芳酸及其酯类药物的分析典型药物 鉴别试验 含量测定 体内药分返回主目录练习与思考杂质检查第六章基本要求基 本 要 求一,掌握水扬酸类,苯甲酸类药物的鉴别和含量测定的基本原理与方法 。
二,熟悉其他方酸类药物鉴别和含量测定的基本原理与方法 。。
三,了解本类药物的体内分析方法 。
返 回一、水扬酸类
（一）典型药物结构第一节 典型药物分类与理化性质
O H
C O O H
水杨酸（ salycylic
acid）
C O O H
O C O C H 3
阿司匹林（ aspirin)
C O O N a
O H
N H
2
对氨基水杨酸钠
（ sodium aminosalicylate)
O C
O
C O O H O H
双水杨酯（ salsalate)
C O O N H C O C H 3
O C O C H 3
贝诺酯（ benorilate)
1.酸性 SA(PKa2.95),ASA(PKa3.49),双水杨酯均有酸性。
2,溶解性,均为固体，有一定溶点。除钠盐溶于水，其余不溶。
3,UV和 IR光谱特性,分子结构中具有苯环,有 UV和 IR特征吸收。
4,芳伯氨基和酚羟基特性：
5,水解特性,ASA,双水杨酯及其制剂应检查水杨酸,对氨基水杨酸钠和贝诺酯检查间氨基酚和对氨基酚。
（二）主要理化性质
（一）典型药物结构苯甲酸及其钠盐 (benzoic acid ）
二、苯甲酸类
C O O H ( N a )
C O O C 2 H 5
O H
羟苯乙酯 (ethylparoben)
S O 2
C O O H
N ( C H 2 C H 2 C H 3 ) 2
丙磺舒 (probenecid)
N H
C O O H
C H 3
C H 3
甲芬那酸 (mefenamic acid)
（二）主要理化性质
1,溶解性,均为固体,有一定溶点 。 除钠盐溶于水,其余不溶 。
2,UV和 IR光谱特性,分子结构中具有苯环,有 UV和 IR特征吸收 。
3,具有酚羟基特性：
4.分解反应特性,苯甲酸钠分解为苯甲酸；丙磺舒分解为 SO2
5,酸性,苯甲酸,丙磺舒和甲芬那酸有游离的羧基,可用
NaOH直接滴定测定其含量 。
三、其他芳酸类
(一 )典型药物结构
C l O C
C H 3
C H 3
C O O C 2 H 5
氯贝丁酯（ clofibrate）
C H
C H 3
C O O HC H C H 2
C H 3
C H 3
布洛芬（ ibuprofen）
(二 )主要理化性质
1.溶解性,水中不溶，有机溶剂溶解，氯贝丁酯为液体；布洛芬为固体，有一定熔点。
2.UV和 IR特征吸收光谱,基于 分子结构中具有苯环和特征基团。
返 回一、与三氯化铁反应含有酚羟基药物可与 FeCl3反应；能与 FeCl3反应 不一定 含酚羟基,
第二节 鉴别试验
O H
RAr-OH + FeCl3
紫堇色铁配位化合物pH4~6
1,直接反应
SA在中性或弱酸性条件下，与 FeCl3生成紫堇色配位化合物赭色苯甲酸（中性或碱性水溶液） + FeCl3
C O O H COO
OH O Fe Fe
+ 4 F e C l 3 ( ) 2
3
+ 1 2 H C l6
丙磺舒与 NaOH成钠盐后，在 pH 5.0~6.0中与 FeCl3生成米黄色布洛芬与高氯酸羟胺,N,N’-双环基己羧二亚胺及高氯酸铁反应，
即显紫色 [JP（ 14） 方法 ]。基于分子中 -COOH的结构。
2,水解或分解后与三氯化铁反应
ASA水解成 SA后与 FeCl3 反应，成紫堇色二、重氮化 -偶合反应凡是分子结构中含有芳伯氨基或潜在芳伯氨基的药物均可反应。
A r - N H 2
A r - N H - C O C H 3
N a N O 2 + H C l
A r - N 2 Cl
H 2 O
p H = 7
ˉ
pH 7
pH 7
ˉ
ˉ
OH
A r - N = N -
A r - N = N -
A r - N = N -
SO 3 H
SO 3 H
- O H
- O H
N H C H 2 CH 2 NH 2
1,直接反应 对氨基水杨酸钠
2,水解后反应 贝诺酯具有潜在芳伯氨基
3,甲芬那酸 与 对 -硝基苯重氮盐 在 NaOH介质中 偶合 产生 橙红色 。
CH 3
CH 3
NH
C O O H C O O H
NH
CH 3
CH 3N a O H
N
NO 2
N
N N
+
+
NO 2
+ K2Cr2O7 深蓝色 棕绿色甲芬那酸 + H2SO4
黄色 绿色 荧光 [JP(14)△
三、氧化反应
1,ASA酸水解生成 SA和 CH3COOH,SA的 mp为 156℃ ～
161 ℃ 。
2,双水杨酯水解生成 SA,SA的 mp为 158℃ 。
3,氯贝丁酯碱水解后 与盐酸羟胺生成异羟肟酸盐，
在弱酸条件下再与三氯化铁反应生成 紫色 的异羟肟酸铁。
四、水解反应
1,苯甲酸盐加热分解生成 苯甲酸升华物,可用于鉴别 。
2,丙磺舒与 NaOH熔融分解成 Na2SO3,经硝酸氧化成
Na2SO4。
3,丙磺舒加热分解,生成 SO2气体,有臭味五、分解产物反应
1,测定 λmax ； λmin。
例如：布洛芬用 0.4%NaOH溶液制备 0.25mg/ml；
λmax ； 265nm,273nm; λmin。 245nm,271nm。
2,在 λmax 处测定一定浓度供试液的吸收度 A。
例如：羟苯乙酯,5μg/ml λmax =295nm; A = 0.48
3,在 λmax 处测定供试液的百分吸收系数。
例如：贝诺酯在 λmax =240nm; E1%1cm = 730~760
六、紫外吸收光谱法
4,在规定的波长测定吸收度比值（即双波长吸收度比值法）
例如：对氨基水杨酸钠 10μg/ml;
A265/A299 = 1.56~1.56
再例如：甲芬那酸 14μg/ml;
A278~280/A348~352 = 1.15~1.30
七、红外吸收光谱法水杨酸的红外吸收图谱
3700~2900cm-1
N-H,?O-H
1660cm-
1
C=O
1610,1570
1480,1440
C=C
775cm-1
Ar-H
返 回
3700~2900c
m-1
N-H,?O-H
1640cm-1
N-H
1580cm-1
1500cm-1
C=C
1300cm-1
C-N
1188cm-1
C-O
对氨基水杨酸钠的红外吸收图谱第三节 特殊杂质检查一,ASA中特殊杂质的检查
1.溶液的澄清度 主要检查 Na2CO3中不溶物,有苯酚；醋酸苯酯；水杨酸苯酯；乙酰水杨酸苯酯 。 ASA溶解因此 ASA溶液应澄清 。
2,游离水杨酸检查 利用 SA 可与 FeCl3呈色，用比色法检查。
3,易炭化物检查 主要检查 ASA中能被硫酸炭化显色的低分子有机杂质。采用与标准比色液比色的方法检查。
主要检查成品药物中可能残留的间氨基酚。间氨基酚易氧化呈色，而且有 毒性,因此要严格控制。
双向滴定法：利用间氨基酚溶于乙醚，取 3.0g
样品用乙醚提取 0.02mol/LHCl
测定方法 滴定 V＜ 0.3ml。
HPLC法：采用内标法，以磺胺作内标（ USP）
二、对氨基水杨酸钠中特殊杂质的检查三、羟苯乙酯中有关物质的检查
BP收载的方法，由于杂质的结构不清，故采用 TLC法 中的供试品 自身对照法,固定相,GF254C18化学键合硅胶展开剂：甲醇 -水 -冰醋酸反相 TLC法甲芬那酸是以邻 -氯苯甲酸和 2,3-二甲基苯胺在 Cu的催化下缩合而成，因此成品药物中要检查 铜盐 及 有关物质 。
分光光度法：利用 Cu 2+与 Na-DDC呈色后测定 A
1,铜盐检查法原子吸收分光光度法,BP（ 2000）
2,有关物质的检查 主要检查的是酰胺、二甲基苯胺和邻氯苯甲酸各国药典均采用 TLC法中的 自身高低浓度对照 法。
四、甲芬那酸中特殊杂质的检查五、氯贝丁酯中特殊杂质的检查
主要检查成品药物中残留的 对氯酚 原料和 挥发性杂质 GC-FID法
HPLC法：以对 -羟乙基酚作内标，用正相 HPLC
2,挥发性杂质的检查方法 GC法
1,对氯酚检查返 回一、酸碱滴定法
（一）直接滴定法 基于本类药物 -COOH； 可用碱直接滴定，如
ASA的含量测定，其原理如下：
第四节 含量测定
1,原理：
2,条件,在中性乙醇中，以酚酞作指示剂；摩尔比为 1:1。
3,应用,多国药典用于双水杨酯、苯甲酸、丙磺舒、布洛芬测定； USP和 BP还用于甲芬那酸的测定。
C O O H
O C O C H 3 + N a O H
C O O N a
O C O C H 3 + H 2 O
（二）水解后剩余滴定法
1,ASA含量测定原理：
条件,水溶液
2 N a O H + H 2 S O 4 N a 2 S O 4 + 2 H 2 O
C O O H
O C O C H 3 + 2 N a O H
C O O N a
O H + C H 3 C O O N a
具体试验：
I 份 NaOH
I 份 NaOH
V
VO
Vo-V相当于 ASA消耗硫酸的 ml数
ASA% = (Vo –V)× F× T/W× 100%
2,羟苯乙酯的含量测定
2 N a O H + H 2 S O 4 N a 2 S O 4 + 2 H 2 O
C O O C 2 H 5H O + N a O H C O O N aH O + C 2 H 5 O H
（三）两步滴定法
1,ASA片的含量测定第一步为中和
ASA + NaOH ASA-Na + H2O
水解产物 SA + NaOH SA-Na + H2O
酸性稳定剂 + NaOH 中性盐第二步为水 解与测定
2,氯贝丁酯含量测定第一步,中和酸性杂质第二步,水解与测定
C l O
C H 3
C C O O C 2 H 5
C H 3
+ N a O H
C l O
C H 3
C C O O N a
C H 3
+ C 2 H 5 O H
N a O H + H C l N a C l + H 2 O
二、亚硝酸钠滴定法对氨基水杨酸钠有芳伯氨基,在 HCl中与
NaNO2发生重氮化反应
Ar-NH2 + NaNO2 + 2HCl Ar-N2Cl + NaCl + 2H2O
因此可用亚硝酸钠滴定法测定其含量，此法在下章重点讨论。
三、双相滴定法是指在水相和有机相中的滴定。如苯甲酸钠的含量测定：
生成的苯甲酸不溶于水,终点 pH突跃不明显,不易观察 。
苯甲酸在乙醚中易溶,在水相中加入乙醚将滴定中产生的苯甲酸萃取入醚层 。 因此用双相滴定可使反应完全终点明显 。
C O O N a
+ H C l
C O O H
+ N a C l
（一）直接紫外分光光度法丙磺舒片的测定,Ch.P(2000) 在 HCl中，采用百分吸收系数法。
BP(1998)再盐酸 -乙醇,采用百分吸收系数法,
USP(24)用氯仿提取后，采用对照品比较法。
四、紫外分光光度法
（二）离子交换 -紫外分光光度法氯贝丁酯及其制剂 Ch.P(2000)采用酸碱滴定法；当含有酸性杂质 对氯酚 时，可采用 强碱性阴离子 交换树脂吸附酸性杂质后，
在甲醇溶液中,226nm波长处,采用对照品比较法。
具体计算,W× 1000 × 1/100 × 1/100 = Cu (μg/ml)
Au/As = Cu/C Cu = C(Au/As)
W(mg) = 10 × Cu = 10 × C(Au/As)
（ 三）柱分配色谱 -紫外分光光度法
USP(24)采用此法同时测定 ASA胶囊中
ASA和 SA。
1,SA的限量测定色谱柱的制备；对照品溶液的制备；供试品溶液的制备。
供试品液,CHCl3液洗脱液 1,CHCl3
洗脱液 2,HAC-
乙醚硅藻土,FeCl3-尿素玻璃棉硅藻土,Na2CO3 供试品液,CHCl
3-HCl液洗脱液 1,HAC-CHCl3
(1:10) 10ml
洗脱液 2,HAC- CHCl3
(1:100) 85ml
1-杂质先洗脱
2-SA后洗脱
max=306nm
Au＜ As
1-杂质先洗脱
2-ASA后洗脱
max=280nm
ASA(mg)=C(Au/As)
2,ASA的含量测定色谱柱的制备；对照品溶液的制备；
供试品溶液的制备。
Ch.P(2000)ASA的胶囊剂的含量测定采用此法。
USP（ 24） ASA片、对氨基水杨酸钠、甲芬那酸、
布洛芬、丙磺舒等及其制剂，采用此法。
五,HPLC法
（一） ASA栓剂的含量测定色谱条件,色谱柱 ODSC18； 流动相为甲醇,0.1%二乙胺,HAC
(40:60:4);检测波长 280nm； 内标物为咖啡因。
系统适用性试验,n ＞ 2000; ASA与 SA与内标物的 R ＞ 1.5
具体计算,Cx = Rx/RR× CR
W(g) × 1/50 × 2/50 = Cx
W测 = 1250 × Cx
标示量 % = W测 /W × W平 /标示量 × 100%
= Cx × 1250 × W平 /W × 标示量 × 100%
色谱条件,色谱柱苯基硅胶柱 ； 流动相为 NaH2PO3 0.1% HAC液 -
0.1% HAC乙腈液 (50:50);检测波长 254nm。
系统适用性试验,n ＞ 3900; T ＞ 2.3; 重复性 RSD＜ 1.5%
具体计算：
（二 ） 丙磺舒原料的含量测定
W × 1/100 = Cu(mg/ml); Cu = Au/As × C
供试品中丙磺舒 (Mg)=100C(Au/As)
返 回一、血清中 ASA和 SA浓度的 HPLC法色谱条件,色谱柱为 ODS-C18(150mm × 4.6mm,5μm)
流动相为甲醇 -水 -正丁醇 (30,20,1)
检测波长为 237nm； 内标物为苯甲酸。
血清样品预处理血清 100 μl + HClO450 μl + 不同浓度 ASA和 SA + 内标液涡旋混合 2min 离心 5min 取上清液 20 μl 进样。
第五节 体内药物分析回归方程,以峰高比（ H标 /H内 ）对浓度回归
ASA的回归方程,Y = 5.8× 10-3 + 5.29× 10-2X r = 0.9996
SA的回归方程,Y = 6.0× 10-3 + 8.33× 10-2X r = 0.9981
ASA和 SA的线性范围分别为,1～ 20 μg/ml; 2 ～ 30 μg/ml
回收率,空白血清 + 五种不同浓度测定,ASA为 96.0%～ 106.0%;
SA为 92.0%～ 119.5%;（五种不同浓度均应在线性范围内）
色谱条件,色谱柱为 LiChrospher100RP(125mm× 4mm,5μm)
流动相为 25%乙腈溶液 -醋酸缓冲溶液梯度洗脱。
检测波长为 254nm； 内标物为依他尼酸。
尿样品预处理,C8固相萃取柱,100mg填料 /ml用甲醇 1.0ml,然后用 0.5ml蒸馏水活化。
2.0ml尿样 + 内标 300μl(10μg/ml) 上柱 1.0ml水洗脱生物杂质 再用甲醇 0.5ml洗脱保留在柱上的丙磺舒和内标。洗脱液 0.45μm浸滤膜滤过，取 5μl直接进样分析。
二、尿中丙磺舒的固相萃取净化 -HPLC法 (运动员违禁药物 )
线性关系和回收率,
取空白尿样 2.0ml +不同浓度丙磺舒 +内标液 按上述方法分析 (浓度范围为 0.1μg/ml ～ 100μg/ml) ;A丙 /A内 对 C丙 回归。
回收率,丙磺舒为 100%± 3%(n=14)； 内标为 101%± 3%(n=12)；
人尿样测定,丙磺舒 (单剂量 500mg)尿排泄药 -时曲线 (见 P136)
三,HPLC法测定人血浆中布洛芬含量色谱条件,色谱柱为 Shim-packCLC-ODS(150mm× 6mm,10μm)
预柱为 YWG-C18； 流动相为甲醇 -20mol/L磷酸二氢钾冲溶液 (70:30,pH=4.0); 流速为 1.0ml/min;
检测波长为 221nm； 内标物为肉桂酸 。
样品预处理,取肝素抗凝血浆 0。 24ml+内标液 +甲醇 0.5ml,振荡混匀，离心 (1000r/min)15min,取上清液 10 μl直接进样分析。布洛芬和肉桂酸 tR为 5.15和 2.85min。
回归方程,以对照品与内标的峰高比对浓度回归，其回归方程为：
Y = 4.05 × 10-2C – 2.0 × 10-3,r = 0.9999。
回收率测定,空白血浆 + 布洛芬对照品高、中、低三种浓度，
按样品处理项下测定，测得平均回收率为 99.2 ± 1.6%。
精密度,日内精密度为 RSD＝ 1.8%； 日间精密度为 2.8%。
1.0,1.5,2.0,3.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0h自肘静脉取血 1.5ml,肝素抗凝，按,样品处理方法,项下操作，求算血药浓度，结果见 P137表 6－ 1。
试验结果：
1.血浆用甲醇除蛋白后，直接进样，经预柱净化，再进分析柱回收率高，分析速度快 (6min完成 )，分离效果好。
2.口服一次后 Tmax = 30min～ 90min； 体内维持 4h～ 6h。 与文献报道的结果一致。
3.本法可用于临床治疗药物浓度检测和药代动力学研究。
人血浆样品测定,受试者 8人；给药剂量 600mg,给药后 0.5,0.75
返 回练习与思考
[A型题 ]
1,阿斯匹林中检查的特殊杂质是
A.水杨醛 B.砷盐 C.水杨酸
D.苯甲酸 E.苯酚
2,对氨基水杨酸钠中检查的特殊杂质是
A.水杨醛 B,间氨基酚 C.水杨酸
D.苯甲酸 E.苯酚
[B型题 ]
A.FeCl3反应 B.水解后 FeCl3反应
C,AgNO3反应 D.重氮化 -偶合反应
E,麦芽酚反应
1,阿斯匹林
2,水杨酸
3,SMZ
4,苯甲酸钠
B
A
D
A
A,直接酸碱滴定法 B,两步酸碱滴定法
C,亚硝酸钠溶液滴定法
D,HPLC法 E,双相滴定法
5,苯甲酸钠
6,阿斯匹林
7,阿斯匹林栓剂
8,对氨基水杨酸钠
E
B
D
C
[X型题 ]
1,直接能与 FeCl3产生颜色反应的药物有
A。 水杨酸 B,盐酸普鲁卡因
C,对氨基水杨酸钠
D,对氨基酚 E,阿斯匹林
2,能发生重氮化 -偶合反应的药物有
A。 水杨酸 B,阿斯匹林
C,对氨基水杨酸钠 D,对氨基酚
E,盐酸普鲁卡因 返 回
二,熟悉其他方酸类药物鉴别和含量测定的基本原理与方法 。。
三,了解本类药物的体内分析方法 。
返 回一、水扬酸类
（一）典型药物结构第一节 典型药物分类与理化性质
O H
C O O H
水杨酸（ salycylic
acid）
C O O H
O C O C H 3
阿司匹林（ aspirin)
C O O N a
O H
N H
2
对氨基水杨酸钠
（ sodium aminosalicylate)
O C
O
C O O H O H
双水杨酯（ salsalate)
C O O N H C O C H 3
O C O C H 3
贝诺酯（ benorilate)
1.酸性 SA(PKa2.95),ASA(PKa3.49),双水杨酯均有酸性。
2,溶解性,均为固体，有一定溶点。除钠盐溶于水，其余不溶。
3,UV和 IR光谱特性,分子结构中具有苯环,有 UV和 IR特征吸收。
4,芳伯氨基和酚羟基特性：
5,水解特性,ASA,双水杨酯及其制剂应检查水杨酸,对氨基水杨酸钠和贝诺酯检查间氨基酚和对氨基酚。
（二）主要理化性质
（一）典型药物结构苯甲酸及其钠盐 (benzoic acid ）
二、苯甲酸类
C O O H ( N a )
C O O C 2 H 5
O H
羟苯乙酯 (ethylparoben)
S O 2
C O O H
N ( C H 2 C H 2 C H 3 ) 2
丙磺舒 (probenecid)
N H
C O O H
C H 3
C H 3
甲芬那酸 (mefenamic acid)
（二）主要理化性质
1,溶解性,均为固体,有一定溶点 。 除钠盐溶于水,其余不溶 。
2,UV和 IR光谱特性,分子结构中具有苯环,有 UV和 IR特征吸收 。
3,具有酚羟基特性：
4.分解反应特性,苯甲酸钠分解为苯甲酸；丙磺舒分解为 SO2
5,酸性,苯甲酸,丙磺舒和甲芬那酸有游离的羧基,可用
NaOH直接滴定测定其含量 。
三、其他芳酸类
(一 )典型药物结构
C l O C
C H 3
C H 3
C O O C 2 H 5
氯贝丁酯（ clofibrate）
C H
C H 3
C O O HC H C H 2
C H 3
C H 3
布洛芬（ ibuprofen）
(二 )主要理化性质
1.溶解性,水中不溶，有机溶剂溶解，氯贝丁酯为液体；布洛芬为固体，有一定熔点。
2.UV和 IR特征吸收光谱,基于 分子结构中具有苯环和特征基团。
返 回一、与三氯化铁反应含有酚羟基药物可与 FeCl3反应；能与 FeCl3反应 不一定 含酚羟基,
第二节 鉴别试验
O H
RAr-OH + FeCl3
紫堇色铁配位化合物pH4~6
1,直接反应
SA在中性或弱酸性条件下，与 FeCl3生成紫堇色配位化合物赭色苯甲酸（中性或碱性水溶液） + FeCl3
C O O H COO
OH O Fe Fe
+ 4 F e C l 3 ( ) 2
3
+ 1 2 H C l6
丙磺舒与 NaOH成钠盐后，在 pH 5.0~6.0中与 FeCl3生成米黄色布洛芬与高氯酸羟胺,N,N’-双环基己羧二亚胺及高氯酸铁反应，
即显紫色 [JP（ 14） 方法 ]。基于分子中 -COOH的结构。
2,水解或分解后与三氯化铁反应
ASA水解成 SA后与 FeCl3 反应，成紫堇色二、重氮化 -偶合反应凡是分子结构中含有芳伯氨基或潜在芳伯氨基的药物均可反应。
A r - N H 2
A r - N H - C O C H 3
N a N O 2 + H C l
A r - N 2 Cl
H 2 O
p H = 7
ˉ
pH 7
pH 7
ˉ
ˉ
OH
A r - N = N -
A r - N = N -
A r - N = N -
SO 3 H
SO 3 H
- O H
- O H
N H C H 2 CH 2 NH 2
1,直接反应 对氨基水杨酸钠
2,水解后反应 贝诺酯具有潜在芳伯氨基
3,甲芬那酸 与 对 -硝基苯重氮盐 在 NaOH介质中 偶合 产生 橙红色 。
CH 3
CH 3
NH
C O O H C O O H
NH
CH 3
CH 3N a O H
N
NO 2
N
N N
+
+
NO 2
+ K2Cr2O7 深蓝色 棕绿色甲芬那酸 + H2SO4
黄色 绿色 荧光 [JP(14)△
三、氧化反应
1,ASA酸水解生成 SA和 CH3COOH,SA的 mp为 156℃ ～
161 ℃ 。
2,双水杨酯水解生成 SA,SA的 mp为 158℃ 。
3,氯贝丁酯碱水解后 与盐酸羟胺生成异羟肟酸盐，
在弱酸条件下再与三氯化铁反应生成 紫色 的异羟肟酸铁。
四、水解反应
1,苯甲酸盐加热分解生成 苯甲酸升华物,可用于鉴别 。
2,丙磺舒与 NaOH熔融分解成 Na2SO3,经硝酸氧化成
Na2SO4。
3,丙磺舒加热分解,生成 SO2气体,有臭味五、分解产物反应
1,测定 λmax ； λmin。
例如：布洛芬用 0.4%NaOH溶液制备 0.25mg/ml；
λmax ； 265nm,273nm; λmin。 245nm,271nm。
2,在 λmax 处测定一定浓度供试液的吸收度 A。
例如：羟苯乙酯,5μg/ml λmax =295nm; A = 0.48
3,在 λmax 处测定供试液的百分吸收系数。
例如：贝诺酯在 λmax =240nm; E1%1cm = 730~760
六、紫外吸收光谱法
4,在规定的波长测定吸收度比值（即双波长吸收度比值法）
例如：对氨基水杨酸钠 10μg/ml;
A265/A299 = 1.56~1.56
再例如：甲芬那酸 14μg/ml;
A278~280/A348~352 = 1.15~1.30
七、红外吸收光谱法水杨酸的红外吸收图谱
3700~2900cm-1
N-H,?O-H
1660cm-
1
C=O
1610,1570
1480,1440
C=C
775cm-1
Ar-H
返 回
3700~2900c
m-1
N-H,?O-H
1640cm-1
N-H
1580cm-1
1500cm-1
C=C
1300cm-1
C-N
1188cm-1
C-O
对氨基水杨酸钠的红外吸收图谱第三节 特殊杂质检查一,ASA中特殊杂质的检查
1.溶液的澄清度 主要检查 Na2CO3中不溶物,有苯酚；醋酸苯酯；水杨酸苯酯；乙酰水杨酸苯酯 。 ASA溶解因此 ASA溶液应澄清 。
2,游离水杨酸检查 利用 SA 可与 FeCl3呈色，用比色法检查。
3,易炭化物检查 主要检查 ASA中能被硫酸炭化显色的低分子有机杂质。采用与标准比色液比色的方法检查。
主要检查成品药物中可能残留的间氨基酚。间氨基酚易氧化呈色，而且有 毒性,因此要严格控制。
双向滴定法：利用间氨基酚溶于乙醚，取 3.0g
样品用乙醚提取 0.02mol/LHCl
测定方法 滴定 V＜ 0.3ml。
HPLC法：采用内标法，以磺胺作内标（ USP）
二、对氨基水杨酸钠中特殊杂质的检查三、羟苯乙酯中有关物质的检查
BP收载的方法，由于杂质的结构不清，故采用 TLC法 中的供试品 自身对照法,固定相,GF254C18化学键合硅胶展开剂：甲醇 -水 -冰醋酸反相 TLC法甲芬那酸是以邻 -氯苯甲酸和 2,3-二甲基苯胺在 Cu的催化下缩合而成，因此成品药物中要检查 铜盐 及 有关物质 。
分光光度法：利用 Cu 2+与 Na-DDC呈色后测定 A
1,铜盐检查法原子吸收分光光度法,BP（ 2000）
2,有关物质的检查 主要检查的是酰胺、二甲基苯胺和邻氯苯甲酸各国药典均采用 TLC法中的 自身高低浓度对照 法。
四、甲芬那酸中特殊杂质的检查五、氯贝丁酯中特殊杂质的检查
主要检查成品药物中残留的 对氯酚 原料和 挥发性杂质 GC-FID法
HPLC法：以对 -羟乙基酚作内标，用正相 HPLC
2,挥发性杂质的检查方法 GC法
1,对氯酚检查返 回一、酸碱滴定法
（一）直接滴定法 基于本类药物 -COOH； 可用碱直接滴定，如
ASA的含量测定，其原理如下：
第四节 含量测定
1,原理：
2,条件,在中性乙醇中，以酚酞作指示剂；摩尔比为 1:1。
3,应用,多国药典用于双水杨酯、苯甲酸、丙磺舒、布洛芬测定； USP和 BP还用于甲芬那酸的测定。
C O O H
O C O C H 3 + N a O H
C O O N a
O C O C H 3 + H 2 O
（二）水解后剩余滴定法
1,ASA含量测定原理：
条件,水溶液
2 N a O H + H 2 S O 4 N a 2 S O 4 + 2 H 2 O
C O O H
O C O C H 3 + 2 N a O H
C O O N a
O H + C H 3 C O O N a
具体试验：
I 份 NaOH
I 份 NaOH
V
VO
Vo-V相当于 ASA消耗硫酸的 ml数
ASA% = (Vo –V)× F× T/W× 100%
2,羟苯乙酯的含量测定
2 N a O H + H 2 S O 4 N a 2 S O 4 + 2 H 2 O
C O O C 2 H 5H O + N a O H C O O N aH O + C 2 H 5 O H
（三）两步滴定法
1,ASA片的含量测定第一步为中和
ASA + NaOH ASA-Na + H2O
水解产物 SA + NaOH SA-Na + H2O
酸性稳定剂 + NaOH 中性盐第二步为水 解与测定
2,氯贝丁酯含量测定第一步,中和酸性杂质第二步,水解与测定
C l O
C H 3
C C O O C 2 H 5
C H 3
+ N a O H
C l O
C H 3
C C O O N a
C H 3
+ C 2 H 5 O H
N a O H + H C l N a C l + H 2 O
二、亚硝酸钠滴定法对氨基水杨酸钠有芳伯氨基,在 HCl中与
NaNO2发生重氮化反应
Ar-NH2 + NaNO2 + 2HCl Ar-N2Cl + NaCl + 2H2O
因此可用亚硝酸钠滴定法测定其含量，此法在下章重点讨论。
三、双相滴定法是指在水相和有机相中的滴定。如苯甲酸钠的含量测定：
生成的苯甲酸不溶于水,终点 pH突跃不明显,不易观察 。
苯甲酸在乙醚中易溶,在水相中加入乙醚将滴定中产生的苯甲酸萃取入醚层 。 因此用双相滴定可使反应完全终点明显 。
C O O N a
+ H C l
C O O H
+ N a C l
（一）直接紫外分光光度法丙磺舒片的测定,Ch.P(2000) 在 HCl中，采用百分吸收系数法。
BP(1998)再盐酸 -乙醇,采用百分吸收系数法,
USP(24)用氯仿提取后，采用对照品比较法。
四、紫外分光光度法
（二）离子交换 -紫外分光光度法氯贝丁酯及其制剂 Ch.P(2000)采用酸碱滴定法；当含有酸性杂质 对氯酚 时，可采用 强碱性阴离子 交换树脂吸附酸性杂质后，
在甲醇溶液中,226nm波长处,采用对照品比较法。
具体计算,W× 1000 × 1/100 × 1/100 = Cu (μg/ml)
Au/As = Cu/C Cu = C(Au/As)
W(mg) = 10 × Cu = 10 × C(Au/As)
（ 三）柱分配色谱 -紫外分光光度法
USP(24)采用此法同时测定 ASA胶囊中
ASA和 SA。
1,SA的限量测定色谱柱的制备；对照品溶液的制备；供试品溶液的制备。
供试品液,CHCl3液洗脱液 1,CHCl3
洗脱液 2,HAC-
乙醚硅藻土,FeCl3-尿素玻璃棉硅藻土,Na2CO3 供试品液,CHCl
3-HCl液洗脱液 1,HAC-CHCl3
(1:10) 10ml
洗脱液 2,HAC- CHCl3
(1:100) 85ml
1-杂质先洗脱
2-SA后洗脱
max=306nm
Au＜ As
1-杂质先洗脱
2-ASA后洗脱
max=280nm
ASA(mg)=C(Au/As)
2,ASA的含量测定色谱柱的制备；对照品溶液的制备；
供试品溶液的制备。
Ch.P(2000)ASA的胶囊剂的含量测定采用此法。
USP（ 24） ASA片、对氨基水杨酸钠、甲芬那酸、
布洛芬、丙磺舒等及其制剂，采用此法。
五,HPLC法
（一） ASA栓剂的含量测定色谱条件,色谱柱 ODSC18； 流动相为甲醇,0.1%二乙胺,HAC
(40:60:4);检测波长 280nm； 内标物为咖啡因。
系统适用性试验,n ＞ 2000; ASA与 SA与内标物的 R ＞ 1.5
具体计算,Cx = Rx/RR× CR
W(g) × 1/50 × 2/50 = Cx
W测 = 1250 × Cx
标示量 % = W测 /W × W平 /标示量 × 100%
= Cx × 1250 × W平 /W × 标示量 × 100%
色谱条件,色谱柱苯基硅胶柱 ； 流动相为 NaH2PO3 0.1% HAC液 -
0.1% HAC乙腈液 (50:50);检测波长 254nm。
系统适用性试验,n ＞ 3900; T ＞ 2.3; 重复性 RSD＜ 1.5%
具体计算：
（二 ） 丙磺舒原料的含量测定
W × 1/100 = Cu(mg/ml); Cu = Au/As × C
供试品中丙磺舒 (Mg)=100C(Au/As)
返 回一、血清中 ASA和 SA浓度的 HPLC法色谱条件,色谱柱为 ODS-C18(150mm × 4.6mm,5μm)
流动相为甲醇 -水 -正丁醇 (30,20,1)
检测波长为 237nm； 内标物为苯甲酸。
血清样品预处理血清 100 μl + HClO450 μl + 不同浓度 ASA和 SA + 内标液涡旋混合 2min 离心 5min 取上清液 20 μl 进样。
第五节 体内药物分析回归方程,以峰高比（ H标 /H内 ）对浓度回归
ASA的回归方程,Y = 5.8× 10-3 + 5.29× 10-2X r = 0.9996
SA的回归方程,Y = 6.0× 10-3 + 8.33× 10-2X r = 0.9981
ASA和 SA的线性范围分别为,1～ 20 μg/ml; 2 ～ 30 μg/ml
回收率,空白血清 + 五种不同浓度测定,ASA为 96.0%～ 106.0%;
SA为 92.0%～ 119.5%;（五种不同浓度均应在线性范围内）
色谱条件,色谱柱为 LiChrospher100RP(125mm× 4mm,5μm)
流动相为 25%乙腈溶液 -醋酸缓冲溶液梯度洗脱。
检测波长为 254nm； 内标物为依他尼酸。
尿样品预处理,C8固相萃取柱,100mg填料 /ml用甲醇 1.0ml,然后用 0.5ml蒸馏水活化。
2.0ml尿样 + 内标 300μl(10μg/ml) 上柱 1.0ml水洗脱生物杂质 再用甲醇 0.5ml洗脱保留在柱上的丙磺舒和内标。洗脱液 0.45μm浸滤膜滤过，取 5μl直接进样分析。
二、尿中丙磺舒的固相萃取净化 -HPLC法 (运动员违禁药物 )
线性关系和回收率,
取空白尿样 2.0ml +不同浓度丙磺舒 +内标液 按上述方法分析 (浓度范围为 0.1μg/ml ～ 100μg/ml) ;A丙 /A内 对 C丙 回归。
回收率,丙磺舒为 100%± 3%(n=14)； 内标为 101%± 3%(n=12)；
人尿样测定,丙磺舒 (单剂量 500mg)尿排泄药 -时曲线 (见 P136)
三,HPLC法测定人血浆中布洛芬含量色谱条件,色谱柱为 Shim-packCLC-ODS(150mm× 6mm,10μm)
预柱为 YWG-C18； 流动相为甲醇 -20mol/L磷酸二氢钾冲溶液 (70:30,pH=4.0); 流速为 1.0ml/min;
检测波长为 221nm； 内标物为肉桂酸 。
样品预处理,取肝素抗凝血浆 0。 24ml+内标液 +甲醇 0.5ml,振荡混匀，离心 (1000r/min)15min,取上清液 10 μl直接进样分析。布洛芬和肉桂酸 tR为 5.15和 2.85min。
回归方程,以对照品与内标的峰高比对浓度回归，其回归方程为：
Y = 4.05 × 10-2C – 2.0 × 10-3,r = 0.9999。
回收率测定,空白血浆 + 布洛芬对照品高、中、低三种浓度，
按样品处理项下测定，测得平均回收率为 99.2 ± 1.6%。
精密度,日内精密度为 RSD＝ 1.8%； 日间精密度为 2.8%。
1.0,1.5,2.0,3.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0h自肘静脉取血 1.5ml,肝素抗凝，按,样品处理方法,项下操作，求算血药浓度，结果见 P137表 6－ 1。
试验结果：
1.血浆用甲醇除蛋白后，直接进样，经预柱净化，再进分析柱回收率高，分析速度快 (6min完成 )，分离效果好。
2.口服一次后 Tmax = 30min～ 90min； 体内维持 4h～ 6h。 与文献报道的结果一致。
3.本法可用于临床治疗药物浓度检测和药代动力学研究。
人血浆样品测定,受试者 8人；给药剂量 600mg,给药后 0.5,0.75
返 回练习与思考
[A型题 ]
1,阿斯匹林中检查的特殊杂质是
A.水杨醛 B.砷盐 C.水杨酸
D.苯甲酸 E.苯酚
2,对氨基水杨酸钠中检查的特殊杂质是
A.水杨醛 B,间氨基酚 C.水杨酸
D.苯甲酸 E.苯酚
[B型题 ]
A.FeCl3反应 B.水解后 FeCl3反应
C,AgNO3反应 D.重氮化 -偶合反应
E,麦芽酚反应
1,阿斯匹林
2,水杨酸
3,SMZ
4,苯甲酸钠
B
A
D
A
A,直接酸碱滴定法 B,两步酸碱滴定法
C,亚硝酸钠溶液滴定法
D,HPLC法 E,双相滴定法
5,苯甲酸钠
6,阿斯匹林
7,阿斯匹林栓剂
8,对氨基水杨酸钠
E
B
D
C
[X型题 ]
1,直接能与 FeCl3产生颜色反应的药物有
A。 水杨酸 B,盐酸普鲁卡因
C,对氨基水杨酸钠
D,对氨基酚 E,阿斯匹林
2,能发生重氮化 -偶合反应的药物有
A。 水杨酸 B,阿斯匹林
C,对氨基水杨酸钠 D,对氨基酚
E,盐酸普鲁卡因 返 回
