来鉴
定杂合体。 RAPD也不能单独的用来对没有基因标记的生物
进行遗传图谱分析，因为它所产生的多态性是随机的。
然而 RAPD比 RFLP有一定的优点：随机引物可在实验室空
间进行交换；免去 DNA分子杂交；对低拷贝序列同样灵敏；
操作自动化，可成为遗传图谱构建的普遍方法。
?AFLP （ amplified fragment length polymorphism）
AFLP是 RFLP和 PCR技术相结合产生的一种新技术。用限制
性内切酶消化基因组 DNA,由于不同材料的 DNA的酶切片段存
在差异，用特定引物选择性地扩增基因组限制性酶切片段，
再用凝胶电泳分离就可以观察基因组 DNA的多态性。该法避免
了使用繁杂的 DNA杂交技术，同时具有多态性丰富、不受环境
影响、无复等位效应、灵敏度高、快速高效等特点。
?简单串联重复序列 (simple sequence repeat, SSR)
这是一类由 1-5个核苷酸为重复单位组成的长达几十个
核苷酸的串联重复序列 （ 微卫星 DNA） 。 同一类微卫星 DNA
可分布在整个基因组的不同座位上, 由于重复次数不同或
重复程度不完全而形成每个座位的多态性, 这种多态性的
信息量是比较高的 。 在每个微卫星两端 DNA的序列多是相
对保守的单拷贝序列, 因此可以根据两端的序列设计一对
特异的引物, 扩增每个位点的微卫星序列,再经 PAGE电泳
,比较扩增产物的长短变化, 即可显示不同基因型的个体
在每个微卫星 DNA位点的多态性 。
? 单核苷酸多态性
(single nuclotide polymorphism,SNP ）
SNP是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异或
只有小的片段插入、缺失等。 据估计,每 500～ 1000个单核苷酸
会出现 1个单核苷酸多态性 (slngle nuclotide polymorphism
,SNP)。 实际上,所有遗传多态性的基础都是核苷酸的差异，
SNP有可能在密度上达到人类基因组多态位点数目的极限。
SNP与 RFLP和 SSR等 DNA标记的主要不同点是不再以长度的差
异作为检测手段，而直接以序列上单个核苷酸的变异为标记。
理论上,SNP可在核苷酸水平上把序列图、物理图与遗传图有
机地整合、统一起来。
DNA芯片 (DNA chip)技术是采用寡核苷酸原位合成或显微
打印手段，将数以万计的 DNA探针片段有序地固化于支持物表
面上，产生二维 DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，
反应结果通过检测杂交信号的方法（同位素法、化学荧光法、
化学发光法或酶标法）显示，再用精密的扫描仪或 CCD摄象技
术记录，通过计算机软件分析，综合成可读的 IC总信息，来
实现对生物样品的快速、并行、高效地检测或诊断。
芯片分析实际上也是传感器分析的组合。芯片阵列中的每
一个单元微点都是一个传感器的探头，所以传感器技术的精
髓往往都被用于芯片的发展。阵列检测可以大大提高检测效
率，减少工作量，增加可比性，所以芯片技术也是传感器技
术的发展。
9.5.6 DNA芯片技术简介
DNA芯片工作示意图
emission
Laser 1 Laser 2
computer
analysis
DNA clones test
reverse
transcription
Label with
fluor dyes PCR
amplification
purfication
hybridize target
to microarray
robotic
printing
reference
9.5.7 蛋白质技术和核酸技术的相互增强
插入表达载体 转化寄主细胞
推导出
AA顺序 制备合成肽 制备对所编码蛋白 专一的抗体 基因或cDNA
蛋白质
蛋白质
测定出
AA顺序
合成 cDNA
探针
制备专一的抗体 用 Western印迹法制备 DNA文库
用 Southern印迹法
筛选 DNA文库
基因或
cDNA
9.5.8 肽核酸
199l 年 Michael Egholm,Peter Nielen,Ole
Buchardet和 Rolf Berg在丹麦的哥本哈根大学将代表 DNA、
RNA遗传信息的碱基连在肽骨架上,由此诞生了一类新的分
子 — 肽核酸 （ Peptide Nucleic Acid,PNA） 。 肽核酸以其
特异性和稳定性高的优势, 在很多领域已取代了寡核苷酸如
作为探针, 反义药物等, 并开拓了一些新领域 。
? PNA的分子结构
? PNA的杂交性质及特点
? PNA的分子生物学效应
? PNA在分子生物学研究中的应用
? PNA在基因诊断和基因治疗中的研究
?PNA的分子结构
主链基本结构单位,
(2-氨基乙基 )甘氨酸
H2
DNA PNA
亚甲基羰基
? PNA的性质
?PNA与核酸结合的特点
?以 平行 或反平行方式与核酸结合
?高度的特异性 与亲和性（ Tm值高）
?不被核酸酶和蛋白酶所降解
?常以 链侵袭 （ Stand invasion） 方式与核酸结合
?PNA的 杂交性质
PNA能识别含互补碱基的靶序列，可与单链 DNA
(ssDNA),双链 DNA(dsDNA)及 RNA序列特异性杂交。
?PNA的杂交性质
? 与单链 DNA或 RNA杂交
PNA-DNA(或 RNA )
双螺旋
(嘌呤嘧啶混合
或纯嘌呤序列
PNA)
PNA-DNA(或 RNA)-
PNA 三螺旋
(纯嘧啶序列 PNA)
? 与双链 DNA杂交
(高比例胸腺嘧啶
的纯嘧啶序列
PNA)
PNA2-DNA三螺旋
(纯嘌呤序列 PNA)
PNA-DNA双螺旋
(富含胞嘧啶 PNA)
PNA-DNA2三螺旋
平行 PNA-DNA杂交链
P
P
B
B
5'
3'
PNA的链侵袭作用
DNA双螺旋 DNA\PNA
双螺旋 D环
DNA\PNA2
三螺旋 D环
PNA PNA
? PNA的分子生物学效应
?对核酸序列识别蛋白的影响
?对转录的调节 (反基因性质 )
?对基因表达的调节 (反义性质 )
?对逆转录抑制作用
? PNA介导的 dsDNA转录序列专一的 S1酶切割
DNA
PNA
核 酸 酶 S1 切 割 位点
DNA
PNA
核 酸 酶 S1 切 割 位 点
? PNA介导的转录
RNA聚合酶利
用 D环进行转
录 PNA
DNA
转录
在两段 PNA链与
dsDNA同一链结合
产生的 D环进行转录
转录
在两段 PNA链与
dsDNA相对链结合
产生的 D环进行转录
转录
转录
? PNA在分子生物学研究中的应用
?PNA杂交实验
?增强固相柱或生物磁粒亲和捕获力
?控制限制性内切酶的切割位点
?为反义研究提供新方法
?不测序列的点突变分析
? PNA在基因诊断和基因治疗中的研究
? 基因诊断
? PNA杂交探针
? DNA结构分析
? 点突变部位分析
? 基因治疗
? PNA进入细胞的方式 研究
? 基因治疗
? 基因调节药物研究
? 经载体的 PNA跨摸运送
受体单克
隆抗体
亲合素
生物素
PNA
生物素化 PNA和亲
合素转铁蛋白受体
单克隆抗体结合
PNA转铁蛋白复合
体与受体结合
受体介导 PNA
跨摸运送
9.6 人类基因组计划简介
（ Human Genome Project,HGP）
9.6.1 HGP大事记
9.6.2 HGP的科学目标
9.6.3 HGP的导向性意义
9.6.4 HGP面临的挑战
9.6.1 HGP大事记
?1985年,R.Sinsheime 在加州大学 Santa Cruz分校主持
会议, 讨论将人类基因组全部测序的可行性；同年,
Mullis发明了 PCR技术 。
?1986年,3月,美国能源部 (Department of Energy，
DOE)在新墨西哥州召开会议,讨论人类基因组测序计划 。
第一台 DNA自动测序仪问世 。
?1990年,NRC和 DOE宣布这一年的 10月 1日为人类基因组计
划的正式启动时间 。
?1992年：美国和法国的两支研究队伍分别完成了人类Ｙ
染色体和第 21条染色体的第一张物理图谱；随后又分别
完成了鼠和人的遗传图谱 。
9.6.1 HGP大事记 (续 )
?1993年,位于英国剑桥的 Sanger中心加入人类基因
组计划，并成为一个重要的测序中心。
?1994年：美国与法国完成了人类基因组中的第一个完
整遗传连接图谱
?1996年,各国科学家聚集在百慕大群岛，讨论并通
过了充分体现 HGP精神（全球共有，国际合作，即时
公布，免费共享）的百慕大原则。
?1997年：大肠杆菌基因组（ 5Mb） 全部测序完成，毛
细管测序仪上市。
?1998年,Venter宣布成立 Celera公司，并宣称将采
用, 全基因组鸟枪法”完成人类基因组的全部测序。
从此，人类基因组测序在, 公”, 私”之间展开了
激烈竞争； 同年,线虫基因组测序完成。
?1999年：中国获准参加 HGP,承担测定人类基因组 1%测序任务；
英国日本和美国共同完成了第一条人染色体 — 第 22条染色体的全
部测序工作。
?2000年,6月 26日, HGP与 Celera公司的领导人在白宫的庆祝仪
式上共同宣布了人类基因组工作框架图的完成, 并约定将双方的
研究成果同时发表 ; Celera公司完成了果蝇基因组 (180Ｍｂ )的
全部测序工作, 证明了, 全基因组鸟枪法, 的可行性；德国和日
本的科学家公布了人类第 21条染色体的测序结果；第一个植物基
因组 — 拟南芥基因组 （ 125Mb） 被全部测序 。
?2001年,HGP将人类基因组工作框架图发表在,Nature,上；
Celera公司则将其成果发表在,Science,上。, 工作框架图,
已能覆盖人类基因组的 97%，其中至少 92%的序列已组装得准确无
误，并显示其中只有 3万到 4万个编码蛋白质的基因，这是人类基
因组研究的一个重要里程碑。
9.6.1 HGP大事记 (续 )
9.6.2 HGP的科学目标
HGP使人类对自身的认识达到了一个前所未有的高度，其主要
的科学目标是绘制四张图,这四张图组成人类不同层次的、分子
水平的“第二张解剖图”，将成为人类认识自我的知识源泉。
? 遗传图
? 物理图
? 转录图
? 序列图
随着该目标的日趋实现，“功能基因组学”兴起,HGP研究
的重心逐步由结构向功能转移，即基因组功能信息的提取、鉴
定和开发利用，以及与此相关的数据资料和技术手段的储存和
使用。
? 遗传图
以具有遗传多态性的遗传标记为路标,以遗传学距离为图
距绘制的基因组图 。 此处的遗传多态性定义为在某个遗传位
点上具有一个以上的等位基因,且其在群体中出现的频率均高
于 1%。 而遗传学距离则是指在减数分裂事件中,两个位点之间
进行交换, 重组的百分率,并规定 1%的重组率为 1ｃＭ 。
多态性标志
第一代,限制性酶切片段长度多态性（ restriction
fragment length polymophism,RFLP）
第二代,简单序列长度多态性（ simple sequence length
polymophism,SSLP）
第三代,单个核苷酸多态性（ sequence tagged site,SNP）
? 物理图
以一段已知核苷酸序列的 DNA片段为标记,以 Mb
或 Kb作为图距绘制的基因组图 。 该 DNA片段称序列
标记位置 (sequence tagged site,STS)。
物理图的意义在于 STS可把经典遗传学与细胞遗
传学的位点信息转化为基因组位点的物理信息, 基
于 STS位点信息的相连片段群又提供了研究区域的
实验材料, 以这些片段的材料便可进行该区域的基
因组研究或在该区域寻找新基因 。
? 转录图
把 mRNA先分离、定位，再转录成 cDNA,这就
构成一张人类基因的转录图,cDNA片段又称表达
序列标签 (exprossed sequence tag,EST),因此
转录图也称为表达序列图。
由于 cDNA具有组织、生理与发育阶段的特异
性，因此 EST除提供序列信息外，同时也提供了该
基因表达的组织、生理状况与发育阶段的信息。
? 序列图
人类基因组核苷酸序列图即是分子水平的最高
层次的, 最详尽的物理图, 由总长度为 1ｍ左右,
约由 31亿核苷酸组成 。 当前, 人类基因组全序列
图实际上是一个, 代表性人类个体, 的序列图,
因为所有人类基因个体的基因位点都是相同的,不
同族种, 不同个体的基因差异,以及, 正常, 与,
致病, 基因的差异,只是同一位点上的等位基因的
差异 。
3,HGP对生命科学与生物产业发展的的导向性意义
?规模化
?序列化
?信息化
?产业化
?医学化
?人文化
9.6.4 HGP面临的挑战
?基因的隐私权问题
?基因组图谱和信息的使用与人的社会权利问题
?基因资源问题
?基因知识的滥用问题
9.7 遗传工程及其应用
9.7.1 基因工程
9.7.2 细胞工程
9.7.3 染色体工程
9.7.4 细胞器工程
9.7.1 基因工程的基本步骤及实施要点
?目的基因的制备
①鸟枪法（ shot gun）
②化学合成
③从 cDNA库中分离
④从基因组文库中分离
?载体的构建
①载体的选择
②限制性内切酶的选择
?目的基因与载体的重组
?重组体的导入
?目的基因的表达及筛选
①转化或转染
②高压电穿孔法
③ PEG(聚乙二醇 )介导
的原生质体转化法
④磷酸钙或 DEAE-葡聚
糖介导的转染
⑤原生质体融合
⑥脂质体法
⑦细胞显微注射法
复习思考题
