第十六章 药品质量控制中的现代分析方法与技术基本要求毛细管气相色谱分析法手性药物的液相色谱分析法核磁共振光谱分析法气相色谱 -质谱联用技术返回主目录基本要求一,熟悉毛细管气相色谱法,手性药物的高效液相色谱法的基本内容及其在药物分析中的应用 。
二,熟悉核磁共振光谱分析法的定量方法及其在药物分析中的应用 。
三了解毛细管电泳分析法,红外光谱法,
联用技术在药物分析中的应用 。
返 回毛细管气相色谱法使用的色谱柱是空心的毛细管柱，叫开管柱：固定液涂渍或固定化在柱管内壁上，而载气和其中的样品从中心的通道上通过。柱材料主要是熔融石英（ FSOT）。
一、高分辨气相色谱法
（一）色谱柱
1．毛细管柱的类型：
柱类型 柱内径 柱长 液膜厚度普通开管柱 0.2～ 0.53mm 5～ 60m 0.1～ 1.0μm
壁涂开管柱多孔层开管柱担体涂渍开管柱微内径开管柱 ﹤ 100μm
大内径开管柱 0.32mm 1μm 或 5μm
2．毛细管柱的选择常用的 固定液 有,SE-31,OV-1,SE-54,SE-52、
OV-1701,Carbowax 20M。
柱的选择,根据样品组分的沸点，一般地，相差
2℃ 或 2℃ 以上的组分，采用非极性毛细管柱分离；
若沸点相差在 2℃ 以内的组分，则需在极性较大的毛细管柱上分离。
3．毛细管柱的性能评价评价指标,分离效率、表面惰性、热稳定性。
评价方法,在一定的色谱条件下，分离各种测试物质，
获得的特征性数据和峰对称性，以此来评价柱效和表面活性。在测定了柱效和表面活性之后，用流失速率试验来评价热稳定性。
（二）进样方式分流进样,使用方便，对分流比、进样温度样品和载气的情况、进样体积和浓度、进样重复性需要注意。
不适于 痕量分析和宽沸程样。
适合 大多数类型的样品，样品浓浓高、各组分的浓度相近不分流进样,须利用溶剂效应或冷阱，操作较难特别适用于痕量分析和宽沸程样品柱头进样,必须使用外径为 0,17 ～ 0.23mm的细针，柱内径必须大于 0.32 mm,
不能通过隔垫进样，缓慢进样对热不稳定、稀的和宽沸程样品较理想；能给出定量结果非挥发物在柱的中积累导致柱变性和柱效损失直接进样,样品无须事先浓缩，进样器温度可较低，载气消耗量小，分析所需样量小适用于浓度范围要比不分流进样宽一个数量级以上的样品，有利于对热不稳定的样品；当样品中含有挥发性低的组分时，难于定量分析
（三）应用示例 ----人尿中劳拉西泮的检测
1.测定意义：劳拉西泮 (简称 LRZ)上用为催眠、镇静和抗癫痫药物,常被犯罪分子作为麻醉药物用于麻醉抢劫等麻醉后犯罪。为了确证这类案件的性质,经常需要对受害人的血、尿等体液中麻醉药物或其代谢物进行检测。人体摄入该药后其血液中药物浓度较低,
且犯罪分子所用药量一般不使受害人死亡,而且此类案件一般报案较迟，因此血中药物浓度较低,对其检测较为困难。该药主要以葡萄糖醛酸苷的形式由尿液排泄。
2.色谱条件,HP-5毛细管柱 (30ｍ × 0.32mm,膜厚
0.1μ ｍ )。 氮磷检测器,不分流进样 (阀关闭时间
0.75min),进样口温度,280℃,柱温,200℃ (1min)20℃ /min280℃ (15min),载气为高纯氮 (2.2ｍ ml/min),尾吹气为高纯氮 (10ml/min)。
3.样品预处理 ----酶解及萃取取检尿 1ml,加 10mg/L的羟乙基氟西泮 (HEF)标准工作液 10μl,再加 pH4.8的乙酸盐缓冲液 50μl 及 β -葡萄糖醛酸苷酶溶液 0.1μl,臵于 55℃ 水浴中水解 4ｈ冷至室温后加 pH10.8的碳酸盐缓冲液 0.5ml及乙醚 5ml,涡旋
2min,离心,分取上层有机相 4ml臵于经硅烷化处理的带尾管的鸡心瓶中,加甲醇 0.4ml,于 40℃ 水浴中挥发至约
0.1ml,进样 1μl 进行 GC分析
4.方法学评价
（ 1)选择性,空白尿 1ml及空白尿 1ml加 LRZ和 HEF标准液,经酶解、萃取后进样分析所得色谱图表明尿中杂质不干扰检测,
（ 2)线性试验,用空白尿配制不同浓度的 LRZ标准液进行酶解、萃取、进样分析,将 LRZ与 HEF色谱峰面积的比值与 LRZ在尿液中的质量浓度进行线性回归,得到工作曲线方程,Y=3.1× 10-3X –3.0× 10 -
3,ｒ =0.998。 LRZ在尿中的浓度为 50～ 500μg/L
范围内呈良好的线性,
（ 3)萃取液的选择及萃取率,作者进行了多种溶剂萃取
LRZ的研究,由经萃取与未经萃取所得色谱峰面积比计算 LRZ的萃取率,得 (mean± SD)为 (83.4± 3.1)%。
（ 4）检出限,以 3倍信噪比计算检出限,得本法的检出限为 5μg/L 。
（ 5)回收率,由工作曲线计算 LRZ的质量浓度及其回收率,得 (mean± SD)为 (103.3± 5.1)%。
5.尿液检测,志愿者口服 LRZ 2ｍｇ后,于 32小时内收集其排泄的尿液进行检测,LRZ于 9h达尿中最高浓度为 444μ ｇ /L,检测结果表明,本方法适合于麻醉后犯罪案件中ＬＲＺ的检测要求。
返 回二、手性药物的高效液相色谱法
（一）手性药物拆分机理为了使对映体转化为化学和物理性质不同的非对映体，就要提供一种手性源，使待拆分的对映异构体（样品）、手性作用物（如固定相）和手性源之间形成一个非对映异构分子的络合物。在对映体拆分理论中颇为流行的是,三点手性识别模式,。
（二）手性 HPLC拆分法的类型直接法,柱前手性衍生化法间接法,手性流动相拆分法、手性固定相拆分法
1．柱前手性衍生化法：对映体混合物以手性试剂作柱前衍生化，形成非对映体，然后以常规（偶见手性）固定相分离。
对手性衍生化试剂的要求：高光学纯度。
常用的手性衍生化试剂：羧酸衍生物类、胺类、异硫氰酸酯类、异氰酸酯类、萘衍生物类、光学活性氨基酸类、
固相衍生化试剂。
2．手性流动相拆分法（手性洗脱法或手性流动相添加剂法）：将手性试剂加入流动相中，手性添加剂与样品形成手性络合物。
常用的手性添加剂：配基交换型手性添加剂、环糊精类添加剂、手性离子对络合剂
3．手性固定相拆分法：将手性选择器（如手性流动相添加剂）固着于多种基质上而制成手性固定相。迄今为止，尚没有一种通用型的手性柱，需要根据化合物的分子结构来选择合适的手性柱。
常用的手性固定相,Pirkle型手性固定相、蛋白质类手性固定相、环糊精类手性固定相。
（三）应用
1．对某些手性药物进行对映体的纯度检查；
2．生物体液中药物对映体的分离分析研究可探索血药浓度与临床疗效的关系；
3．在研制手性药物过程中，可分别评价单个对映体的效价、毒性、不良反应、药动学性质；
4．必要时，可进行手性药物对映体的制备分离
（或拆分）。
示例一、左旋吡喹酮中吡喹胺的检查（柱前手性衍生化法）
手性衍生化试剂：乙酰葡萄糖异硫氰酸酯色谱条件：色谱柱 NOVA-Pack C18（ 150mm× 3.9mm）
流动相 甲醇 -0.01mol/L磷酸二氢钾
（ pH2.8）（ 51∶49 ）
该法所用的手性衍生化试剂可以与一级胺、二级胺在温和的条件下迅速反应，所生成的非对映体衍生物可以在普通色谱系统中进行分离分析。
示例二,DL-色氨酸的拆分（手性流动相拆分法）
色谱条件：
色谱柱 Zorbax ODS（ 250mm× 4.6mm），
流动相 含有 0.15%L-苯丙氨酸及 0.11%硫酸铜
（ CuSO4·5H2O）水溶液（以 0.05mol/L硫酸调 pH至 3.0） -
甲醇（ 9∶1 ）（流动相中 L-苯丙氨酸及硫酸铜浓度分别为 0.008mol/L和 0.004mol/L）。
流动相中 L-苯丙氨酸为配基交换型手性添加剂，硫酸铜为二价金属螯离子,L-苯丙氨酸与铜离子螯合，分布于流动相中，遇到色氨酸对映体，共同形成配位络合物对，然后在反相柱上拆分。
示例三、克仑特罗对映体的拆分（手性固定相拆分法）
色谱条件：
色谱柱 Chirex 3005手性色谱柱
[（ R） -1-萘基甘氨酸和 3,5-二硝基苯甲酸以共价键结合 ]
流动相 正己烷 -二氯乙烷 -甲醇该法的拆分机理为,三点手性识别模式,。
返 回三、核磁共振光谱分析法核磁共振光谱广泛用于化合物的结构分析，而其在化合物的定量分析中的应用则是比较新的内容，日益受到重视。
1．定量参数：峰面积或峰高。
2,定量的特点,
1）对于确定的核（质子），其信号强度与产生该信号的核（质子）的数目成正比，而与核的化学性质无关。
2）利用内标法或相对比较法分析混合物中某一化合物时，物需该化合物的纯品作为对照标准。
3）峰很窄，远小于各化合物之间的化学位移的差值，
因而混合物中不同组分的信号之间很少发生明显的重叠。
4）方法简单快速、准确、专属性高，不破坏被测样品，
可选择性的测定混合药物或药物制剂中的组分乃至药物的立体异构体。
3,测定方法,选择一个合适的峰作为测量峰。
（ 1） 内标法（绝对测量法） 内标法为 NMR定量分析最常用的方法，它与 GC的内标法相似，在样品溶液中，直接加入一定量内标物质后,NMR光谱测定，将样品指定基团上的质子引起的共振峰面积进行比较，当样品与内标均经精密称重时，则样品的绝对重量（ Wu）可由下式求得：
EEAAWW sususu E
EAAWW
s
u
s
u
su
%100?WW u百分含量＝
（ 2） 相对测量法 当不能获得样品的纯品或合适的内标时，可用相对测量法进行分析。操作方法与内标法相同。
计算相对含量是以指定基团上一个质子引起的吸收峰面积
（ A1 / n1）和杂质基团上一个质子引起的吸收峰面积（ A2
/ n2）进行比较，按下式计算：
%1 0 0
2
2
1
1
1
1
n
A
n
A
n
A
样品相对百分含量＝
返 回
二,熟悉核磁共振光谱分析法的定量方法及其在药物分析中的应用 。
三了解毛细管电泳分析法,红外光谱法,
联用技术在药物分析中的应用 。
返 回毛细管气相色谱法使用的色谱柱是空心的毛细管柱，叫开管柱：固定液涂渍或固定化在柱管内壁上，而载气和其中的样品从中心的通道上通过。柱材料主要是熔融石英（ FSOT）。
一、高分辨气相色谱法
（一）色谱柱
1．毛细管柱的类型：
柱类型 柱内径 柱长 液膜厚度普通开管柱 0.2～ 0.53mm 5～ 60m 0.1～ 1.0μm
壁涂开管柱多孔层开管柱担体涂渍开管柱微内径开管柱 ﹤ 100μm
大内径开管柱 0.32mm 1μm 或 5μm
2．毛细管柱的选择常用的 固定液 有,SE-31,OV-1,SE-54,SE-52、
OV-1701,Carbowax 20M。
柱的选择,根据样品组分的沸点，一般地，相差
2℃ 或 2℃ 以上的组分，采用非极性毛细管柱分离；
若沸点相差在 2℃ 以内的组分，则需在极性较大的毛细管柱上分离。
3．毛细管柱的性能评价评价指标,分离效率、表面惰性、热稳定性。
评价方法,在一定的色谱条件下，分离各种测试物质，
获得的特征性数据和峰对称性，以此来评价柱效和表面活性。在测定了柱效和表面活性之后，用流失速率试验来评价热稳定性。
（二）进样方式分流进样,使用方便，对分流比、进样温度样品和载气的情况、进样体积和浓度、进样重复性需要注意。
不适于 痕量分析和宽沸程样。
适合 大多数类型的样品，样品浓浓高、各组分的浓度相近不分流进样,须利用溶剂效应或冷阱，操作较难特别适用于痕量分析和宽沸程样品柱头进样,必须使用外径为 0,17 ～ 0.23mm的细针，柱内径必须大于 0.32 mm,
不能通过隔垫进样，缓慢进样对热不稳定、稀的和宽沸程样品较理想；能给出定量结果非挥发物在柱的中积累导致柱变性和柱效损失直接进样,样品无须事先浓缩，进样器温度可较低，载气消耗量小，分析所需样量小适用于浓度范围要比不分流进样宽一个数量级以上的样品，有利于对热不稳定的样品；当样品中含有挥发性低的组分时，难于定量分析
（三）应用示例 ----人尿中劳拉西泮的检测
1.测定意义：劳拉西泮 (简称 LRZ)上用为催眠、镇静和抗癫痫药物,常被犯罪分子作为麻醉药物用于麻醉抢劫等麻醉后犯罪。为了确证这类案件的性质,经常需要对受害人的血、尿等体液中麻醉药物或其代谢物进行检测。人体摄入该药后其血液中药物浓度较低,
且犯罪分子所用药量一般不使受害人死亡,而且此类案件一般报案较迟，因此血中药物浓度较低,对其检测较为困难。该药主要以葡萄糖醛酸苷的形式由尿液排泄。
2.色谱条件,HP-5毛细管柱 (30ｍ × 0.32mm,膜厚
0.1μ ｍ )。 氮磷检测器,不分流进样 (阀关闭时间
0.75min),进样口温度,280℃,柱温,200℃ (1min)20℃ /min280℃ (15min),载气为高纯氮 (2.2ｍ ml/min),尾吹气为高纯氮 (10ml/min)。
3.样品预处理 ----酶解及萃取取检尿 1ml,加 10mg/L的羟乙基氟西泮 (HEF)标准工作液 10μl,再加 pH4.8的乙酸盐缓冲液 50μl 及 β -葡萄糖醛酸苷酶溶液 0.1μl,臵于 55℃ 水浴中水解 4ｈ冷至室温后加 pH10.8的碳酸盐缓冲液 0.5ml及乙醚 5ml,涡旋
2min,离心,分取上层有机相 4ml臵于经硅烷化处理的带尾管的鸡心瓶中,加甲醇 0.4ml,于 40℃ 水浴中挥发至约
0.1ml,进样 1μl 进行 GC分析
4.方法学评价
（ 1)选择性,空白尿 1ml及空白尿 1ml加 LRZ和 HEF标准液,经酶解、萃取后进样分析所得色谱图表明尿中杂质不干扰检测,
（ 2)线性试验,用空白尿配制不同浓度的 LRZ标准液进行酶解、萃取、进样分析,将 LRZ与 HEF色谱峰面积的比值与 LRZ在尿液中的质量浓度进行线性回归,得到工作曲线方程,Y=3.1× 10-3X –3.0× 10 -
3,ｒ =0.998。 LRZ在尿中的浓度为 50～ 500μg/L
范围内呈良好的线性,
（ 3)萃取液的选择及萃取率,作者进行了多种溶剂萃取
LRZ的研究,由经萃取与未经萃取所得色谱峰面积比计算 LRZ的萃取率,得 (mean± SD)为 (83.4± 3.1)%。
（ 4）检出限,以 3倍信噪比计算检出限,得本法的检出限为 5μg/L 。
（ 5)回收率,由工作曲线计算 LRZ的质量浓度及其回收率,得 (mean± SD)为 (103.3± 5.1)%。
5.尿液检测,志愿者口服 LRZ 2ｍｇ后,于 32小时内收集其排泄的尿液进行检测,LRZ于 9h达尿中最高浓度为 444μ ｇ /L,检测结果表明,本方法适合于麻醉后犯罪案件中ＬＲＺ的检测要求。
返 回二、手性药物的高效液相色谱法
（一）手性药物拆分机理为了使对映体转化为化学和物理性质不同的非对映体，就要提供一种手性源，使待拆分的对映异构体（样品）、手性作用物（如固定相）和手性源之间形成一个非对映异构分子的络合物。在对映体拆分理论中颇为流行的是,三点手性识别模式,。
（二）手性 HPLC拆分法的类型直接法,柱前手性衍生化法间接法,手性流动相拆分法、手性固定相拆分法
1．柱前手性衍生化法：对映体混合物以手性试剂作柱前衍生化，形成非对映体，然后以常规（偶见手性）固定相分离。
对手性衍生化试剂的要求：高光学纯度。
常用的手性衍生化试剂：羧酸衍生物类、胺类、异硫氰酸酯类、异氰酸酯类、萘衍生物类、光学活性氨基酸类、
固相衍生化试剂。
2．手性流动相拆分法（手性洗脱法或手性流动相添加剂法）：将手性试剂加入流动相中，手性添加剂与样品形成手性络合物。
常用的手性添加剂：配基交换型手性添加剂、环糊精类添加剂、手性离子对络合剂
3．手性固定相拆分法：将手性选择器（如手性流动相添加剂）固着于多种基质上而制成手性固定相。迄今为止，尚没有一种通用型的手性柱，需要根据化合物的分子结构来选择合适的手性柱。
常用的手性固定相,Pirkle型手性固定相、蛋白质类手性固定相、环糊精类手性固定相。
（三）应用
1．对某些手性药物进行对映体的纯度检查；
2．生物体液中药物对映体的分离分析研究可探索血药浓度与临床疗效的关系；
3．在研制手性药物过程中，可分别评价单个对映体的效价、毒性、不良反应、药动学性质；
4．必要时，可进行手性药物对映体的制备分离
（或拆分）。
示例一、左旋吡喹酮中吡喹胺的检查（柱前手性衍生化法）
手性衍生化试剂：乙酰葡萄糖异硫氰酸酯色谱条件：色谱柱 NOVA-Pack C18（ 150mm× 3.9mm）
流动相 甲醇 -0.01mol/L磷酸二氢钾
（ pH2.8）（ 51∶49 ）
该法所用的手性衍生化试剂可以与一级胺、二级胺在温和的条件下迅速反应，所生成的非对映体衍生物可以在普通色谱系统中进行分离分析。
示例二,DL-色氨酸的拆分（手性流动相拆分法）
色谱条件：
色谱柱 Zorbax ODS（ 250mm× 4.6mm），
流动相 含有 0.15%L-苯丙氨酸及 0.11%硫酸铜
（ CuSO4·5H2O）水溶液（以 0.05mol/L硫酸调 pH至 3.0） -
甲醇（ 9∶1 ）（流动相中 L-苯丙氨酸及硫酸铜浓度分别为 0.008mol/L和 0.004mol/L）。
流动相中 L-苯丙氨酸为配基交换型手性添加剂，硫酸铜为二价金属螯离子,L-苯丙氨酸与铜离子螯合，分布于流动相中，遇到色氨酸对映体，共同形成配位络合物对，然后在反相柱上拆分。
示例三、克仑特罗对映体的拆分（手性固定相拆分法）
色谱条件：
色谱柱 Chirex 3005手性色谱柱
[（ R） -1-萘基甘氨酸和 3,5-二硝基苯甲酸以共价键结合 ]
流动相 正己烷 -二氯乙烷 -甲醇该法的拆分机理为,三点手性识别模式,。
返 回三、核磁共振光谱分析法核磁共振光谱广泛用于化合物的结构分析，而其在化合物的定量分析中的应用则是比较新的内容，日益受到重视。
1．定量参数：峰面积或峰高。
2,定量的特点,
1）对于确定的核（质子），其信号强度与产生该信号的核（质子）的数目成正比，而与核的化学性质无关。
2）利用内标法或相对比较法分析混合物中某一化合物时，物需该化合物的纯品作为对照标准。
3）峰很窄，远小于各化合物之间的化学位移的差值，
因而混合物中不同组分的信号之间很少发生明显的重叠。
4）方法简单快速、准确、专属性高，不破坏被测样品，
可选择性的测定混合药物或药物制剂中的组分乃至药物的立体异构体。
3,测定方法,选择一个合适的峰作为测量峰。
（ 1） 内标法（绝对测量法） 内标法为 NMR定量分析最常用的方法，它与 GC的内标法相似，在样品溶液中，直接加入一定量内标物质后,NMR光谱测定，将样品指定基团上的质子引起的共振峰面积进行比较，当样品与内标均经精密称重时，则样品的绝对重量（ Wu）可由下式求得：
EEAAWW sususu E
EAAWW
s
u
s
u
su
%100?WW u百分含量＝
（ 2） 相对测量法 当不能获得样品的纯品或合适的内标时，可用相对测量法进行分析。操作方法与内标法相同。
计算相对含量是以指定基团上一个质子引起的吸收峰面积
（ A1 / n1）和杂质基团上一个质子引起的吸收峰面积（ A2
/ n2）进行比较，按下式计算：
%1 0 0
2
2
1
1
1
1
n
A
n
A
n
A
样品相对百分含量＝
返 回
