§7-1 吸光光度法的基本原理一、物质对光的选择性吸收光是一种电磁波，根据波长或频率大小分为X
射线、紫外、可见、红外、微波和无线电波。
第七章吸光光度法吸光光度法,基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法,包括比色法和分光光度法。
分光光度法的优点,灵敏、准确、快速、选择性好、适于微量组分的测定。
nλ
c
hhE == ν
紫外：200-400nm
可见：400-750nm
红外：0.75-50μm
10
-2
nm 10
0
nm 10
2
nm
10
4
nm
0.1 cm 10 cm 10
3
cm 10
5
cm
X-射线紫外可见红外微波无线电波单色光：单一波长的光。
复合光：由不同波长的光组成的光。
互补色光白光是由两种适当颜色的光按一定强度、比例混合而成的，这二种颜色的光称为互补色光，如黄色与兰色，黄绿色与紫色。
不同颜色的可见光波长及其互补光颜色λ/nm互补色光紫400—500黄绿蓝450—480黄绿蓝480—490橙蓝绿490—500红绿500—560红紫黄绿560—580紫黄580—610蓝橙610—650绿蓝红650—760蓝绿黄绿溶液呈现它所吸收光的互补色光的颜色。
吸收光谱曲线：
以波长为横坐标，吸光度为纵坐标得到的一条曲线。它反映某溶液对不同波长单色光的吸收程度。
在最大吸收波长处测定吸光度，则灵敏度最高。
1、λ
最大与c无关
2、A ∝ c (一定c范围内)
由于不同物质微粒具有不同的量子能级，其能量差也不同，因此物质对光的吸收具有选择性。
r
2
r
4
r
2
r
4
r
2
r
4
r
2
r
4
r
2
r
4
r
2
r
4
r
2
r
4
r
2
r
4
S
2
S
1
S
0
v
3
v
2
v
1
v'
2
v'
1
v''
1
分子能级示意图二、吸收的基本定律
1、朗伯—比尔定律
A=Kbc
1760年，Lambert用实验指出，当光通过透明介质时，光的减弱程度与光通过介质的光程成正比。
1850年，Beer研究证明了，光的吸收程度与透明介质中光所遇到的吸光质点的数目成正比，在溶液中即可与吸光质点的浓度成正比。
分级消光现象
16 8
32烛光
b
I
I
0
db
设薄层厚度db，面积S，照到薄层上的光强
I
b
，通过薄层后光减弱了dI
b
。
dv = S × db
吸光质点数dn=k'×c dv=k' × S × c × db
dI
b
∝ I
b
dI
b
∝ dn
-dI
b
=k''×I
b
× dn =K'' × I
b
× k' × c × S × db = k''' I
b
c db
o
I
I
T =
T
TI
I
A
o
lg
1
lglg?===
透光率吸光度
∫∫
==?
bI
I
b
b
bcKbcK
I
I
0
'"d'"
d
ο
Kbc
I
I
bcK
I
I
o
o
=?
=?
lg
'''ln
A=Kbc
2、光度分析的灵敏度
A=Kbc b：cm,c：mol/L
A=εbc ε：摩尔吸光系数，只与波长有关,
单位：L/cm·mol。
物理意义：一定λ下，b=1cm，c=1
mol/L 时的吸光度。
(1) 摩尔吸光系数实际工作中，不能用c=1mol/L的溶液测吸光度。在
b=1cm时，做工作曲线，斜率为ε。
一般ε：10
5
已很灵敏。
(2) 桑德尔灵敏度指数：S（μg/cm
2
）
在λ
max
时A=0.001下，单位截面积光程内所能检出吸光物质的最低含量。
S与ε关系
A= 0.001=ε bc
S = b(cm)×c(mol/dm
3
)×M(g/mol)×10
6
μg/g
ε
001.0
=bc
ε
ε
M
M
=
××
=
3
10001.0
(μg/cm
2
)
双硫腙与Pb的ε
Pb
为6.8×10
4
则
S= μg/cm
2
双硫腙与Cu 的ε
Cu
为4.52×10
4
则
S= μg/cm
2
灵敏度高
0030.0
207
=
ε
0014.0
5.63
=
ε
<例> Fe
2+
与邻二氮菲生成红色络合物，其ε为1.1×10
4
,Fe
2+
与磺基水杨酸络合物，其ε为5.8×10
3
，则前者的灵敏度高。
3．吸光度的加和性共存的两种吸光物质对同一波长的光的吸光度值分别为A
1
、A
2
，则总吸光度为；
A=A
1
+A
2
= ε
1
bc
1
+ ε
2
bc
2
4．偏离朗伯比尔定律的原因
（
1
）非单色光
A
1
=
ε
1
bc=lg
1
1o
I
I
I
1
=
bc
10
1
ε
A
2
=
ε
2
bc=lg
2
2o
I
I
I
2
=
bc
10
2
ε?
I
o2
A = lg
2o
2
1o
1
2o1o
21
o21o
I
bc
10I
bc
10
II
lg
II
II
ε?
+
ε?
+
=
+
+
若ε
1
=ε
2
则A=εbc若ε
1
≠ε
2
A与c不成线性关系。
I
o1
(2) 溶液本身物理化学性质引起
null 介质非均匀性
null 溶液本身离解、缔合、络合
HA A
-
+ H
+
M+L ML
ML+L ML
2
Cr
2
O
7
2-
+H
2
O 2CrO
4
2-
+2H
+
橙 黄
Cr
2
O
7
2-
与 CrO
4
2-
颜色不同，当[H
+
]增加时,
平衡左移。
一、目视比色法：
比较透过光的强度。
标准色阶：在相同条件下显色，目视比较。
灵敏度高、准确度低，不同人看，结果不同。
不符合朗伯比尔定律的也可用目视比色法，因比较透过光。
§7-2 光度分析方法及仪器二、光电比色法：
比较溶液对某一波长光的吸收情况。比目视比色法的准确度和选择性好三、分光光度法：
与光电比色法的原理相同，只是二者获得单色光的方法不同，前者使用滤光片，后者使用棱镜、光栅。因而分光度法比光电比色法的准确度和选择性好。
1、光源：钨丝灯：可见、红外400-1000nm
氢灯或氘灯：紫外160-350nm
2、单色器：
(1) 滤光片：有色的玻璃片或薄膜，利用颜色互补原理。
(2) 棱镜：根据物质的折射率与光的波长有关。
玻璃棱镜：可见，石英棱镜：紫外、可见。
(3) 光栅：在玻璃片或金属片上刻划均匀的线，
1200 条/ 1mm，
干涉、衍射原理。
3,吸收池：玻璃：可见；石英：紫外，可见。
4,检测器：光电转换器件。利用光电效应，光照产生光电流，
测光电流的大小。
（1）硒光电池:
光照到Se上产生电子，Au薄膜带负电，Fe 或 Al带正电。
感光范围300～800nm，500～600nm 最灵敏，
有疲劳现象，光照时间长不灵敏，所以用后马上关掉。
+
_
Fe,Al
半导体材料Se
Au,Ag,Pt
（2）光电管：比硒光电池灵敏度高，无疲劳现象。
（3）光电倍增管
5、显示器检流计：72型;
数字显示：722型；
数字打印,UV-240。
M+L ML
将待测组分转变为有色化合物的反应称为显色反应
§7-3 显色反应及条件反衬度Δλ=λ
ML
max
-λ
L
max
> 60nm，
否则对测定有干扰。
要求（1）选择性好
（2）灵敏度高，ε>10
4
（3）有色络合物ML 要稳定（不分解）
（4）ML组成要一定（只ML无ML
n
）
（5）ML与L颜色差别大一、显色反应
M+L ML 每次加入量严格准确控制二、影响显色反应的因素
1.显色剂的浓度：
2,溶液的酸度：
M + L ML (显色剂L存在酸效应α
L(H)
)
(1) 影响显色剂的浓度
(2) 影响M的存在状态
(3) 影响ML的组成和稳定性如Fe
3+
—磺基水杨酸:
pH 组成颜色
2-3 1：1紫红
4-8 1：2橙
8-10 1：3黄色
4,溶剂：
一般螯合物在有机溶剂中溶解度大，提高显色反应的灵敏度。例如：Co（SCN）
2-
4
，在水中大部分离解，几乎无色；在丙酮中呈兰色。
5.时间：
颜色稳定的时间通过条件实验确定。
3,温度:
通过实验确定温度范围，通常在室温下进行。
6,干扰组分：
干扰组分有色或干扰组分与L生成有色络合物，产生正干扰，A值增大；干扰组分与L或M生成无色络合物，则会使M或L的浓度降低，产生负干扰，A值减少。
（1）控制一定酸度，使干扰组分不生色
（2）加掩蔽剂，与干扰组分生成无色物
（3）选择适当的波长
（4）选择适当的参比液
（5）分离掉干扰组分消除干扰：
§7-4 光度分析的准确度由仪器本身决定的，对一台仪器来说读数误差ΔT为定值。
一定的ΔT对应的Δc不同，相对误差不同。
c
c?
c小，ΔT 引起的Δc小，大；
c大，ΔT引起的Δc大，大。
c
c?
c
c?
TT
T
TT
T
A
A
lg
d434.0
)lg(
d434.0d
=

=
TA lg?=
T
T
A
d434.0
d?=
相对误差：
TT
T
A
A
A
A
c
c
RE
lg
d434.0d
==
=
=
分母最大时，R E最小。
即A=0.434 时RE 最小。
0
d
)lg(d
=
T
TT
lnT+1=0? lgT= -0.434
ΔT=0.01 时，RE =±2.7%,
所以光度分析法RE大，一般5%左右。
A在0.1—1 或T在10 —80% 范围内时,RE较小(<5%)。
+=
=
+
y
2
y
x
2
x
2
yx
x
1
x
1
x
cbbcA
cbA
λλ
λ
εε
ε
§7-5 光度分析的应用一、多组分的测定：
两组分x，y
（1）x,y 互不干扰
（2）x 干扰y,y 不干扰x
=
=
y
2
y
2
x
1
x
1
cbA
cbA
λ
λ
ε
ε
+=
+=
+
+
y
2
y
x
2
x
2
yx
y
1
y
x
1
x
1
yx
bcbcA
bcbcA
λλλ
λλλ
εε
εε
（3）x,y 互相干扰二、差示分光光度法高吸光度法：
选比c
x
浓度稍小的cs为参比，调透光率100 %，
相当于标尺扩大10倍。
A
x
=εbc
x
= -lgT
x
A
s
=εbc
s
= -lgT
s
A
r
=A
x
-A
s
=εb（c
x
-c
s
）=εbΔc= -lgT
r
s
x
r
T
T
T = dA
r
=εbdc
r
r
r
d434.0
d
T
T
A?=
A
x
=-lgT
x
=εbc
x
b
T
c
ε
x
x
lg?
=
b
T
T
T
c
cb
ε
ε
x
r
r
x
lg
d434.0d
=
差示：
普通：
xr
r
x
lg
d434.0d
TT
T
c
c
=
xx
x
lg
d434.0d
TT
T
c
c
=
∵Tr > Tx∴差示的误差小。
<例> Tx=2.0% Ts=10% ΔT=±0.5% 以试剂为参比以Ts为参比解：
%4.6
02.0lg02.0
%)5.0(433.0d
±=
×
±×
=
c
c
%64.0
02.0lg2.0
%)5.0(434.0
lg
d434.0d
xr
r
±=
×
±
==
TT
T
c
c
%20
s
x
r ==
T
T
T
三、弱酸（碱）离解常数的测定
HA H
+
+A
c
HA
=[HA]+[A ]=c
HA
δ
HA
+c
HA
δ
A
当b=1cm 时，
a]H[
a
a]H[
]H[
]H[a
a
a]H[
]H[
]A[]HA[
A
HA
AA
HAHA
A
HA
K
K
A
K
A
K
K
c
K
c
A
+
+
+
=
+
+
+
=
+=
++
+
++
+

εε
εε
高酸度：A
HA
=ε
HA
· c
HA
低酸度：A
A
-
=ε
A
-
· c
A
-
配制一系列c
A
相等，pH不同的溶液测出A
HA
、A
A
-
，
由实验值计算出Ka，或用作图法求pKa值
A([H
+
]+Ka)=A
HA
[H
+
]+A
A
Ka
][Ha
A
HA
+
=
AA
AA
K
pHlgap
HA
A
+
=
AA
AA
K
<例> 在下列不同pH缓冲溶液中，甲基橙的
c=2.0×10
-4
mol/L,b=1cm,λ=520nm,测得结果如下：
pH 0.88 1.17 2.99 3.41 3.95 4.89 5.50
A 0.890 0.890 0.692 0.552 0.385 0.260 0.260
34.3
34.395.3
385.0890.0
260.0385.0
)(
35.341.3
552.0890.0
60.0552.0
)(
33.399.2
692.0890.0
260.0629.0
)(
3
2
1
=
=+
=
=+
=
=+
=
pKa
pKa
pKa
pKa
A
HA
AA
AA
lg
解：∴A
HA
=0.890 A
A
-
=0.260
对pH作图,直线与pH轴交点的pH值即为pKa
值。
四、络合物的组成和稳定常数的测定
(一）摩尔比法显色反应M+nLML
n
固定c
M
，改变c
L
以A ～作图
M
L
c
c
1,组成测定：
斜线部分当时，(M部分络合，c
L
不够)
平台部分当时，（M全部络合，MLn离解忽略）
两直线延长线的交点处对应的横坐标
n
c
bA
L
=ε
n
c
c
<
M
L
M
bcA?=εn
c
c
>
M
L
n
c
c
=
M
L
2,稳定常数的测定
n
n
K
]L][M[
]ML[
稳
=
A=εb[MLn]
bε
A
cc n
=?=
MM
][ML[M]
bε
A
ncnc n
=?=
ML
][ML[L]
n
b
A
nc
b
A
c
b
A
K
))((
LM
εε
ε

=
稳
(A为拐点处值）
（二）、等摩尔连续变化法在c
M
+c
L
为定值的条件下，改变c
M、
c
L
的相对比例，配制系统溶液，测其吸光度。
c
M
1 2 3 4
…
9 10
c
L
9 8 7 6
…
1 0
以A～c
M
/c作图：
1,组成的测定
A值最大时对应的比值即为络合物的组成比。
,,络合物组成为ML
,,络合物组成为ML
2
.
67.0
33.0
L
M
=
c
c
c
c
c
33.0
L
M
=
5.0
L
M
=
c
c
1
L
M
=
c
c
c
c
M
2,稳定常数的测定
A=εb[MLn]
A
ex
=εbc
M
(A
ex
由外推得到，为MLn完全不离解时的A值）
Mex
][ML
cA
A n
=
ex
M
][ML
A
cA
n
=
M
ex
MM
][ML[M] c
A
A
cc n=?=
M
ex
ML
][ML[L] c
A
A
ncnc n=?=
n
n
n
c
A
A
ncc
A
A
c
c
A
A
K
))((
[M][L]
][ML
M
ex
LM
ex
M
M
ex

==
稳五、双波长分光度法
A
λ1
=ε
λ1
b c
x
A
λ2
=ε
λ2
b c
x
测定的是ΔA
单一组分：
△A= A
λ1
-A
λ2
=（ε
λ1
-ε
λ2
）bc
x
=△εbc
x
ΔA与c
x
是线性关系两组分：x，y
测X：选λ
1
为测定波长; λ
2
为参比波长
y
111
y
222
X
X
λλλ
λλλ
AAA
AAA
+=
+=
yy
12 λλ
AA =
双波长光度计，测得的是△A。
X
XXXX
)(
212121
bcAAAA
λλλλλλ
εε?=?=?
ΔA与c
x
是线性关系