第十三章 生化药物和基因工程药物分析概念
基本要求
概述
质量检验的基本程序与方法
常用定量分析方法及其应用
练习与思考返回主目录基本要求
1,掌握本类药物质量检验的基本程序与方法类型 。
2,掌握 HPLC法和酶活力测定法在本类药物测定中的应用 。
3,熟悉本类药物的范围,种类,质量控制的要点 。
4,了解本类药物含量测定的其他方法 。
返 回一、防病、治病的 三大药源第一节 概 述
b i o p h a r m a c e u t i c s o r
b i o p h a r m a c e u t i c a l s
b i o c h e m i c a l d r u g s
b i o t e c h n o l o g y d r u g s
b i o l o g i c a l p r o d u c t s
药 物化 学 药 物生 物 药 物中 药生 化 药 物生 物 技 术 药 物生 物 制 品
1．生化药物：
例,氨基酸、多肽、蛋白质、酶等。
动 物植 物微 生 物提 取现 代 生 物 技 术生 命 基 本 物 质 及衍 生 物降 解 物大 分 子 的 结 构 修 饰 物生 物 - 化 学 半 合 成
2,基因工程药物,
以 DNA重组技术生产的蛋白质、多肽、
酶、激素、疫苗、单克隆抗体和细胞生长因子类药物。
DNA重组技术（基因工程）,生产过程 为天然基因合成的核苷酸序列内切酶连接酶载体重组的遗传物质转移到宿主细胞增殖、表达分离纯化目的产物二、种类氨基酸、多肽与蛋白质类酶类与辅酶类多糖类脂质类核酸及其降解物和衍生物类药物
1．生化药物
2．基因工程药物的种类
1）激素类及神经递质类药物：
人生长激素释放抑制因子、人胰岛素、人生长激素
2）细胞因子类药物：
人干扰素人白细胞介素、集落刺激因子、促红细胞生成素
3）酶类及凝血因子类药物三、特点
1,生物体的基本生化成分
2,分子量大,分子量测定
3,结构难确证
4,全过程的质量控制：原料、生产过程、
最终产品
5,生物活性检查
6,安全性检查
7,效价（含量）测定：
理化法,有效成分的含量效价测定和酶活力测定,有效成分的生物活性返 回生化药物和基因药物质量控制的项目：
来源与种类 纯度性状 干燥失重或水分鉴别 炽灼残渣氨酸组分分析 生物活性肽图 热源试验糖含量 含量分析第二节 质量检验的基本程序与方法一、鉴别理化鉴别法：化学鉴别法紫外分光光度法
HPLC法生化鉴别法：酶法电泳法等电聚焦法生物鉴别法：家兔惊厥试验
（ 一）理化鉴别法
1.化学鉴别法,
例：溶菌酶 - CONH- +Cu2+ 络合显色药 物 + 试 剂 现 象颜 色沉 淀
2.紫外分光光度法溶剂,0.01mol/L盐酸例：三磷酸腺苷二钠 浓度,20μg/ml
判断,λ max,257± 1nm
A250/A260,0.17～ 0.27。
3,HPLC法：
利用对照品溶液和供试品溶液色谱图的保留时间和肽图谱的一致性进行鉴别。
4.酶法,
例：尿激酶的鉴别 ---气泡上升法原理：
牛 纤 维 蛋 白 原牛 凝 血 酶蛋 白 结 块尿 激 酶牛 纤 维 蛋 白 溶 酶 原结 块 溶 解,气 泡 上 升方法,
取小试管,加入尿激酶巴比妥溶液,牛纤维蛋白原溶液,再依次加入牛纤维蛋白溶酶原溶液,牛凝血酶溶液,迅速摇匀,立即臵
37℃ ± 0.5℃ 恒温水浴保温,记时 。 反应系统在
30～ 40秒内凝结,凝结块内有气泡生成,15分钟内凝结块溶解,当凝结块溶解时,气泡逐渐上升 。 以 0.9%氯化钠作空白,同法 操作,凝结块在 2小时内不溶 。
5,电泳法,以肝素鉴别为例。
O
O
O
O
O
O H
C O O
-
O S O 3
-
H N S O 3
-
C H 2 O S O 3
-
与国家肝素标准品对照，其移动位臵相应。
6,生物法,
利用生物体进行试验来鉴别药物。
例：家兔惊厥试验鉴别胰岛素。
利用胰岛素的降糖作用。给家兔大剂量注射胰岛素，家兔惊厥，迅速静注
50%GS，惊厥停止。
（ 二）杂质检查一般杂质检查特殊杂质检查：原料药纯度分析生产过程中杂质的检查
1,原料药纯度分析,
多糖类 -----低聚糖、核酸、蛋白质酶类药物 -----酶催化反应基本产物的分析，
具有一定活性的其他有关酶的检查。
例,胰蛋白酶中糜蛋白酶的检查选用 N-乙酰 -L-酪氨酸乙酯作底物进行糜蛋白酶的限度检查。糜蛋白酶的限度为 2500个胰蛋白酶单位中不得大于 50单位，按每 1mg胰蛋白酶为 2500个单位和每 1mg糜蛋白酶为 1000单位，
折算成重量，则糜蛋白酶的限度为 5%（ g/g）。
1:1000=x:50 x=0.05（ mg） L=0.05/1=5%
2,生产过程中杂质的检查
（三）安全性试验热源试验异常毒性试验,急性毒性物质过敏试验：异性蛋白降压物质试验：导致血压降低的杂质、组胺、类组胺无菌试验：活菌基因工程药物中可能杂质与污染物检查来源于宿主细胞的残留 DNA，外源性杂质致突变试验生殖毒性试验
（四）含量测定生化药物和基因药物的含量表示方法：
百分含量,适用于结构明确的小分子药物或经水解后变成小分子的药物。
生物效价或酶活力单位,适用于酶类、
蛋白质类药物。
含量测定方法,
理化分析法,
化学分析法：重量测定法、滴定分析法电化学分析法光谱分析法：比色法、紫外分光、荧光分光光法色谱分析法,HPLC法,RP-HPLC,HPIEC,HPGFC、
灌注色谱法,HPCE法酶法,酶活力测定法、酶分析法电泳法生物检定法返 回
1,电化学分析法 药物膜电极生物组织膜电极药物电极 微生物电极离子选择性电极法 免疫电极免疫场效应管酶电极第三节 常用定量分析方法及其应用
2,HPLC法
1） RP-HPLC：柱前衍生化自动测定氨基酸柱,RP— 18,柱温,48℃
流动相,A--0.05% TFA； B--乙腈 -异丙醇（ 4,1）
梯度洗脱荧光检测器,?ex=280nm～ 340nm,?em=430nm
测定,
样品 ---肽样品水解,5.7mol/L盐酸,0.1%苯酚、通 N2，
110℃,20h ～ 24h。
样品干燥：真空样品的衍生化：丹酰氯水解剩余的衍生化试剂,0.4mol/L NaOH
进样测定
N ( C H 3 ) 2
S O 2 C l
R - N H 2
S O 2 N H R
N ( C H 3 ) 2
+
2） HPIEC
测定对象：蛋白质，多肽柱：离子交换键合相流动相,0.3mol/L～ 1.0mol/L的盐的缓冲液。
梯度洗脱：盐的浓度增大。尽量避免使用卤素类盐特点,可回收活性蛋白 。
3） HPGFC
应用：蛋白质、多肽的分离及分子量测定。
示例：重组人肿瘤坏死因子衍生物的分子量的测定柱,Beckman Ultraspherogel SEC 3000
流动相,0.1mmol/LKH2PO4:0.1mmol/LNa2SO4
（ 1:1） 0.05%叠氮化钠标准蛋白分子量曲线的制备,
醛缩酶血清白蛋白右旋糖苷蓝碳酸酐酶抑蛋白酶肽酪氨酸
T0 完全排阻完全进入填料空隙 Tt
标准蛋白分子量曲线,Kd -- lg M.W.
样品测定：
K d =
T - T 0
T t - T 0
测 定 样 品 的 T
查 出
K d
计 算
l g M,W,计 算 M,W,
应用示例,ChP（ 2000）重组人胰岛素的质量控制
1）鉴别：
法 1：在效价测定项下，供试品主峰的保留时间应与对照品的一致。
法 2：供试品与对照品分别经过酶解后，再分别进行梯 度洗脱，供试品的肽图谱与对照品的肽图谱一致。
2）检查：
检查项目：有关物质、高分子蛋白、锌、氮、
干燥失重、无菌、细菌内毒素。
有关物质：供试液经梯度洗脱，按峰面积归一化法计算有关物质的量不得超过 3.0%。
高分子蛋白质：
固定相,色谱用亲水硅胶，它可以分离分子量为 5000～ 6000的球状蛋白。
流动相,0.4mol/L 碳酸氢铵 -乙腈（ 69,31）
测定,分别测定供试液（ 1mg/ml）和对照液（将供试液稀释成 0.01mg/ml），供试液显示的所有分子量大于重组人胰岛素单体的各峰面积之和，
应不大于对照液主峰面积（限量 1.0%)。
3）效价测定：
固定相,ODS C18
流动相：硫酸盐缓冲液 -乙腈（ 74︰ 26）
系统适用性试验,测定胰岛素主峰和 A21脱氨胰岛素峰之间的分离度与拖尾因子。
含量测定,分别进样供试液和对照液，按峰面积外标法计算含量。
3.灌注色谱法固定相：聚苯乙烯二乙烯高度交联结构上构成贯穿孔颗粒分离介质 ----POROSR。
双模式孔结构,80～ 150nm大扩散孔
600～ 800nm贯穿孔允许液体传送流经过分离介质内表面,使样品由流动相直接灌注入介质颗粒中,扩散作用不再是主要的 。
介质颗粒内部可利用反应的表面积增加,
容量和分辨率也随之增加,可使生物活性大分子快速分离纯化 。
灌 注 色 谱 预 添 充 柱分 析 型
F 系 列,用 于 B i o C A D 工作 站 或 中 压 系 统
M 系 列,用 于 B i o C A D 工 作 站 和传 统 H P L C 的 分 离 纯 化
P 系 列,用 于 低 压,B i o C A D
工 作 站 或 中 压 系 统制 备 型
H 系 列,用 于 B i o C A D 工 作 站和 传 统 H P L C 系 统
（ P O R O S 1 0 ）灌 注 色 谱 预 添 充 柱反 相 柱阴 离 子 交 换 柱阳 离 子 交 换 柱亲 和 色 谱 柱活 化 的 亲 和 色 谱 柱疏 水 性 相 互 作 用 色 谱 柱
R
2．酶活力测定法
1）基本 原理,
酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。
酶活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化学反应速度。酶反应速度越快所表示的酶活力越高。
酶反应速度可以用单位时间反应底物的减少或产物的增加来表示。
通常酶活力测定时，先制备 酶反应进程曲线 和 酶浓度曲线 。通过酶反应速度的测定，求得酶的浓度或含量。
酶反应进程曲线 纵坐标为底物或产物的变化量，横坐标为反应时间，曲线斜率表示反应速度。从酶反应进程曲线求得反应的初速度。
酶浓度曲线 纵坐标为反应速度，横坐标为酶量。通过酶浓度曲线检验反应测定系统是否适宜。
酶活力测定的 要求,测得的反应速度必须和酶浓度有线性的比例关系，这也是检验酶反应和测定系统是否适宜、
正确的标准。
2）酶促反应的 条件 及 影响因素底物的浓度,一般选用底物的浓度 [S]=100Km。
pH：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、
适宜的 pH值的缓冲系统来控制 pH。
温度,酶反应的温度通常选用 25℃,30℃ 或
37℃,实验中温度变动应控制在 ± 0.1℃ 以内。
辅助因子,有些酶需要金属离子，有些需要相应的辅酶。
空白和对照试验,
空白试验：是指杂质反应和自发反应引起的变化量，它提供的是未知因素的影响。
空白值可以通过不加酶，或不加底物，或二者都加（酶预先经过失效处理）。
对照试验：是指用纯酶或标准酶制剂测得的结果，主要作为比较或标定的标准。
3）测定方法：
取样测定法：
酶 反 应 不 同 的 时 间 取 样 终 止 反 应 测 定酶 变 性 剂,5 % 三 氯 醋 酸
3 % 高 氯 酸其 它 酸,碱,醇 类加 热,使 酶 失 效连续测定法,在反应过程中对反应系统进行直接连续检测。
检测方法：
紫外 -可见分光光度法 旋光法荧光分光光度法 电化学测定法酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。
示例：胰蛋白酶效价测定胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸）
水解速率：酯键 ﹥ 酰氨键 ﹥ 肽键供试品溶液,50～ 60单位 /ml
底物溶液,N-苯甲酰 -L-精氨酸乙酯浓度,A,0.575～,0585
N-苯甲酰 -L-精氨酸乙酯 N-苯甲酰 -L-精氨酸
253nm处的 A随酶促反应递增，根据酶活力单位定义计算酶活力。
H 2 N - C - N H C H 2 C H 2 C H 2 - C H - C O O C 2 H 5
N H N H - C O -
酶活性单位,在最适的条件下，每分钟能转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性单位。
测定,
空白：底物溶液 + 0.001mol/L HCl
每 30s A的改变,0.015～ 0.018，
呈线性关系的时间不得少于 3min。
供 试 品 溶 液 + 底 物 溶 液计 时摇 匀
2 5,0
。
C + 0,5
。
C
测 定,每 隔 3 0 s,
读 取 A,共 5 m i n
—
A每分钟改变 0.003，相当于 1个胰蛋白酶单位。
供试液的 A每分钟改变
A 1 - A 2
T
相当于的单位数为每 mg供试品中含胰蛋白酶单位数为
0,0 0 3,1
A 1 - A 2
T=
,XA 1 - 20,0 0 3 T
A 1 - A 2
0,0 0 3 T W
P =
A 1 — A 2
0,0 0 3 T W
重组人白细胞介素 11的胰蛋白酶切肽图分析肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其生产工艺稳定性的重要方法,目前常用的方法有ＣＮＢｒ裂解ＳＤＳ -ＰＡＧＥ微量肽图法和胰蛋白酶切ＲＰ ＨＰＬＣ肽图法 。
1。酶切条件取浓度为 3ｍｇ ·ｍＬ -1的样品 0 4ｍＬ对 1%Ｎ
Ｈ 4ＨＣＯ 3充分透析,然后取透析样品 250μ Ｌ至微量进样瓶,加 0 3ｍｇ ·ｍＬ -1ＴＰＣＫ处理的胰蛋白酶 10μ Ｌ混匀,于 37℃ 温控自动进样器酶切,
每 80ｍｉｎ进样一针,进样量 6μ Ｌ,用Ｍｉｌｌ
ｅｎｎｉｕｍ 32色谱软件选择 214ｎｍ进行分析,
直至ｒｈＩＬ 11完全酶解 。 按此方法摸索最佳酶切时间,在第 14针后ｒｈＩＬ 11已被完全酶切,
酶切时间在 18～ 22ｈ范围内肽图图谱基本一致,
即确定最佳酶切条件为 37℃ 保温 20ｈ 。
2。ＨＰＬＣ系统测试
ＨＰＬＣ系统测试标准物质进样后呈 3个峰,12次重复进样 3个峰保留时间的ＲＳＤ分别为 0,4%,0,6%和 0,8%,峰面积的ＲＳＤ分别为
0,7%,0,8%和 0,8%。 ｒｈＩＬ 11对照品 37℃
酶切 20ｈ后于 4℃ 温控自动进样器连续进样 5次,
结果见图 1。 5个色谱图完全重叠在一起,所产生
21个峰的保留时间,峰高和峰面积的ＲＳＤ均分别小于 1,0%,5,4%和 9,8%,表明本系统误差小,重复性好,可用于ｒｈＩＬ 11的肽图分析 。
3批ｒｈＩＬ 11制品的ＲＰ ＨＰＬＣ图谱完全一致,说明该厂ｒｈＩＬ 11的生产工艺是稳定的 ;与ＧＩ公司生产的ｒｈＩＬ 11对照品比较有 20个峰与对照品一致,但第 6 峰的峰高和峰面积均明显较小,且在第 9和第 10 峰之间多一个峰,说明该厂ｒｈＩＬ 11蛋白质结构与ＧＩ
公司生产的ｒｈＩＬ 11比较存在细小差别 。
返 回练习与思考
1,何谓：生化药物,生物技术药物,
基因工程药物和生物制品？
2,生化药物和基因工程药物各分哪几种？
3,与化学合成药物的分析相比,生物药物的分析有何特点？
返 回
基本要求
概述
质量检验的基本程序与方法
常用定量分析方法及其应用
练习与思考返回主目录基本要求
1,掌握本类药物质量检验的基本程序与方法类型 。
2,掌握 HPLC法和酶活力测定法在本类药物测定中的应用 。
3,熟悉本类药物的范围,种类,质量控制的要点 。
4,了解本类药物含量测定的其他方法 。
返 回一、防病、治病的 三大药源第一节 概 述
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药 物化 学 药 物生 物 药 物中 药生 化 药 物生 物 技 术 药 物生 物 制 品
1．生化药物：
例,氨基酸、多肽、蛋白质、酶等。
动 物植 物微 生 物提 取现 代 生 物 技 术生 命 基 本 物 质 及衍 生 物降 解 物大 分 子 的 结 构 修 饰 物生 物 - 化 学 半 合 成
2,基因工程药物,
以 DNA重组技术生产的蛋白质、多肽、
酶、激素、疫苗、单克隆抗体和细胞生长因子类药物。
DNA重组技术（基因工程）,生产过程 为天然基因合成的核苷酸序列内切酶连接酶载体重组的遗传物质转移到宿主细胞增殖、表达分离纯化目的产物二、种类氨基酸、多肽与蛋白质类酶类与辅酶类多糖类脂质类核酸及其降解物和衍生物类药物
1．生化药物
2．基因工程药物的种类
1）激素类及神经递质类药物：
人生长激素释放抑制因子、人胰岛素、人生长激素
2）细胞因子类药物：
人干扰素人白细胞介素、集落刺激因子、促红细胞生成素
3）酶类及凝血因子类药物三、特点
1,生物体的基本生化成分
2,分子量大,分子量测定
3,结构难确证
4,全过程的质量控制：原料、生产过程、
最终产品
5,生物活性检查
6,安全性检查
7,效价（含量）测定：
理化法,有效成分的含量效价测定和酶活力测定,有效成分的生物活性返 回生化药物和基因药物质量控制的项目：
来源与种类 纯度性状 干燥失重或水分鉴别 炽灼残渣氨酸组分分析 生物活性肽图 热源试验糖含量 含量分析第二节 质量检验的基本程序与方法一、鉴别理化鉴别法：化学鉴别法紫外分光光度法
HPLC法生化鉴别法：酶法电泳法等电聚焦法生物鉴别法：家兔惊厥试验
（ 一）理化鉴别法
1.化学鉴别法,
例：溶菌酶 - CONH- +Cu2+ 络合显色药 物 + 试 剂 现 象颜 色沉 淀
2.紫外分光光度法溶剂,0.01mol/L盐酸例：三磷酸腺苷二钠 浓度,20μg/ml
判断,λ max,257± 1nm
A250/A260,0.17～ 0.27。
3,HPLC法：
利用对照品溶液和供试品溶液色谱图的保留时间和肽图谱的一致性进行鉴别。
4.酶法,
例：尿激酶的鉴别 ---气泡上升法原理：
牛 纤 维 蛋 白 原牛 凝 血 酶蛋 白 结 块尿 激 酶牛 纤 维 蛋 白 溶 酶 原结 块 溶 解,气 泡 上 升方法,
取小试管,加入尿激酶巴比妥溶液,牛纤维蛋白原溶液,再依次加入牛纤维蛋白溶酶原溶液,牛凝血酶溶液,迅速摇匀,立即臵
37℃ ± 0.5℃ 恒温水浴保温,记时 。 反应系统在
30～ 40秒内凝结,凝结块内有气泡生成,15分钟内凝结块溶解,当凝结块溶解时,气泡逐渐上升 。 以 0.9%氯化钠作空白,同法 操作,凝结块在 2小时内不溶 。
5,电泳法,以肝素鉴别为例。
O
O
O
O
O
O H
C O O
-
O S O 3
-
H N S O 3
-
C H 2 O S O 3
-
与国家肝素标准品对照，其移动位臵相应。
6,生物法,
利用生物体进行试验来鉴别药物。
例：家兔惊厥试验鉴别胰岛素。
利用胰岛素的降糖作用。给家兔大剂量注射胰岛素，家兔惊厥，迅速静注
50%GS，惊厥停止。
（ 二）杂质检查一般杂质检查特殊杂质检查：原料药纯度分析生产过程中杂质的检查
1,原料药纯度分析,
多糖类 -----低聚糖、核酸、蛋白质酶类药物 -----酶催化反应基本产物的分析，
具有一定活性的其他有关酶的检查。
例,胰蛋白酶中糜蛋白酶的检查选用 N-乙酰 -L-酪氨酸乙酯作底物进行糜蛋白酶的限度检查。糜蛋白酶的限度为 2500个胰蛋白酶单位中不得大于 50单位，按每 1mg胰蛋白酶为 2500个单位和每 1mg糜蛋白酶为 1000单位，
折算成重量，则糜蛋白酶的限度为 5%（ g/g）。
1:1000=x:50 x=0.05（ mg） L=0.05/1=5%
2,生产过程中杂质的检查
（三）安全性试验热源试验异常毒性试验,急性毒性物质过敏试验：异性蛋白降压物质试验：导致血压降低的杂质、组胺、类组胺无菌试验：活菌基因工程药物中可能杂质与污染物检查来源于宿主细胞的残留 DNA，外源性杂质致突变试验生殖毒性试验
（四）含量测定生化药物和基因药物的含量表示方法：
百分含量,适用于结构明确的小分子药物或经水解后变成小分子的药物。
生物效价或酶活力单位,适用于酶类、
蛋白质类药物。
含量测定方法,
理化分析法,
化学分析法：重量测定法、滴定分析法电化学分析法光谱分析法：比色法、紫外分光、荧光分光光法色谱分析法,HPLC法,RP-HPLC,HPIEC,HPGFC、
灌注色谱法,HPCE法酶法,酶活力测定法、酶分析法电泳法生物检定法返 回
1,电化学分析法 药物膜电极生物组织膜电极药物电极 微生物电极离子选择性电极法 免疫电极免疫场效应管酶电极第三节 常用定量分析方法及其应用
2,HPLC法
1） RP-HPLC：柱前衍生化自动测定氨基酸柱,RP— 18,柱温,48℃
流动相,A--0.05% TFA； B--乙腈 -异丙醇（ 4,1）
梯度洗脱荧光检测器,?ex=280nm～ 340nm,?em=430nm
测定,
样品 ---肽样品水解,5.7mol/L盐酸,0.1%苯酚、通 N2，
110℃,20h ～ 24h。
样品干燥：真空样品的衍生化：丹酰氯水解剩余的衍生化试剂,0.4mol/L NaOH
进样测定
N ( C H 3 ) 2
S O 2 C l
R - N H 2
S O 2 N H R
N ( C H 3 ) 2
+
2） HPIEC
测定对象：蛋白质，多肽柱：离子交换键合相流动相,0.3mol/L～ 1.0mol/L的盐的缓冲液。
梯度洗脱：盐的浓度增大。尽量避免使用卤素类盐特点,可回收活性蛋白 。
3） HPGFC
应用：蛋白质、多肽的分离及分子量测定。
示例：重组人肿瘤坏死因子衍生物的分子量的测定柱,Beckman Ultraspherogel SEC 3000
流动相,0.1mmol/LKH2PO4:0.1mmol/LNa2SO4
（ 1:1） 0.05%叠氮化钠标准蛋白分子量曲线的制备,
醛缩酶血清白蛋白右旋糖苷蓝碳酸酐酶抑蛋白酶肽酪氨酸
T0 完全排阻完全进入填料空隙 Tt
标准蛋白分子量曲线,Kd -- lg M.W.
样品测定：
K d =
T - T 0
T t - T 0
测 定 样 品 的 T
查 出
K d
计 算
l g M,W,计 算 M,W,
应用示例,ChP（ 2000）重组人胰岛素的质量控制
1）鉴别：
法 1：在效价测定项下，供试品主峰的保留时间应与对照品的一致。
法 2：供试品与对照品分别经过酶解后，再分别进行梯 度洗脱，供试品的肽图谱与对照品的肽图谱一致。
2）检查：
检查项目：有关物质、高分子蛋白、锌、氮、
干燥失重、无菌、细菌内毒素。
有关物质：供试液经梯度洗脱，按峰面积归一化法计算有关物质的量不得超过 3.0%。
高分子蛋白质：
固定相,色谱用亲水硅胶，它可以分离分子量为 5000～ 6000的球状蛋白。
流动相,0.4mol/L 碳酸氢铵 -乙腈（ 69,31）
测定,分别测定供试液（ 1mg/ml）和对照液（将供试液稀释成 0.01mg/ml），供试液显示的所有分子量大于重组人胰岛素单体的各峰面积之和，
应不大于对照液主峰面积（限量 1.0%)。
3）效价测定：
固定相,ODS C18
流动相：硫酸盐缓冲液 -乙腈（ 74︰ 26）
系统适用性试验,测定胰岛素主峰和 A21脱氨胰岛素峰之间的分离度与拖尾因子。
含量测定,分别进样供试液和对照液，按峰面积外标法计算含量。
3.灌注色谱法固定相：聚苯乙烯二乙烯高度交联结构上构成贯穿孔颗粒分离介质 ----POROSR。
双模式孔结构,80～ 150nm大扩散孔
600～ 800nm贯穿孔允许液体传送流经过分离介质内表面,使样品由流动相直接灌注入介质颗粒中,扩散作用不再是主要的 。
介质颗粒内部可利用反应的表面积增加,
容量和分辨率也随之增加,可使生物活性大分子快速分离纯化 。
灌 注 色 谱 预 添 充 柱分 析 型
F 系 列,用 于 B i o C A D 工作 站 或 中 压 系 统
M 系 列,用 于 B i o C A D 工 作 站 和传 统 H P L C 的 分 离 纯 化
P 系 列,用 于 低 压,B i o C A D
工 作 站 或 中 压 系 统制 备 型
H 系 列,用 于 B i o C A D 工 作 站和 传 统 H P L C 系 统
（ P O R O S 1 0 ）灌 注 色 谱 预 添 充 柱反 相 柱阴 离 子 交 换 柱阳 离 子 交 换 柱亲 和 色 谱 柱活 化 的 亲 和 色 谱 柱疏 水 性 相 互 作 用 色 谱 柱
R
2．酶活力测定法
1）基本 原理,
酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。
酶活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化学反应速度。酶反应速度越快所表示的酶活力越高。
酶反应速度可以用单位时间反应底物的减少或产物的增加来表示。
通常酶活力测定时，先制备 酶反应进程曲线 和 酶浓度曲线 。通过酶反应速度的测定，求得酶的浓度或含量。
酶反应进程曲线 纵坐标为底物或产物的变化量，横坐标为反应时间，曲线斜率表示反应速度。从酶反应进程曲线求得反应的初速度。
酶浓度曲线 纵坐标为反应速度，横坐标为酶量。通过酶浓度曲线检验反应测定系统是否适宜。
酶活力测定的 要求,测得的反应速度必须和酶浓度有线性的比例关系，这也是检验酶反应和测定系统是否适宜、
正确的标准。
2）酶促反应的 条件 及 影响因素底物的浓度,一般选用底物的浓度 [S]=100Km。
pH：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、
适宜的 pH值的缓冲系统来控制 pH。
温度,酶反应的温度通常选用 25℃,30℃ 或
37℃,实验中温度变动应控制在 ± 0.1℃ 以内。
辅助因子,有些酶需要金属离子，有些需要相应的辅酶。
空白和对照试验,
空白试验：是指杂质反应和自发反应引起的变化量，它提供的是未知因素的影响。
空白值可以通过不加酶，或不加底物，或二者都加（酶预先经过失效处理）。
对照试验：是指用纯酶或标准酶制剂测得的结果，主要作为比较或标定的标准。
3）测定方法：
取样测定法：
酶 反 应 不 同 的 时 间 取 样 终 止 反 应 测 定酶 变 性 剂,5 % 三 氯 醋 酸
3 % 高 氯 酸其 它 酸,碱,醇 类加 热,使 酶 失 效连续测定法,在反应过程中对反应系统进行直接连续检测。
检测方法：
紫外 -可见分光光度法 旋光法荧光分光光度法 电化学测定法酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。
示例：胰蛋白酶效价测定胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸）
水解速率：酯键 ﹥ 酰氨键 ﹥ 肽键供试品溶液,50～ 60单位 /ml
底物溶液,N-苯甲酰 -L-精氨酸乙酯浓度,A,0.575～,0585
N-苯甲酰 -L-精氨酸乙酯 N-苯甲酰 -L-精氨酸
253nm处的 A随酶促反应递增，根据酶活力单位定义计算酶活力。
H 2 N - C - N H C H 2 C H 2 C H 2 - C H - C O O C 2 H 5
N H N H - C O -
酶活性单位,在最适的条件下，每分钟能转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性单位。
测定,
空白：底物溶液 + 0.001mol/L HCl
每 30s A的改变,0.015～ 0.018，
呈线性关系的时间不得少于 3min。
供 试 品 溶 液 + 底 物 溶 液计 时摇 匀
2 5,0
。
C + 0,5
。
C
测 定,每 隔 3 0 s,
读 取 A,共 5 m i n
—
A每分钟改变 0.003，相当于 1个胰蛋白酶单位。
供试液的 A每分钟改变
A 1 - A 2
T
相当于的单位数为每 mg供试品中含胰蛋白酶单位数为
0,0 0 3,1
A 1 - A 2
T=
,XA 1 - 20,0 0 3 T
A 1 - A 2
0,0 0 3 T W
P =
A 1 — A 2
0,0 0 3 T W
重组人白细胞介素 11的胰蛋白酶切肽图分析肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其生产工艺稳定性的重要方法,目前常用的方法有ＣＮＢｒ裂解ＳＤＳ -ＰＡＧＥ微量肽图法和胰蛋白酶切ＲＰ ＨＰＬＣ肽图法 。
1。酶切条件取浓度为 3ｍｇ ·ｍＬ -1的样品 0 4ｍＬ对 1%Ｎ
Ｈ 4ＨＣＯ 3充分透析,然后取透析样品 250μ Ｌ至微量进样瓶,加 0 3ｍｇ ·ｍＬ -1ＴＰＣＫ处理的胰蛋白酶 10μ Ｌ混匀,于 37℃ 温控自动进样器酶切,
每 80ｍｉｎ进样一针,进样量 6μ Ｌ,用Ｍｉｌｌ
ｅｎｎｉｕｍ 32色谱软件选择 214ｎｍ进行分析,
直至ｒｈＩＬ 11完全酶解 。 按此方法摸索最佳酶切时间,在第 14针后ｒｈＩＬ 11已被完全酶切,
酶切时间在 18～ 22ｈ范围内肽图图谱基本一致,
即确定最佳酶切条件为 37℃ 保温 20ｈ 。
2。ＨＰＬＣ系统测试
ＨＰＬＣ系统测试标准物质进样后呈 3个峰,12次重复进样 3个峰保留时间的ＲＳＤ分别为 0,4%,0,6%和 0,8%,峰面积的ＲＳＤ分别为
0,7%,0,8%和 0,8%。 ｒｈＩＬ 11对照品 37℃
酶切 20ｈ后于 4℃ 温控自动进样器连续进样 5次,
结果见图 1。 5个色谱图完全重叠在一起,所产生
21个峰的保留时间,峰高和峰面积的ＲＳＤ均分别小于 1,0%,5,4%和 9,8%,表明本系统误差小,重复性好,可用于ｒｈＩＬ 11的肽图分析 。
3批ｒｈＩＬ 11制品的ＲＰ ＨＰＬＣ图谱完全一致,说明该厂ｒｈＩＬ 11的生产工艺是稳定的 ;与ＧＩ公司生产的ｒｈＩＬ 11对照品比较有 20个峰与对照品一致,但第 6 峰的峰高和峰面积均明显较小,且在第 9和第 10 峰之间多一个峰,说明该厂ｒｈＩＬ 11蛋白质结构与ＧＩ
公司生产的ｒｈＩＬ 11比较存在细小差别 。
返 回练习与思考
1,何谓：生化药物,生物技术药物,
基因工程药物和生物制品？
2,生化药物和基因工程药物各分哪几种？
3,与化学合成药物的分析相比,生物药物的分析有何特点？
返 回
