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1
第十五章 吸光光度法
章总目录
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2
15.5 吸光度测量条件的选择
15.4 显色反应和显色条件的选择
15.3 分光光度计
15.2 光吸收定律
15.1 概述
15.6 吸光光度光法的应用
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3
15.1 概述
利用溶液颜色的深浅来测定溶液中有色物
质的浓度, 这种测定方法称为 比色分析法 。
用分光光度计进行比色分析的方法称为 分
光光度法。
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4
15.1.1 光的基本性质
光具有波粒二象性, 即 波动性, 粒子性 。
根据波长的不同，可分为：
紫外光区, 200nm ～ 380nm
可见光区, 380nm ～ 760nm
红外光区,760nm ～ 300μm
描述其波动性的主要参数是,波长 λ,频率
γ,光速 C。
三者间关系为,λγ＝ C
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5
具有同一波长的光称为 单色光 。 （ 动画 ）
光的 粒子性,如 光电效应, 光的吸收和发射 等。
即把光看成是带有能量的微粒流，这种微
粒叫做 光子 或者 光量子 。光的能量（ E）决定于
光的频率和波长：
?
c
hrhE ???
不同波长组成的光称为 复合光 。 （动画）
白光（如日光）是复合光，由 380nm～
760nm 混合而成。
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6
15.1.2 物质对光的选择性吸收
溶液为什么有颜色，其实质是什么？实验
证明，溶液的颜色是 由于均匀分布在溶液中的
有色化合物的质点选择性的吸收了某种颜色的
光所造成的 。日常生活中所见到的 白光,如日
光等是由 红、橙、黄、绿、青、蓝、紫 等光按
适当的强度比例混合而成的，在 380～ 760nm范
围的一种复合光。
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7
两种颜色的光若按适当比例混合，可以
形成白光，这两种光称为 互补色光 。
光的互补
白光 青蓝
青绿黄
橙
红 紫 蓝
互补色光
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8
如 KMnO4吸收 绿色光, 因此 KMnO4溶液
呈现 紫色 。
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9
15.1.3 吸收曲线
一束平行单色光照射溶液时，光的一部分
被吸收,一部分 透过溶液,一部分被器皿的表面
反射 。 如图
Io = Ia + It + Ir
若入射光强度为 Io，吸收光的强度为 Ia，透
过光强度为 It，反射光的强度为 Ir，它们的关系
是：
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10
分光光度法中,Io = Ia + It
在吸光光度法中，测定时都是采用 同样质
量的比色皿, 反射光的强度 基本上是不变的，
其影响可以 相互抵消 。 空白调零
透过光强度 It与入射光强度 Io之比称为 透光
度 或 透光率 。用 T 表示：
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11
o
t
I
I
T ?
或
%10 0% ??
o
t
I
I
T
从上式可以看出：
溶液的透光度愈大，
说明溶液对光的吸收愈小，浓度低；
相反，透光度愈小，
说明溶液对光的吸收愈大，浓度高。
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12
吸光度 A：
TI
I
A
t
o 1lglg ??
若光全部透过溶液,Io= It, A = 0 。
若光几乎全被吸收,It≈ 0,A = ∞。
吸光度 A也可以用来衡量溶液中吸光物质
对波长为 λ的单色光 的吸收程度，值越大，其
吸收程度越大；反之亦然。
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13
将 不同波长的光 透过 某一固定的溶液,测量 不
同波长 下溶液对光的 吸光度,作图 p261,图 15-1
400 480 560 640 720 nm
0.4
0.8
1.2
1.6
A
KMnO4 溶液的吸收曲线
D
C
B
A
A,B,C,D代表不
同浓度下的吸收曲线。
动画
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14
? （ 1）同一种物质对不同波长光的吸光度
不同。吸光度最大处对应的波长称为 最大吸
收波长 λmax。 （ KMnO4的 ?最大 = 525 nm）
? （ 2） 不同浓度的同一种物质, 其吸收曲
线形状相似 λmax不变 。 而对于不同物质, 它
们的吸收曲线 形状 和 λmax则不同 。 可作为物
质定性分析的依据之一 。
吸收曲线的讨论
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15
?（ 3） 不同浓度的同一种物质, 在某一定波
长下吸光度 A 有差异, A 随浓度的增大而增
大 。 此特性可作为物质 定量分析 的依据 。
?（ 4） 在 λmax处 吸光度随浓度变化的幅度
最大, 所以 测定最灵敏 。 吸收曲线是定量分
析中选择 入射光波长的重要依据 。
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16
15.1.4 吸光光度法的特点：
1、灵敏度高，下限为 10-5～ 10-6 mol·L-1。适
于微量分析。
2、准确度较高，相对误差为 2% ～ 5%。
3、操作快速简便，易于掌握。
4、应用广泛。
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17
15.2 溶液对光的吸收定律
实验证明：若保持入射光的波长不变，
溶液对光吸收的程度与 溶液的浓度、液层厚
度 有关。
15.2.1 溶液对光的吸收定律
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18
数学表达式：
bKA 1?
K1：比例常数,与 ?,c,T有关。
b：溶液厚度
一、朗伯定律,当 ?,c,T 一定时，溶液的 吸
光度 与液层的 厚度 成正比。 动画
二、比尔定律
比尔定律, 当 ?,b 和 T一定时，溶液的 吸光度
与溶液的 浓度 成正比。 动画
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19
数学表达式,A = K2 c
三、朗伯 —比尔定律 （同时考虑溶液浓度和液层
厚度的影响）一束平行单色光通过溶液，当
?和 T一定时，其 吸光度 与 溶液的浓度 和 液层
厚度 成正比。
数学表达式, A = K b c
适应范围广。 P262
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20
当 c用 g·L-1表示,b用 cm表示时,K用 a表示，
称为吸光系数，其单位为 L·(g.cm)-1,则：
四、比例系数 K
1、吸光系数 a
A = a b c
a是吸光物质在一定的条件下的特性常数,与本
性有关，与吸光物质的浓度和液层厚度无关 。
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21
c用 mol·L-1表示,b用 cm表示时,K用 ε表
示，称为摩尔吸光系数，其单位为
L·(mol.cm)-1。则：
2、摩尔吸光系数 ε
A =εb c
摩尔吸光系数 ε 的讨论
(1) ε是 吸收物质在一定波长和溶剂条件下的 特
征常数,不随浓度 c和液层厚度 b的改变而改变
。 在温度和波长等条件一定时,ε仅与吸收物
质本身的性质有关，与待测物浓度无关；
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22
(2)同一吸光物质在不同波长下的 ε值是不同的
。在最大吸收波长 λmax处的摩尔吸光系数，常
以 εmax表示。 εmax表明了该 吸收物质最大限度
的吸光能力,也反映了光度法测定该物质可能
达到的最大灵敏度。
(3)εmax越大表明该物质的吸光能力越强，用光
度法测定该物质的灵敏度越高。
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23
(4)ε在数值上等于浓度为 1mol·L-1、液层厚度
为 1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。
ε <104 反应灵敏度 低
104< ε <5× 104 反应灵敏度 中
5× 104< ε <105 反应灵敏度 高
ε >105 反应灵敏度 超高
当 c = 1mol·L-1,b = 1cm 时,A =ε
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24
ε值是有色物质在一定波长下的特征常数, 可
用它来衡量显色反应的灵敏度 。 ε值越大, 表
示该有色物质对此波长光的吸收能力愈强, 显
色反应愈灵敏 。
ε最大 ≥5× 104 灵敏的显色反应
在吸收曲线上, 与最大吸收波长相对应的
摩尔吸收系数 ε,以 ε最大 表示 。
对于微量组分的测定，一般选 ε较大的显
色反应，以提高测定的灵敏度。
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25
【 例 】,有一浓度为 1.0?g/ml Fe2+的溶液, 以 邻
二氮菲 显色后, 在比色皿厚度为 2cm,波长
510nm处测得吸光度为 0.380,计算 （ 1 ） 透光度
T； (2)吸光系数 a； （ 3） 摩尔吸光系数 ?。
解 （ 1） T＝ 10-A＝ 10-0.380＝ 0.417
（ 2）
（ 3）
112
3 109.1100.10.2
380.0 ??
? ???????? cmgLbc
Aa
114
3
101.1
85.55
100.1
0.2
380.0 ??
?
????
?
?
?? cmm o lL
bc
A
?
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26
3
2+
3
N
N
Fe+ Fe
2+
N
N
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27
注意,因为
cb
I
I
T
A
t
o ????? ?lg1lg
在吸光光度法中,b是一定的,A与 c成
正比，但 T不与 c成正比。
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28
五、吸光度的加合性
A总 = ∑ Ai =ε1b1c1 + ε2b2c2 + …… ε nbncn
总的吸光度等于各个吸光物质的吸光度之和。
或 溶液的吸光度应等于溶液中各组分的吸光度
之和。（ 组分间没有干扰 ）
A4 A3 A2 A1
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29
溶液中多组分测定
)()()()(
)()()()(
222
111
ybcyxbcxA
ybcyxbcxA
??
??
??
??
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30
15.2.2 有色溶液对朗伯 -比尔定律的偏离
一,物理因素：
1、单色光不纯，导致负偏差。
C
A
标准工作曲线图
正误差
负误差2、散射光的影响，胶体、乳浊液或悬浊液由于散射的
作用使吸光度增大，或入射
光不是垂直通过比色皿产生
正偏差。
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31
二、化学因素
1、吸光质点的相互作用，浓度较大时，产生负
偏差,朗伯 -比尔定律只适合于稀溶液 （ c <10-2
mol·L-1 )。
2、平衡效应，物质的离解、缔合、互变异构
及化学变化引起的偏离，如：
Fe(SCN)3 = Fe3+ + 3SCN-
Cr2O72- + H2O = 2CrO42- + 2H+
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32
15.3 分光光度计及主要部件
1光源,应有足够的发射强度而且稳定,如钨丝灯
2单色器,采用棱镜或光栅获得单色光。
3吸收池,比色皿，厚度有 0.5,1,2,3cm等。
4检测器,光电池或光电管。
光源 单色器 检测系统吸收池
动画
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33
722型 光栅分光光度计 结构示意图
分光光度计的分类以及 721 / 722型分光光
度计的使用方法见实验教材。
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34
722型光栅分光光度计外形示意图
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35
15.4 显色反应和显色条件的选择
显色反应和显色剂
在分光光度分析中，利用显色反应把待测组
分 X 转变为有色化合物，然后再进行测定。
使试样中的被测组分与化学试剂作用生成有
色化合物的反应叫 显色反应 。
mX(待测物 )＋ nR(显色剂 )＝ XmRn(有色化合物 )
显色反应主要有配位反应和氧化还原反应，
其中绝大多数是配位反应。
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36
15.4.1 对显色反应的要求
1、灵敏度高,选择 ?较大的显色反应。避免共
存组分干扰。
2、选择性好,显色剂只与被测组分反应。
3、有色物组成固定,如：
Fe3+ + 磺基水杨酸 → 三磺基水杨酸铁 (黄色 )
（组成固定）
Fe3+ + SCN - → FeSCN2+,Fe(SCN)2 + ……
（组成不固定）
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37
4、有色物稳定性高,其它离子干扰才小。如
三磺基水杨酸铁的 Kf =1042,F-, H3PO4 对
它无干扰。
5、显色过程易于控制,而且有色化合物与显
色剂之间的颜色差别应尽可能大。
nm60|| m a xm a x ??? RMR ????
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38
15.4.2 显色反应条件的选择
1、显色剂用量,适当过量。适宜的用量通过
实验求得
c(R)
A
c(R)
A
c(R)
A
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39
在 pH＝ 2～ 3 Fe(ssal)+
在 pH＝ 4～ 7 Fe(ssal)22-
在 pH＝ 8～ 10 Fe(ssal)3
在 pH>12 Fe(OH)3
棕橙色
沉淀
黄色
紫红色
2、溶液酸度,既要防止被测离子生成沉淀，
又需防止有色配合物离解。 有效的方法是加
入缓冲溶液（考虑干扰）
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40
5、溶剂,有机溶剂会降低有色物的离解度，从
而提高 显色反应的灵敏度。
6、共存干扰离子的影响及消除
(1) 控制酸度,使干扰离子不显色。
3、温度,通过实验找出适宜的温度范围。
4、时间,在颜色稳定的时间范围内进行比色测
定。
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41
(3) 改变干扰离子价态,测 Ni2+时,Fe2+ 有干扰，
加入氧化剂,Fe2+ → Fe3+,
(4) 分离干扰离子,用萃取、沉淀、电解、离子
交换等方法。
还可选择 适当的参比溶液 和 入射光的波长 等
方法来消除共存离子的干扰。
(2) 加入掩蔽剂,如用 SCN-测定 Co2+时,Fe3+有
干扰，加入 F-, Fe3+ + 6F- = FeF63-,
Fe3+ 被掩蔽。
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42
离子交换法用于 Fe3+,Al3+分离时．先用
HCl溶液处理试液，使铁、铝分别以 FeCl63-、
Al3+形态存在。然后经过 阳离子树脂 交换柱，
此时 Al3+留在柱上，而 FeCl63-流出柱子，从而
达到分离的目的。
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43
色谱分离法，若在充填硅胶、活性氧
化铝、纤维素等载体的柱子上进行，则称
为 柱上色谱分离法 ；若用滤纸作载体，则
称为 纸上色谱分离法 。
溶剂化合物 萃取体系，例如 磷酸三丁酯
萃取 FeCl3。
某些无机化合物 萃取体系，例如 CCl4萃取
I2。
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44
15.4.3 分光光度法常用的显色剂
（一）、无机显色剂
钼酸铵法 (测 P,Si,W)，
过氧化氢法 (测 V5＋, Ti4＋ )
（二）有机显色剂 （主要使用）
1,O,O给电子螯合剂：
铬天菁 S（ CAS）、苯基荧光酮（ PF ）
2,O,N给电子螯合剂,偶氮胂 III等
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45
3,N,N给电子基团, 邻二氮杂菲（测 Fe）等
4、带含硫基团的螯合剂,双硫腙（测 Cu,Pb
,Zn,Cd,Hg等）
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46
15.5 测定条件的选择
15.5.1、选择合适波长的入射光。 p268（ ?最大,
3点）
（ 545nm）
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47
原则：使溶液的吸光度能真正反映待测物的
浓度。
在吸光度测量中，作为比较的溶液或溶
剂称为参比溶液或空白溶液。
15.5.2选择适当的参比溶液。
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48
(1) 试样、试剂、显色剂都无色时，用 纯水作参
比 。
(2) 试样无色，试剂、显色剂有色，采用 不加试
样的空白溶液作参比 。 √（试剂空白）
(3)试样有吸收，而显色剂等无色，可采用不加
显色剂的试样为参比。 （试样空白）
(4)均有色，有吸收，对试样加入掩蔽剂，褪色
后再加显色剂等作为参比。 (褪色空白 )
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49
15.5.3 吸光度读数范围的选择
透光率读数的准确度是仪器精度的主要指标。
测定结果的精度常用浓度的相对误差 dc/c表示。
bcTA ???? lg
bdcdT
T
.Tlnd.Tlgd ??????? 43404340
A
dA
TT
dT
c
dc
??
lg
43 4.0
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50
若透光率刻度的读数的绝对误差为 ?T=1%，用
不同的 T代入上式，可得相应浓度测量的相对误
差 ?c/c，作图,p270图 15-7.
TlgT
T.
c
c ?? 4340
?
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51
1,T在 20%～ 65%
(A=0.19～ 0.70)范围，
相对误差较小。
2,T = 36.8%(A
=0.434)，相对误差
最小。
由图可见：
为了减小浓度的相对误差，提高测定的准
确度，一般应控制溶液吸光度 A在最适宜读数
范围 0.19～ 0.70。
(% )
c
c?
0.2 0.4 0.6 0.8 1.00
2
4
6
8
10
T
0.368
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52
【 例 】 某一有色溶液在 2.0cm的吸收皿中，测
得透光率 T＝ 1％，若仪器透光度的绝对误差
△ T＝ 0.5％，计算
（ 1）测定的浓度的相对误差△ c/c
（ 2）为使测得吸光度在最适读数范围内，溶
液应稀释或浓缩多少倍？
（ 3）若浓度不变，而改变比色皿厚度
（ 0.5cm,1.0cm,2.0cm,3.0cm）,则应选择那
种厚度的吸收皿最合适，此时△ c/c为多少？
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53
解 （ 1）
%
.lg.
%..
TlgT
T.
c
c
11
010010
504 3 404 3 40
??
?
?
??
??
（ 2） A=-lgT=-lg1%=2
设有色溶液原始浓度为 co，当 b一定时,A
＝ εbc＝ K?c，要使 A＝ 0.2～ 0.7，则
20
7
10
2
70
2
20 ??
?
c
c
c.
c
c.
????
即稀释 3～ 10倍
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54
（ 3）当 c一定时即 co,A＝ εbc＝ K?b,要
使 A＝ 0.2～ 0.7，则
20
7
10
2
70
2
20 ??
?
b
b
b.
b
b.
????
bo=2cm
70.20,b ??
b=0.5cm
%.
.lg.
%..
TlgT
T.
c
c
41
3 1 603 1 60
504 3 404 3 40
??
?
?
??
??
3 1 6010T 502
02
50 - 0, 5
..
.
.
A ?????
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55
控制吸光度在适宜的范围内 (A=0.19～ 0.70)
(1) 控制试样的量或溶液的稀释程度来控制
溶液浓度。
(2) 选择不同厚度的比色皿。
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56
15.6 吸光光度法的应用
15.6.1 常用方法
1、目视比色法,用眼睛比较溶液颜色深浅以
确定物质含量。（也叫 标准色阶法 ）
1 2 3 4 5
标准系列溶液
待测溶液
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57
目视比色法的原理是根据朗伯 ——比耳定律
222111 cbcb ?? ?
相同条件下显色且是同一种有色物质, 所以：
21 ?? ?
因为液层厚度相等,b1=b2，
所以浓度相等,c1=c2
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58
目视比色法的 优点 是：
1,仪器简单, 操作简便, 适宜于大批试样分
析 。
2,测定的灵敏度较高, 适宜于稀溶液中微量
元素的测定 。
3、复合光 — 白光下进行测定，因此有些
显色反应不符合朗伯 ——比耳定律时，仍
可用目视法测定。
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59
目视比色法的 缺点 是：
1、有色溶液一般不太稳定，常常临时配制一
套标准色阶，较麻烦费时。
2、依靠人的眼睛来观察颜色深度，有主观误
差，准确度不高，相对误差约为 5～ 20%。
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60
铵的比色测定 ——标准系列法：
原理：铵的测定是利用 NH4+ 与奈氏试剂 （
K2HgI4） 作用, 生成棕黄色胶体溶液 。
Hg
NH4+ + 2HgI42- + 4OH- = [O NH2]I↓ + 7I- +3H2O
Hg
溶液的颜色深浅与 NH4+浓度成正比 。
碘化二汞基铵 （ 碘
化氨基氧汞 ）
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61
2、光电比色法
利用 光电池 和 电流计 测量溶液透光强度的方
法。此仪器叫 光电比色计 。用光电比色计测量有
色物质含量的方法称为 光电比色法 。
原理,光电池产生光电流的大小与照射光的强度
成正比。一束白光通过 滤光片 后，得到比较
粗糙的单色光,通过一定厚度的溶液时，溶
液浓度越大，吸光度越大，光电流越小。
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62
测定,配制 标准 有色溶液，测出吸光度，
相同条件下测 试液 的吸光度。
c
A
Ax
cx
原理,与光电比色法基本相同，不同的是用分光
能力更强的 棱镜 或 光栅 进行分光，得到的光更近
似于单色光,灵敏度和准确度更高。
3、分光光度法
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63
15.6.2 单一组分的测量方法：
1、标准工作曲线法
先配制一系列标准溶液，在最大吸收波长处，
测出它们的吸光度，作图，同条件测未知液的
吸光度，从图中查出未知液的浓度。
c
A
标准工作曲线图
Ax
cx
c1 c2 c3 c4 c5
A1 A2 A3 A4 A5
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64
c
A
标准工作曲线图
同学们在制作标准曲线时有如下几种情况：
c
A
标准工作曲线图
c
A
标准工作曲线图
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65
2,标准比较法
同条件下分别测定未知液与标准溶液的吸光
度 Ax和 A标,根据朗伯 -比尔定律，应有下式：
xx cbA ?? 标标 cbA ??
标标 ccAA xx // ?
因为：
标
标
c
A
A
c x
x
??
所以：
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66
例如：将 1.000g钢样用 HNO3溶解，钢中的锰用
KIO4氧化成高锰酸钾，并稀释到 100.0ml，用
1.00cm比色皿在波长 525 nm测得此溶液的吸光
度为 0.700。一标准 KMnO4溶液的浓度为
1.52× 10-4 mol·L-1，在同样的条件下测得的吸光
度为 0.350，求试液中锰的浓度。
解：根据,的关系有：
S
x
S
x
c
c
A
A ?
41052.1350.0
700.0
???
xc
141004.3
24
?? ?????
? Lm o lccc MnK M n Ox
*（ 3）标准加入法
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67
15.6.3 高含量组分测定 ——示差法
1、原理
参比溶液, 浓度稍低的标准溶液 c1。
用 c1 调节 T%为 100（ A = 0），
若被测溶液的浓度为 c2 。
A1 = Kbc1 A2 = Kbc2
结论,两溶液的吸光度差 △ A与浓度差 △ c成正比。
△ A =A2 –A1 ＝ Kb（ c2－ c1） ＝ Kb△ c
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68
2、工作曲线法
标准溶液 c1,c2,c3… 。
以 c1作参比，调 A = 0，
测 c2,c3…… 的△ A，
△ A对△ c作图。
cx = △ cx + c1
同条件下测△ Ax。
从差示工作曲线中查
出△ cx。
△ A
△ c
△ Ax
△ cx
差示工作曲线
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69
3、两点比较法
以 c1作参比，调 A = 0。测另一标准溶液 cs的
△ As。 再测未知液 cx 的△ Ax 。
因为,△ Ax = Kb△ cx △ As = Kb△ cs
s
x
s
x
c
c
A
A
?
?
?
?
?
xx ccc ??? 1
s
x
sx
A
A
cc
?
?
????
所以：
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70
15.6.4 溶液中多组分测定（作了解，自看
p272，见图 15-9） 具体的我们前面讲过了
作业,p273 1,4,6,7,9
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71
Ir
It
Ia
Io
Io = Ia + It + Ir
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72
氢原子光谱图：
18 sm109 9 8.2 ????? cc 光速
??
Hα
3.656
57.4
Hβ
1.486
07.6
Hγ
0.434
91.6
Hδ
2.410
31.7
/nm?
1 / s)10 ( 14 ?? ?
返回
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73
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