第三讲,
高效液相色谱法及应用
2004年 3月 14日
慢
中等
快
色谱分离
Temporal
course
淋洗液
由于液体与气体性质的以下差异,
?溶质在液体中的扩散系数比它在气
体中小 105倍左右
?液体粘度比气体约大 102倍
?液体表明张力比气体大 104倍左右
?液体密度比气体约大 103倍
?液体不可压缩
液相色谱以液体为流动相，固定相可以
是固体或液体（担载在固体表面），与
气相色谱比，带来一系列变化,
例如，填充柱气相色谱柱，一般填料的
尺寸为 80-100目，粒度大约是 2毫米，
而一般高效液相色谱的固定相粒度在 2
－ 10微米，因此流动相通过这样一段固
定床时就产生了很高的反压。
因此，我们通常所说的高效液相色谱
（ High Performance Liquid Chromatography)
实际也是高压液相色谱 (High Pressure
Liquid Chromatography),因为没有很高的压
力就不可能产生很高的分离效率。
键合相高效液相色谱算是一种色谱模式，
因为用的是键合相的固定相。
一、液相色谱的分类
1,按溶质在分离过程中的原理,
? 吸附色谱
? 分配色谱
? 离子交换色谱
? 体积排阻色谱
? 亲和色谱
2.按色谱固定相的形式,
? 平板色谱（平面色谱）
? 柱色谱
3.按分离的压力
? 高压液相色谱（高效液相色谱）
? 中压液相色谱
? 常压液相色谱
H－ dp关系图
二、液固色谱法
一般也把吸附色谱法称为液固色谱法。
液固色谱法的固定相一般为固体吸附剂，
常用的是：碳酸钙、硅胶、氧化铝、氧
化镁、活性炭等。其中硅胶最为常用。
吸附色谱对中等分子量的油溶性样品可
获得最佳的分离，而对强极性或离子型
的样品，有时会发生不可逆吸附，不能
得到满意的结果。
基本原理,
吸附剂一般为多孔性的物质，在它们的表明存
在着分散的吸附中心，溶质分子和流动相分子
在吸附剂表面的活性中心上进行竞争，同时不
同溶质之间和同一溶质的不同官能团之间液也
存在竞争。竞争的综合结果就是形成不同溶质
在吸附剂表面吸附、解吸平衡。
吸附
mssm nMXnMX ???
解吸
X表示溶质分子，下标 m为流动相,s为固定相
M表示流动相分子，下标 m为流动相,s为固定相
n为被溶质分子取代的流动相分子数目
用一个式子表示如下,
极性吸附剂上有机化合物的保留顺序如
下,
氟碳化合物 <饱和烃 <烯烃 <芳烃 <
有机卤化物 <醚 <硝基化合物 <腈 <
叔胺 <酯醛酮 <醇 <伯胺 <酰胺 <羧
酸 <磺酸
三、键合相液相色谱
键合相固定相：在硅胶的表明用键合反应
把官能基团键合到表面上，解决固定相流
失的问题。
正相色谱：流动相极性比固定相极性小
反相色谱：流动相极性比固定相极性大
一般认为键合相色谱的机理分配色
谱机理，也有人认为它是吸附色谱
机理，其实应该是有两种成分在里
面，现在又有疏溶剂理论等机理的
提出。
四、高效液相色谱仪器
1,储存和输送液体设备
2,进样系统
3,柱系统
4,检测器
5,控制和数据处理系统
选择流动相的原则,
?保持色谱柱的稳定性
?化学惰性
?适合所用的检测器
?对样品有一定的溶解能力
?清洗、更换方便、毒性小
?沸点、粘度等物理性质合适
反相色谱最常用的流动相,
水、甲醇、乙腈、四氢呋喃、异
丙醇等。
水－甲醇体系：大约 50％水的时
候粘度最大
水－乙腈体系,35％水的时候粘
度最大。
存放流动相的容器一定要惰性的，
并且有机溶剂要避光。
输液泵要求流量平稳,可以调节的
流量范围宽，耐高压。
一般是柱塞往复泵。
进样系统包括手动进样和自动进样
无论手动进样还是自动进样，都要通
过六通阀。六通阀进样是高压系统的
需要，既不影响系统的正常运行又能
够让样品进到系统中去。
柱系统包括色谱柱和柱温箱
反相键合相色谱柱最常用的就是
ODS柱，也就是 C18柱。
柱温箱的温度控制要求比较精确，
因为流体的粘度受温度的影响较大。
液相色谱检测器
测量原理不同分类,
?光学性质检测器
?电学和电化学性质检测器
?热学性质检测器
?光学性质检测器,
紫外－可见光检测器
示差折光检测器
荧光检测器
蒸发光散射检测器
化学发光检测器
紫外吸收检测器有三种类型,
固定波长紫外吸收检测器：低压汞灯提供
固定 254nm或 280nm紫外光。
可变多波长检测器：氘灯做光源，光栅分
光
光二极管阵列检测器 photo－ diode－ array
detector（ PDAD,PDA,DAD）：钨灯和氘
灯组合光源，进入检测池的不是单色光，
而是一段紫外波长上的光。
PDA 可以辅助定性。
折光指数检测器（ refractive index detector
RID）：也称为示差折光检测器。
溶液的折射率等于溶剂及其中所含各组分
溶质的折射率与其各自的摩尔分数的乘积
之和。
RID是通用型的检测器，但是灵敏度不高。
RID不能用于梯度洗脱。
蒸发光散射检测器
?电学和电化学检测器,
安培检测器
电导检测器
库仑检测器
介电常数检测器
极谱检测器
热学性质,
光声检测器
热透镜和光热偏转检测器
工作站：完成数据采集和对
仪器的控制的工作。
五、高效液相色谱法的应用和进展
1、在生物化学和生物工程中的应用
2、在医药研究中的应用
3、食品分析
4、环境分析
5、精细化工
高效液相色谱法及应用
2004年 3月 14日
慢
中等
快
色谱分离
Temporal
course
淋洗液
由于液体与气体性质的以下差异,
?溶质在液体中的扩散系数比它在气
体中小 105倍左右
?液体粘度比气体约大 102倍
?液体表明张力比气体大 104倍左右
?液体密度比气体约大 103倍
?液体不可压缩
液相色谱以液体为流动相，固定相可以
是固体或液体（担载在固体表面），与
气相色谱比，带来一系列变化,
例如，填充柱气相色谱柱，一般填料的
尺寸为 80-100目，粒度大约是 2毫米，
而一般高效液相色谱的固定相粒度在 2
－ 10微米，因此流动相通过这样一段固
定床时就产生了很高的反压。
因此，我们通常所说的高效液相色谱
（ High Performance Liquid Chromatography)
实际也是高压液相色谱 (High Pressure
Liquid Chromatography),因为没有很高的压
力就不可能产生很高的分离效率。
键合相高效液相色谱算是一种色谱模式，
因为用的是键合相的固定相。
一、液相色谱的分类
1,按溶质在分离过程中的原理,
? 吸附色谱
? 分配色谱
? 离子交换色谱
? 体积排阻色谱
? 亲和色谱
2.按色谱固定相的形式,
? 平板色谱（平面色谱）
? 柱色谱
3.按分离的压力
? 高压液相色谱（高效液相色谱）
? 中压液相色谱
? 常压液相色谱
H－ dp关系图
二、液固色谱法
一般也把吸附色谱法称为液固色谱法。
液固色谱法的固定相一般为固体吸附剂，
常用的是：碳酸钙、硅胶、氧化铝、氧
化镁、活性炭等。其中硅胶最为常用。
吸附色谱对中等分子量的油溶性样品可
获得最佳的分离，而对强极性或离子型
的样品，有时会发生不可逆吸附，不能
得到满意的结果。
基本原理,
吸附剂一般为多孔性的物质，在它们的表明存
在着分散的吸附中心，溶质分子和流动相分子
在吸附剂表面的活性中心上进行竞争，同时不
同溶质之间和同一溶质的不同官能团之间液也
存在竞争。竞争的综合结果就是形成不同溶质
在吸附剂表面吸附、解吸平衡。
吸附
mssm nMXnMX ???
解吸
X表示溶质分子，下标 m为流动相,s为固定相
M表示流动相分子，下标 m为流动相,s为固定相
n为被溶质分子取代的流动相分子数目
用一个式子表示如下,
极性吸附剂上有机化合物的保留顺序如
下,
氟碳化合物 <饱和烃 <烯烃 <芳烃 <
有机卤化物 <醚 <硝基化合物 <腈 <
叔胺 <酯醛酮 <醇 <伯胺 <酰胺 <羧
酸 <磺酸
三、键合相液相色谱
键合相固定相：在硅胶的表明用键合反应
把官能基团键合到表面上，解决固定相流
失的问题。
正相色谱：流动相极性比固定相极性小
反相色谱：流动相极性比固定相极性大
一般认为键合相色谱的机理分配色
谱机理，也有人认为它是吸附色谱
机理，其实应该是有两种成分在里
面，现在又有疏溶剂理论等机理的
提出。
四、高效液相色谱仪器
1,储存和输送液体设备
2,进样系统
3,柱系统
4,检测器
5,控制和数据处理系统
选择流动相的原则,
?保持色谱柱的稳定性
?化学惰性
?适合所用的检测器
?对样品有一定的溶解能力
?清洗、更换方便、毒性小
?沸点、粘度等物理性质合适
反相色谱最常用的流动相,
水、甲醇、乙腈、四氢呋喃、异
丙醇等。
水－甲醇体系：大约 50％水的时
候粘度最大
水－乙腈体系,35％水的时候粘
度最大。
存放流动相的容器一定要惰性的，
并且有机溶剂要避光。
输液泵要求流量平稳,可以调节的
流量范围宽，耐高压。
一般是柱塞往复泵。
进样系统包括手动进样和自动进样
无论手动进样还是自动进样，都要通
过六通阀。六通阀进样是高压系统的
需要，既不影响系统的正常运行又能
够让样品进到系统中去。
柱系统包括色谱柱和柱温箱
反相键合相色谱柱最常用的就是
ODS柱，也就是 C18柱。
柱温箱的温度控制要求比较精确，
因为流体的粘度受温度的影响较大。
液相色谱检测器
测量原理不同分类,
?光学性质检测器
?电学和电化学性质检测器
?热学性质检测器
?光学性质检测器,
紫外－可见光检测器
示差折光检测器
荧光检测器
蒸发光散射检测器
化学发光检测器
紫外吸收检测器有三种类型,
固定波长紫外吸收检测器：低压汞灯提供
固定 254nm或 280nm紫外光。
可变多波长检测器：氘灯做光源，光栅分
光
光二极管阵列检测器 photo－ diode－ array
detector（ PDAD,PDA,DAD）：钨灯和氘
灯组合光源，进入检测池的不是单色光，
而是一段紫外波长上的光。
PDA 可以辅助定性。
折光指数检测器（ refractive index detector
RID）：也称为示差折光检测器。
溶液的折射率等于溶剂及其中所含各组分
溶质的折射率与其各自的摩尔分数的乘积
之和。
RID是通用型的检测器，但是灵敏度不高。
RID不能用于梯度洗脱。
蒸发光散射检测器
?电学和电化学检测器,
安培检测器
电导检测器
库仑检测器
介电常数检测器
极谱检测器
热学性质,
光声检测器
热透镜和光热偏转检测器
工作站：完成数据采集和对
仪器的控制的工作。
五、高效液相色谱法的应用和进展
1、在生物化学和生物工程中的应用
2、在医药研究中的应用
3、食品分析
4、环境分析
5、精细化工
