波菜色素的提取和色素分离
extrction of pigments from spinach and
chromagraphic isolation
一、实验目的
? 1,通过绿色植物色素的提取和分离，
了解天然物质分离提纯方法；
? 2,通过柱色谱和薄层色谱分离操作，
加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原
理。
二、实验原理
? 绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿）、胡萝卜素
（橙）和叶黄素（黄）等多种天然色素。
? 叶绿素存在两种结构相似的形式即 叶绿素 a(C55
H72O5N4Mg)和 叶绿素 b(C 55H7O6N4Mg),其差别
仅是 a 中一个甲基被 b 中的甲酰基所取代。它们都
是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合
作用所必需的催化剂。植物中叶绿素 a 的含量通常
是 b 的 3 倍。尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，
但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极
性的溶剂。
? 胡萝卜素（ C40H56 ） 是具有长链结构的共轭多烯。
它有三种异构体，即 a-,β - 和 γ - 胡萝卜素，
其中 β - 异构体含量最多，也最重要。在生物体
内,β - 体受酶催化氧化即形成维生素 A 。目
前 β - 胡萝卜素已可进行工业生产，可作为维生
素 A 使用，也可作为食品工业中的色素。
? 叶黄素（ C40H56O2 ） 是胡萝卜素的羟基衍生物，
它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。与胡
萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶
解度较小。
N
N N
N
M g
C O
2
C H
3
C H
2
O
C H
H
3
C
H
3
C
R
C H
2
C H
3
C H
3
C H
2
C H
2
C
OO
C H
3
C H
3
C H
3
C H
3
C H
3
叶 绿 素 a ( R = C H
3
)
叶 绿 素 b ( R = C H O )
? 本实验从菠菜中提取上述几各色素，并通过薄层层
析和柱层析进行分离
C H 3H 3 C
R C H 3
C H 3 C H 3
C H 3 C H 3
RH 3 C
C H 3H 3 C
β - 胡 萝 卜 素 （ R = H ） 叶 黄 素 （ R = O H ）
C H 2 O H
维 生 素 A
三、主要仪器与试剂
? 仪器,研钵、布氏漏斗、圆底烧瓶、直
形冷凝管、层析缸
? 试剂,硅胶 G,中性氧化铝，甲醇，
石油醚（ 60-90 ℃ ），丙酮，乙酸乙
酯，菠菜叶。
四、实验流程
菠 菜 菠 菜 汁 萃 取 液研 磨过 滤 石 油 醚 - 甲 醇萃 取
浸 膏水
洗 涤, 蒸 馏
薄 层 层 析
柱 层 析
R f 值
色 带, 溶 液
五、操作步骤
? 1,菠菜色素的提取
? 称取 2g 洗净后的新鲜的菠菜叶，用剪刀剪碎并与
10mL 甲醇拌匀，在研钵中研磨约 5min 然后用布氏漏斗
抽滤菠菜汁，弃去滤渣。
? 将菠菜汁放回研钵，每次用 10mL 3:2 （体积比）的
石油醚 - 甲醇混合液萃取两次，每次需加以研磨并且抽
滤。合并深绿色萃取液，转入分液漏斗，每次用 5mL 水
洗涤两次，以除去萃取液中的甲醇。洗涤时要轻轻旋荡，
以防止产生乳化。弃去水 - 甲醇层，石油醚层用无水硫
酸钠干燥后滤入圆底烧瓶，在水浴上蒸去大部分石油醚至
体积约为 1mL 为止。
? 2,薄层层析
? 取四块显微载玻片，用硅胶 G 加 0.5% 羧甲基纤维素调制后制
板，晾干后在 110 ℃ 活化 1h 。
? 展开剂,（ a ）石油醚 - 丙酮 =8:2 （体积比）
? （ b ）石油醚 - 乙酸乙酯 =6:4 （体积比）
? 取活化后的层析板，点样后，小心放入预先加入选定展开剂的广
口瓶内，盖好瓶盖。待展开剂上升至规定高度时，取出层析板，
在空气中晾干，用铅笔做出标记，并进行测量，分别计算出 Rf
值。
? 分别用展开剂 a 和 b 展开，比较不同展开剂系统的展开效果。
观察斑点在板上的位置并排列出胡萝卜素、叶绿素和叶黄素的
Rf 值的大小次序。注意更换展开剂时，须干燥层析瓶
? 在层析柱中，加 3cm 高的石油醚。另取少量脱脂棉，先
在小烧杯用石油醚浸湿，挤压以驱除气泡，然后放在层析
柱底部，轻轻压紧，塞住底部。将 3g 层析用的中性氧化
铝（ 150－ 160 目），从玻璃漏斗中缓缓加入，小心打开
柱下活塞，保持石油醚高度不变，流下的氧化铝在柱子中
堆积。必要时用橡皮锤轻轻在层析柱的周围敲击，使吸附
剂装得均匀致密。柱中溶剂面由下端活塞控制，既不能满
溢，更不能干涸。装完后，上面再加一片圆形滤纸，打开
下端活塞，放出溶剂，直到氧化铝表面溶剂剩下 1－ 2mm
高时关上活塞（注意！在任何情况下，氧化铝表面不得露
出液面）。
? 将上述菠菜色素的浓缩液，用滴管小心地加到层析柱顶部，
加完后，打开下端活塞，让液面下降到柱面以上 1mm 左
右，关闭活塞，加数滴石油醚，打开活塞，使液面下降，
经几次反复，使色素全部进入柱体。
? 待色素全部进入柱体后，在柱顶小心加洗脱剂 — 石油醚 -
丙酮溶液 9:1 （体积比）。打开活塞，让洗脱剂逐滴放
出，层析即开始进行，用锥形瓶收集。当第一个有色成分
即将滴出时，取另一锥形瓶收集，得橙黄色溶液，它就是
胡萝卜素。
? 用石油醚 - 丙酮 7:3 （体积比）作洗脱剂，分出第二个
黄色带，它是叶黄素 （ 1 ） 。再用丁醇 - 乙醇 - 水
3:1:1 （体积比）洗脱叶绿素 a （蓝绿色）和叶绿素 b
（黄绿色）。
六、注释
? （ 1 ）叶黄素易溶于醇而在石油醚中
溶解度较小，从嫩绿菠菜得到的提取液
中，叶黄素含量很少，柱色谱中不易分
出黄色带。
七、思考题
? 1,试比较叶绿素、叶黄素和胡萝卜素
三种色素的极性，为什么胡萝卜素在层
析柱中移动最快？
extrction of pigments from spinach and
chromagraphic isolation
一、实验目的
? 1,通过绿色植物色素的提取和分离，
了解天然物质分离提纯方法；
? 2,通过柱色谱和薄层色谱分离操作，
加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原
理。
二、实验原理
? 绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿）、胡萝卜素
（橙）和叶黄素（黄）等多种天然色素。
? 叶绿素存在两种结构相似的形式即 叶绿素 a(C55
H72O5N4Mg)和 叶绿素 b(C 55H7O6N4Mg),其差别
仅是 a 中一个甲基被 b 中的甲酰基所取代。它们都
是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合
作用所必需的催化剂。植物中叶绿素 a 的含量通常
是 b 的 3 倍。尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，
但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极
性的溶剂。
? 胡萝卜素（ C40H56 ） 是具有长链结构的共轭多烯。
它有三种异构体，即 a-,β - 和 γ - 胡萝卜素，
其中 β - 异构体含量最多，也最重要。在生物体
内,β - 体受酶催化氧化即形成维生素 A 。目
前 β - 胡萝卜素已可进行工业生产，可作为维生
素 A 使用，也可作为食品工业中的色素。
? 叶黄素（ C40H56O2 ） 是胡萝卜素的羟基衍生物，
它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。与胡
萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶
解度较小。
N
N N
N
M g
C O
2
C H
3
C H
2
O
C H
H
3
C
H
3
C
R
C H
2
C H
3
C H
3
C H
2
C H
2
C
OO
C H
3
C H
3
C H
3
C H
3
C H
3
叶 绿 素 a ( R = C H
3
)
叶 绿 素 b ( R = C H O )
? 本实验从菠菜中提取上述几各色素，并通过薄层层
析和柱层析进行分离
C H 3H 3 C
R C H 3
C H 3 C H 3
C H 3 C H 3
RH 3 C
C H 3H 3 C
β - 胡 萝 卜 素 （ R = H ） 叶 黄 素 （ R = O H ）
C H 2 O H
维 生 素 A
三、主要仪器与试剂
? 仪器,研钵、布氏漏斗、圆底烧瓶、直
形冷凝管、层析缸
? 试剂,硅胶 G,中性氧化铝，甲醇，
石油醚（ 60-90 ℃ ），丙酮，乙酸乙
酯，菠菜叶。
四、实验流程
菠 菜 菠 菜 汁 萃 取 液研 磨过 滤 石 油 醚 - 甲 醇萃 取
浸 膏水
洗 涤, 蒸 馏
薄 层 层 析
柱 层 析
R f 值
色 带, 溶 液
五、操作步骤
? 1,菠菜色素的提取
? 称取 2g 洗净后的新鲜的菠菜叶，用剪刀剪碎并与
10mL 甲醇拌匀，在研钵中研磨约 5min 然后用布氏漏斗
抽滤菠菜汁，弃去滤渣。
? 将菠菜汁放回研钵，每次用 10mL 3:2 （体积比）的
石油醚 - 甲醇混合液萃取两次，每次需加以研磨并且抽
滤。合并深绿色萃取液，转入分液漏斗，每次用 5mL 水
洗涤两次，以除去萃取液中的甲醇。洗涤时要轻轻旋荡，
以防止产生乳化。弃去水 - 甲醇层，石油醚层用无水硫
酸钠干燥后滤入圆底烧瓶，在水浴上蒸去大部分石油醚至
体积约为 1mL 为止。
? 2,薄层层析
? 取四块显微载玻片，用硅胶 G 加 0.5% 羧甲基纤维素调制后制
板，晾干后在 110 ℃ 活化 1h 。
? 展开剂,（ a ）石油醚 - 丙酮 =8:2 （体积比）
? （ b ）石油醚 - 乙酸乙酯 =6:4 （体积比）
? 取活化后的层析板，点样后，小心放入预先加入选定展开剂的广
口瓶内，盖好瓶盖。待展开剂上升至规定高度时，取出层析板，
在空气中晾干，用铅笔做出标记，并进行测量，分别计算出 Rf
值。
? 分别用展开剂 a 和 b 展开，比较不同展开剂系统的展开效果。
观察斑点在板上的位置并排列出胡萝卜素、叶绿素和叶黄素的
Rf 值的大小次序。注意更换展开剂时，须干燥层析瓶
? 在层析柱中，加 3cm 高的石油醚。另取少量脱脂棉，先
在小烧杯用石油醚浸湿，挤压以驱除气泡，然后放在层析
柱底部，轻轻压紧，塞住底部。将 3g 层析用的中性氧化
铝（ 150－ 160 目），从玻璃漏斗中缓缓加入，小心打开
柱下活塞，保持石油醚高度不变，流下的氧化铝在柱子中
堆积。必要时用橡皮锤轻轻在层析柱的周围敲击，使吸附
剂装得均匀致密。柱中溶剂面由下端活塞控制，既不能满
溢，更不能干涸。装完后，上面再加一片圆形滤纸，打开
下端活塞，放出溶剂，直到氧化铝表面溶剂剩下 1－ 2mm
高时关上活塞（注意！在任何情况下，氧化铝表面不得露
出液面）。
? 将上述菠菜色素的浓缩液，用滴管小心地加到层析柱顶部，
加完后，打开下端活塞，让液面下降到柱面以上 1mm 左
右，关闭活塞，加数滴石油醚，打开活塞，使液面下降，
经几次反复，使色素全部进入柱体。
? 待色素全部进入柱体后，在柱顶小心加洗脱剂 — 石油醚 -
丙酮溶液 9:1 （体积比）。打开活塞，让洗脱剂逐滴放
出，层析即开始进行，用锥形瓶收集。当第一个有色成分
即将滴出时，取另一锥形瓶收集，得橙黄色溶液，它就是
胡萝卜素。
? 用石油醚 - 丙酮 7:3 （体积比）作洗脱剂，分出第二个
黄色带，它是叶黄素 （ 1 ） 。再用丁醇 - 乙醇 - 水
3:1:1 （体积比）洗脱叶绿素 a （蓝绿色）和叶绿素 b
（黄绿色）。
六、注释
? （ 1 ）叶黄素易溶于醇而在石油醚中
溶解度较小，从嫩绿菠菜得到的提取液
中，叶黄素含量很少，柱色谱中不易分
出黄色带。
七、思考题
? 1,试比较叶绿素、叶黄素和胡萝卜素
三种色素的极性，为什么胡萝卜素在层
析柱中移动最快？
