?第十章 吸光光度法
? 吸光光度法 （ Absorption Photometry） 是一
种基于物质对光的选择性吸收而建立起来的一种
分析方法 。 包括可见吸光光度法, 紫外 -可见吸光
光度法和红外光谱法等 。 吸光光度法同滴定分析
法, 重量分析法相比, 有以下一些特点,
? (一 )灵敏度高 吸光光度法测定物质的浓度下
限 (最低浓度 )一般可达 1-10-3%的微量组分 。 对固
体试样一般可测到 10-4%。 如果对被测组分事先加
以富集, 灵敏度还可以提高 1-2个数量级 。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
? (二 )准确度较高 一般吸光光度法的相对误
差为 2-5%，其准确度虽不如滴定分析法及重量法，
但对微量成分来说，还是比较满意的，因为在这种
情况下，滴定分析法和重量法也不够准确了，甚至
无法进行测定。
? (三 )操作简便, 测定速度快
? (四 )应用广泛 几乎所有的无机离子和有机化
合物都可直接或间接地用吸光光度法进行测定 。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
?第一节 物质对光的选择性吸收
一, 光的基本性质
? 光是电磁波。 其波长、频率与速度之间的关
系为,
E=hν =hc/ λ
h为普朗克常数, 其值为 6.63× 10-34J·s
二, 物质对光的选择性吸收
? 如果我们把具有不同颜色的各种物体放置在
黑暗处，则什么颜色也看不到。可见物质呈现的
颜色与光有着密切的关系，一种物质呈现何种颜
色，是与光的组成和物质本身的结构有关的。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
?（ 一 ） 物质对光产生选择性吸收和原因
?（ 二 ） 物质的颜色与吸收光的关系
? 从光本身来说, 有些波长的光线, 作用于眼睛
引起了颜色的感觉, 我们把人眼所能看见有颜色的
光叫做可见光, 其波长范围大约在 400-760nm之间 。
实验证明：白光 (日光, 白炽电灯光, 日光灯光等 )
是由各种不同颜色的光按一定的强度比例混合而成
的 。 如果让一束白光通过三棱镜, 就分解为红, 橙,
黄, 绿, 青, 蓝, 紫七种颜色的光, 这种现象称为
光的色散 。 每种颜色的光具有一定的波长范围 。 我
们把白光叫做复合光；把只具有一种颜色的光, 叫
做单色光 。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
? 实验还证明, 不仅七种单色光可以混合成白光,
如果把适当颜色的两种单色光按一定的强度比例混
合, 也可以成为白光 。 这两种单色光就叫做互补色 。
如绿光和紫光互补, 蓝光和黄光互补, 等等 。
? 对固体物质来说, 当白光照射到物质上时, 物
质对于不同波长的光线吸收, 透过, 反射, 折射的
程度不同而使物质呈现出不同的颜色 。 如果物质对
各种波长的光完全吸收, 则呈现黑色；如果完全反
射, 则呈现白色；如果对各种波长的光吸收程度差
不多, 则呈现灰色；如果物质选择性地吸收某些波
长的光, 那么, 这种物质的颜色就由它所反射或透
过光的颜色来决定 。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
? 对溶液来说, 溶液呈现不同的颜色, 是由于溶液
中的质点 (分子或离子 )选择性的吸收某种颜色的光所
引起的 。 如果各种颜色的光透过程度相同, 这种物质
就是无色透明的 。 如果只让一部分波长的光透过, 其
他波长的光被吸收, 则溶液就呈现出透过光的颜色,
也就是溶液呈现的是与它吸收的光成互补色的颜色 。
例如硫酸铜溶液因吸收了白光中的黄色光而呈蓝色；
高锰酸钾溶液因吸收了白光中的绿色光而呈现紫色 。
其实, 任何一种溶液, 对不同波长的光的吸收程度是
不相等的 。 如果将某种波长的单色光依次通过一定浓
度的某一溶液, 测量该溶液对各种单色光的吸收程度,
以波长为纵坐标, 以吸光度为纵坐标可以得到一条曲
线, 叫做吸收光谱曲线或光吸收曲线 。 它清楚地描述
了溶液对不同波长的光的吸收情况 。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
?（ 三）吸收曲线
? 以波长为横坐标, 吸光度为纵坐标作图, 即可
得到一条吸光度随波长变化的曲线, 称之为吸收曲
线或吸收光谱 。 图 10— 2是四个不同浓度的 KMnO4
溶液的光吸收曲线 。 从图 10— 2可以看出, 在可见
光范围内, KMnO4溶液对波长 525nm附近的绿色
光有最大吸收, 而对紫色和红色光则吸收很少 。 光
吸收程度最大处的波长, 称为最大吸收波长, 常用
λ最大 或 λmax表示, 任何可见光区内, 溶液的颜色主
要是由这个数值决定的 。 在正常情况下, 选用不同
浓度的某种溶液, 最大吸收波长也是固定不变的,
说明光的吸收与溶液中物质的结构有关 。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
图 10-2 KMnO4
溶液的吸收曲线
?(cKMnO4,
? a<b<c<d)
?第二节 光吸收的基本定律
?一, 朗伯 -比耳定律
?（ 一 ） 朗伯 -比耳定律的推导
? 朗伯 (Lambert)和比耳 (beer)分别于 1760 年和
1852年研究了光的吸收与有色溶液按层的厚度及溶
液浓度的定量关系, 奠定了分光光度分析法的理论
基础 。 当一束平行单色光照射到任何均匀, 非散射
的介质 （ 固体, 液体或气体 ）, 例如溶液时, 光的
一部分被介质吸收, 一部分透过溶液, 一部分被器
皿的表面反射 。 如果入射光的强度为 I0,吸收光的强
度为 Ia,透过光的强度为 It,反射光的强度为 Ir则它们
之间的关系为
? I0＝ Ir+Ia+It
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
? 在分光光度测定中, 盛溶液的比色皿都是采用相
同质且的光学玻璃制成的, 反射光的强度基本上是不
变的 (一般约为入射光强度的 4％ )其影响可以互相抵消,
于是可以简化为
? I0＝ It+Ia
? 纯水对于可见光的吸收极微, 故有色液对光的吸
收完全是由溶液中的有色质点造成的 。
? 当入射光的强度 I0一定时, 如果 Ia越大, It就越小,
即透过光的强度越小, 表明有色溶液对光的吸收程度
就越大 。
? 实践证明，有色溶液对光的吸收程度，与该溶液
的浓度、液层的厚度以及入射光的强度等因素有关。
如果保持入射光的强度不变，则光吸收程度与溶液的
浓度和液层的厚度有关。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
? 1.朗伯定律
? -dI=k1Idb logI0/I=K1b
?2.比耳定律
-dI=k2Idc logI0/I=K2c
?3.朗伯 -比耳定律
? 如果同时考虑溶液的浓度和液层的厚度都变化,
都影响物质对光的吸收, 则上述两个定律可合并为朗
伯 -比耳定律, 即得到,logI0/I=Kbc 令,A=logI0/I
则,A=KbC
? 此式为光吸收定律的数学表达式 。
? 式中 A称为吸光度, K是比例常数, 与入射光的
波长, 物质的性质和溶液的温度等因素有关 。
? I/I0称为透光率, 用 T表示 。 它与 A的关系为,
? A=lg1/T
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
?（ 二 ） 吸收系数和桑德尔灵敏度
? 1.吸收系数
? (1) 吸收系数 a
? 当 c的单位为 g/L,b的单位为 cm时,K用 a表示，
称为吸收系数，其单位为 L/g·cm，这时朗伯 -比耳
定律变为,A＝ abc
? (2) 摩尔吸收系数 κ
? 当式中浓度 c的单位为 mol/L，液层厚度的单位
为 cm时，则用另一符号 κ表示，称为摩尔吸收系数，
它表示物质的浓度为 1mol/L，液层厚度为 1cm时，
溶液的吸光度。其单位为 L/mol·cm。这时朗伯 -比
耳定律就变为,
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
? A＝ κbc
? 在分光光度分析实践中,我们不能直接取 1mol/L
这样高浓度的有色溶液来测定摩尔吸光系数值，而
是在适宜的低浓度时测定吸光度，然后通过计算求
得 κ值。
?2,桑德尔灵敏度
? 吸光光度法的灵敏度除用摩尔吸收系数 κ表示外，
还常用桑德尔灵敏度 S表示。
? 定义：当光度仪器的检测极限为 A=0.001时，单
位截面积光程内所能检出的吸光物质的最低质量
（ μg·cm-2）。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
? 由桑德尔灵敏度 S的定义可得到,
? A=0.001=κbc
??
M
M
bc M
bc MS
????
??
???
3
3
6
10
001.0
10
10
1000
1
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
? 即,S=M/κ
? 可见, 某物质的摩尔吸光系数 k越大, 其桑德
尔灵敏度 S越小, 即该测定方法的灵敏度越高 。
?3.标准曲线的绘制及应用
? 配制一系列已知浓度的标准溶液, 在一定条
件下进行测定 。 然后以吸光度为纵坐标, 以浓度为
横坐标作图, 得到一条标准曲线, 也称做工作曲线 。
曲线的斜率为 κb,由此可得到摩尔吸收系数 κ；也
可根据未知液的 Ax,在标准曲线上查出未知液的浓
度 cx。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
?二, 引起偏离朗伯 -比耳定律的原因
?(一 )物理因素
?1.单色光不纯所引起的偏离
? 严格地讲, 朗伯 -比耳定律只对一定波长的单色
光才成立 。 但在实际工作中, 目前用各种方法得到
的入射光并非纯的单色光, 而是具有一定波长范围
的单色光 。 那么, 在这种情况下, 吸光度与浓度并
不完全成直线关系, 因而导致了对朗伯 —比耳定律的
偏离 。
?2.非平行入射光引起的偏离
? 非平行入射光将导致光束的平均光程 b’大于吸
收池的厚度 b,实际测得的吸光度将大于理论值 。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
?3,介质不均匀性引起的偏离
? 朗伯 -比耳定律是建立在均匀、非散射基
础上的一般规律、如果介质不均匀，呈胶体、
乳浊、悬浮状态存在，则入射光除了被吸收
之外、还会有反射、散射作用。在这种情况
下，物质的吸光度比实际的吸光度大得多，
必然要导致对朗伯 -比耳定律的偏离。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
?（ 二 ） 化学因素
?1,溶液浓度过高引起的偏离
? 朗伯 -比耳定律是建立在吸光质点之间没有相
互作用的前提下 。 但当溶液浓度较高时, 吸光物
质的分子或离子间的平均距离减小, 从而改变物
质对光的吸收能力, 即改变物质的摩尔吸收系数 。
浓度增加, 相互作用增强, 导致在高浓度范围内
摩尔吸收系数不恒定而使吸光度与浓度之间的线
性关系被破坏 。
?2,化学变化所引起的偏离
? 溶液中吸光物质常因解离, 缔合, 形成新的
化合物或在光照射下发生互变异构等, 从而破坏
了平衡浓度与分析浓度之间的正比关系, 也就破
坏了吸光度 A与分析浓度之间的线性关系 。 产生
对朗伯 -比耳定律的偏离 。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
?第三节 吸光光度法的仪器
?一, 基本部件
? 一般由光源, 单色器 （ 分光系统 ）, 吸收池,
检测系统和信号显示系统等五部分组成 。
? （ 一 ） 光源
? 常用的光源为 6-12伏低压钨丝灯, 电源由温器供
给, 为了保持光源强度的稳定, 以获得准确的测定
果, 电压必须稳定 。
? （ 二 ） 单色器 （ 分光系统 ）
? 单色器的作用从光源发出的复合光中分出所需
要的单色光 。
? 单色器通常由由入射狭缝, 准直镜, 色散元件,
聚焦镜和出射缝组成 。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
?（ 三 ） 吸收池 （ 比色皿 ）
? 比色皿是用透明无色的光学玻璃制作的 。 大多
数比色皿为长方形, 也有圆柱形的 。 一般厚度为 0.5、
1,2和 3厘米 。
?（ 四 ） 检测系统 (又叫光电转化器 )
? 在光度计中, 常用的是硒光电池 。 晒光电池和眼
睛相似, 对于各种不同波长的光线, 灵敏度是不同的 。
对于波长为 500-600nm的光线最灵敏 。 而对紫外线,
红外线则不能应用 。
? 光电管和光电倍增管用于较精密的分光光度计中 。
具有灵敏度高, 光敏范围广及不易疲劳等特点 。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
?（ 五 ） 信号显示系统
? 早期使用的是检流计, 微安表, 电位计, 数字
电压表, 自动记录仪等 。
? 现代的分光光度计广泛采用数字电压表, 函数
记录仪, 示波器及数据处理台等 。
? 测量光电流的检流计常用悬镜式检流计 (也称作
直流复射式检流计 ),其灵敏度可达 10-9安培／格 。
为了保护检统计, 使用中要防止震动或大电流通过 。
检流计标尺上有两种刻度, 等刻度的是表示百分透
光率 (T％ ),对数刻度表示吸光度 (A)。
? 根据透光率 T,如果把入射光强度 IO当作 IO光强
单位, 透过光强度当作 100光强单位中的一部分, 这
一数值为百分透光度, 亦称为百分透光率 。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
二, 吸光度的测量原理
? 分光光度计实际上测得的是光电流或电压, 通
过转换器将测得的电流或电压转换为对应的吸光度 A。
测定时, 只要将待测物质推入光路, 即可直接读出
吸光度值 。
?测定步骤,
? 1,调节检测器零点, 即仪器的机械零点 。
? 2,应用不含待测组分的参比溶液调节吸光零点 。
? 3,待测组分吸光度的测定 。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
三, 分光光度计的类型
可见分光光度计, 紫外 -可见分光光度计和红外
分光光度计 。
(一 )单光束分光光度计
721,722,751型 。
751型分光光度计是一种波长范围较宽 (200-
1000nm),精密度较高的分光光度计 。 由光源 (钨丝
灯或氢灯 )发出的光线由反射镜反射, 使光线经狭缝
的下半部, 经准光镜进入单色器棱镜色散底, 由准
光镜将光聚焦于狭缝上半部而射出, 经液槽照射于
光电管上 。 由此可见, 仪器用同一狭缝作入光和出
光狭缝, 它们始终具有相同的宽度 。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
棱镜和透镜均由石英材料作成, 反光镜和准光
镜表面镀铝 。 所以全部系统保证紫外光谱通过 。 波
长 200-320nm范围用氢灯作光源, 波长 320-1000nm
范围用钨丝灯作光源波长 200-625nm用蓝敏光电管
(GD-5)测量进射光强度, 波长 625-1000nm用红放光
电管 (GD-6)测量透射光强度 。 吸光度和透光度刻在
读数电位差计转盘上, 而电流计起示零作用 。
(二 )双光束分光光度计
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
? 吸光光度法 （ Absorption Photometry） 是一
种基于物质对光的选择性吸收而建立起来的一种
分析方法 。 包括可见吸光光度法, 紫外 -可见吸光
光度法和红外光谱法等 。 吸光光度法同滴定分析
法, 重量分析法相比, 有以下一些特点,
? (一 )灵敏度高 吸光光度法测定物质的浓度下
限 (最低浓度 )一般可达 1-10-3%的微量组分 。 对固
体试样一般可测到 10-4%。 如果对被测组分事先加
以富集, 灵敏度还可以提高 1-2个数量级 。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
? (二 )准确度较高 一般吸光光度法的相对误
差为 2-5%，其准确度虽不如滴定分析法及重量法，
但对微量成分来说，还是比较满意的，因为在这种
情况下，滴定分析法和重量法也不够准确了，甚至
无法进行测定。
? (三 )操作简便, 测定速度快
? (四 )应用广泛 几乎所有的无机离子和有机化
合物都可直接或间接地用吸光光度法进行测定 。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
?第一节 物质对光的选择性吸收
一, 光的基本性质
? 光是电磁波。 其波长、频率与速度之间的关
系为,
E=hν =hc/ λ
h为普朗克常数, 其值为 6.63× 10-34J·s
二, 物质对光的选择性吸收
? 如果我们把具有不同颜色的各种物体放置在
黑暗处，则什么颜色也看不到。可见物质呈现的
颜色与光有着密切的关系，一种物质呈现何种颜
色，是与光的组成和物质本身的结构有关的。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
?（ 一 ） 物质对光产生选择性吸收和原因
?（ 二 ） 物质的颜色与吸收光的关系
? 从光本身来说, 有些波长的光线, 作用于眼睛
引起了颜色的感觉, 我们把人眼所能看见有颜色的
光叫做可见光, 其波长范围大约在 400-760nm之间 。
实验证明：白光 (日光, 白炽电灯光, 日光灯光等 )
是由各种不同颜色的光按一定的强度比例混合而成
的 。 如果让一束白光通过三棱镜, 就分解为红, 橙,
黄, 绿, 青, 蓝, 紫七种颜色的光, 这种现象称为
光的色散 。 每种颜色的光具有一定的波长范围 。 我
们把白光叫做复合光；把只具有一种颜色的光, 叫
做单色光 。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
? 实验还证明, 不仅七种单色光可以混合成白光,
如果把适当颜色的两种单色光按一定的强度比例混
合, 也可以成为白光 。 这两种单色光就叫做互补色 。
如绿光和紫光互补, 蓝光和黄光互补, 等等 。
? 对固体物质来说, 当白光照射到物质上时, 物
质对于不同波长的光线吸收, 透过, 反射, 折射的
程度不同而使物质呈现出不同的颜色 。 如果物质对
各种波长的光完全吸收, 则呈现黑色；如果完全反
射, 则呈现白色；如果对各种波长的光吸收程度差
不多, 则呈现灰色；如果物质选择性地吸收某些波
长的光, 那么, 这种物质的颜色就由它所反射或透
过光的颜色来决定 。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
? 对溶液来说, 溶液呈现不同的颜色, 是由于溶液
中的质点 (分子或离子 )选择性的吸收某种颜色的光所
引起的 。 如果各种颜色的光透过程度相同, 这种物质
就是无色透明的 。 如果只让一部分波长的光透过, 其
他波长的光被吸收, 则溶液就呈现出透过光的颜色,
也就是溶液呈现的是与它吸收的光成互补色的颜色 。
例如硫酸铜溶液因吸收了白光中的黄色光而呈蓝色；
高锰酸钾溶液因吸收了白光中的绿色光而呈现紫色 。
其实, 任何一种溶液, 对不同波长的光的吸收程度是
不相等的 。 如果将某种波长的单色光依次通过一定浓
度的某一溶液, 测量该溶液对各种单色光的吸收程度,
以波长为纵坐标, 以吸光度为纵坐标可以得到一条曲
线, 叫做吸收光谱曲线或光吸收曲线 。 它清楚地描述
了溶液对不同波长的光的吸收情况 。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
?（ 三）吸收曲线
? 以波长为横坐标, 吸光度为纵坐标作图, 即可
得到一条吸光度随波长变化的曲线, 称之为吸收曲
线或吸收光谱 。 图 10— 2是四个不同浓度的 KMnO4
溶液的光吸收曲线 。 从图 10— 2可以看出, 在可见
光范围内, KMnO4溶液对波长 525nm附近的绿色
光有最大吸收, 而对紫色和红色光则吸收很少 。 光
吸收程度最大处的波长, 称为最大吸收波长, 常用
λ最大 或 λmax表示, 任何可见光区内, 溶液的颜色主
要是由这个数值决定的 。 在正常情况下, 选用不同
浓度的某种溶液, 最大吸收波长也是固定不变的,
说明光的吸收与溶液中物质的结构有关 。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
图 10-2 KMnO4
溶液的吸收曲线
?(cKMnO4,
? a<b<c<d)
?第二节 光吸收的基本定律
?一, 朗伯 -比耳定律
?（ 一 ） 朗伯 -比耳定律的推导
? 朗伯 (Lambert)和比耳 (beer)分别于 1760 年和
1852年研究了光的吸收与有色溶液按层的厚度及溶
液浓度的定量关系, 奠定了分光光度分析法的理论
基础 。 当一束平行单色光照射到任何均匀, 非散射
的介质 （ 固体, 液体或气体 ）, 例如溶液时, 光的
一部分被介质吸收, 一部分透过溶液, 一部分被器
皿的表面反射 。 如果入射光的强度为 I0,吸收光的强
度为 Ia,透过光的强度为 It,反射光的强度为 Ir则它们
之间的关系为
? I0＝ Ir+Ia+It
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
? 在分光光度测定中, 盛溶液的比色皿都是采用相
同质且的光学玻璃制成的, 反射光的强度基本上是不
变的 (一般约为入射光强度的 4％ )其影响可以互相抵消,
于是可以简化为
? I0＝ It+Ia
? 纯水对于可见光的吸收极微, 故有色液对光的吸
收完全是由溶液中的有色质点造成的 。
? 当入射光的强度 I0一定时, 如果 Ia越大, It就越小,
即透过光的强度越小, 表明有色溶液对光的吸收程度
就越大 。
? 实践证明，有色溶液对光的吸收程度，与该溶液
的浓度、液层的厚度以及入射光的强度等因素有关。
如果保持入射光的强度不变，则光吸收程度与溶液的
浓度和液层的厚度有关。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
? 1.朗伯定律
? -dI=k1Idb logI0/I=K1b
?2.比耳定律
-dI=k2Idc logI0/I=K2c
?3.朗伯 -比耳定律
? 如果同时考虑溶液的浓度和液层的厚度都变化,
都影响物质对光的吸收, 则上述两个定律可合并为朗
伯 -比耳定律, 即得到,logI0/I=Kbc 令,A=logI0/I
则,A=KbC
? 此式为光吸收定律的数学表达式 。
? 式中 A称为吸光度, K是比例常数, 与入射光的
波长, 物质的性质和溶液的温度等因素有关 。
? I/I0称为透光率, 用 T表示 。 它与 A的关系为,
? A=lg1/T
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
?（ 二 ） 吸收系数和桑德尔灵敏度
? 1.吸收系数
? (1) 吸收系数 a
? 当 c的单位为 g/L,b的单位为 cm时,K用 a表示，
称为吸收系数，其单位为 L/g·cm，这时朗伯 -比耳
定律变为,A＝ abc
? (2) 摩尔吸收系数 κ
? 当式中浓度 c的单位为 mol/L，液层厚度的单位
为 cm时，则用另一符号 κ表示，称为摩尔吸收系数，
它表示物质的浓度为 1mol/L，液层厚度为 1cm时，
溶液的吸光度。其单位为 L/mol·cm。这时朗伯 -比
耳定律就变为,
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
? A＝ κbc
? 在分光光度分析实践中,我们不能直接取 1mol/L
这样高浓度的有色溶液来测定摩尔吸光系数值，而
是在适宜的低浓度时测定吸光度，然后通过计算求
得 κ值。
?2,桑德尔灵敏度
? 吸光光度法的灵敏度除用摩尔吸收系数 κ表示外，
还常用桑德尔灵敏度 S表示。
? 定义：当光度仪器的检测极限为 A=0.001时，单
位截面积光程内所能检出的吸光物质的最低质量
（ μg·cm-2）。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
? 由桑德尔灵敏度 S的定义可得到,
? A=0.001=κbc
??
M
M
bc M
bc MS
????
??
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3
3
6
10
001.0
10
10
1000
1
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
? 即,S=M/κ
? 可见, 某物质的摩尔吸光系数 k越大, 其桑德
尔灵敏度 S越小, 即该测定方法的灵敏度越高 。
?3.标准曲线的绘制及应用
? 配制一系列已知浓度的标准溶液, 在一定条
件下进行测定 。 然后以吸光度为纵坐标, 以浓度为
横坐标作图, 得到一条标准曲线, 也称做工作曲线 。
曲线的斜率为 κb,由此可得到摩尔吸收系数 κ；也
可根据未知液的 Ax,在标准曲线上查出未知液的浓
度 cx。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
?二, 引起偏离朗伯 -比耳定律的原因
?(一 )物理因素
?1.单色光不纯所引起的偏离
? 严格地讲, 朗伯 -比耳定律只对一定波长的单色
光才成立 。 但在实际工作中, 目前用各种方法得到
的入射光并非纯的单色光, 而是具有一定波长范围
的单色光 。 那么, 在这种情况下, 吸光度与浓度并
不完全成直线关系, 因而导致了对朗伯 —比耳定律的
偏离 。
?2.非平行入射光引起的偏离
? 非平行入射光将导致光束的平均光程 b’大于吸
收池的厚度 b,实际测得的吸光度将大于理论值 。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
?3,介质不均匀性引起的偏离
? 朗伯 -比耳定律是建立在均匀、非散射基
础上的一般规律、如果介质不均匀，呈胶体、
乳浊、悬浮状态存在，则入射光除了被吸收
之外、还会有反射、散射作用。在这种情况
下，物质的吸光度比实际的吸光度大得多，
必然要导致对朗伯 -比耳定律的偏离。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
?（ 二 ） 化学因素
?1,溶液浓度过高引起的偏离
? 朗伯 -比耳定律是建立在吸光质点之间没有相
互作用的前提下 。 但当溶液浓度较高时, 吸光物
质的分子或离子间的平均距离减小, 从而改变物
质对光的吸收能力, 即改变物质的摩尔吸收系数 。
浓度增加, 相互作用增强, 导致在高浓度范围内
摩尔吸收系数不恒定而使吸光度与浓度之间的线
性关系被破坏 。
?2,化学变化所引起的偏离
? 溶液中吸光物质常因解离, 缔合, 形成新的
化合物或在光照射下发生互变异构等, 从而破坏
了平衡浓度与分析浓度之间的正比关系, 也就破
坏了吸光度 A与分析浓度之间的线性关系 。 产生
对朗伯 -比耳定律的偏离 。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
?第三节 吸光光度法的仪器
?一, 基本部件
? 一般由光源, 单色器 （ 分光系统 ）, 吸收池,
检测系统和信号显示系统等五部分组成 。
? （ 一 ） 光源
? 常用的光源为 6-12伏低压钨丝灯, 电源由温器供
给, 为了保持光源强度的稳定, 以获得准确的测定
果, 电压必须稳定 。
? （ 二 ） 单色器 （ 分光系统 ）
? 单色器的作用从光源发出的复合光中分出所需
要的单色光 。
? 单色器通常由由入射狭缝, 准直镜, 色散元件,
聚焦镜和出射缝组成 。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
?（ 三 ） 吸收池 （ 比色皿 ）
? 比色皿是用透明无色的光学玻璃制作的 。 大多
数比色皿为长方形, 也有圆柱形的 。 一般厚度为 0.5、
1,2和 3厘米 。
?（ 四 ） 检测系统 (又叫光电转化器 )
? 在光度计中, 常用的是硒光电池 。 晒光电池和眼
睛相似, 对于各种不同波长的光线, 灵敏度是不同的 。
对于波长为 500-600nm的光线最灵敏 。 而对紫外线,
红外线则不能应用 。
? 光电管和光电倍增管用于较精密的分光光度计中 。
具有灵敏度高, 光敏范围广及不易疲劳等特点 。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
?（ 五 ） 信号显示系统
? 早期使用的是检流计, 微安表, 电位计, 数字
电压表, 自动记录仪等 。
? 现代的分光光度计广泛采用数字电压表, 函数
记录仪, 示波器及数据处理台等 。
? 测量光电流的检流计常用悬镜式检流计 (也称作
直流复射式检流计 ),其灵敏度可达 10-9安培／格 。
为了保护检统计, 使用中要防止震动或大电流通过 。
检流计标尺上有两种刻度, 等刻度的是表示百分透
光率 (T％ ),对数刻度表示吸光度 (A)。
? 根据透光率 T,如果把入射光强度 IO当作 IO光强
单位, 透过光强度当作 100光强单位中的一部分, 这
一数值为百分透光度, 亦称为百分透光率 。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
二, 吸光度的测量原理
? 分光光度计实际上测得的是光电流或电压, 通
过转换器将测得的电流或电压转换为对应的吸光度 A。
测定时, 只要将待测物质推入光路, 即可直接读出
吸光度值 。
?测定步骤,
? 1,调节检测器零点, 即仪器的机械零点 。
? 2,应用不含待测组分的参比溶液调节吸光零点 。
? 3,待测组分吸光度的测定 。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
三, 分光光度计的类型
可见分光光度计, 紫外 -可见分光光度计和红外
分光光度计 。
(一 )单光束分光光度计
721,722,751型 。
751型分光光度计是一种波长范围较宽 (200-
1000nm),精密度较高的分光光度计 。 由光源 (钨丝
灯或氢灯 )发出的光线由反射镜反射, 使光线经狭缝
的下半部, 经准光镜进入单色器棱镜色散底, 由准
光镜将光聚焦于狭缝上半部而射出, 经液槽照射于
光电管上 。 由此可见, 仪器用同一狭缝作入光和出
光狭缝, 它们始终具有相同的宽度 。
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
棱镜和透镜均由石英材料作成, 反光镜和准光
镜表面镀铝 。 所以全部系统保证紫外光谱通过 。 波
长 200-320nm范围用氢灯作光源, 波长 320-1000nm
范围用钨丝灯作光源波长 200-625nm用蓝敏光电管
(GD-5)测量进射光强度, 波长 625-1000nm用红放光
电管 (GD-6)测量透射光强度 。 吸光度和透光度刻在
读数电位差计转盘上, 而电流计起示零作用 。
(二 )双光束分光光度计
第 30讲 第十章 吸光光度法 第 1讲
