第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
?第四节 吸光光度法分析条件的选择
?一, 显色反应及其条件的选择
?（ 一 ） 显色反应和显色剂
? 1.显色反应
? 在分光光度分析中, 将试样中被测组分转变成
有色化合物的反应叫显色反应 。 显色反应可分两大
类, 即络合反应和氧化还原反应, 而络合反应是最
主要的显色反应 。 与被测组分化合成有色物质的试
剂称为显色剂 。 同一组分常可与若干种显色剂反应,
生成若干有色化合物, 其原理和灵敏度亦有差别 。
一种被测组分究竞应该用哪种显色反应, 可根据所
需标准加以选择 。
?选择显色反应的一般标准,
?(1) 选择性要好 。 一种显色剂最好只与一种被测组
分起显色反应, 这样干扰就少 。 或者干扰离子容易
被消除, 或者显色剂与被测组分和干扰离子生成的
有色化合物的吸收峰相隔较远 。
? (2)灵敏度要高 。 由于吸光光度法一般是测定微量
组分的, 灵敏度高的显色反应有利于微量组分酌测
定 。 灵敏度的高低可从摩尔吸光系数值的大小来判
断, κ值大灵敏度高, 否则灵敏度低 。 但应注意, 灵
敏度高的显色反应, 并不一定选择性就好, 对于高
含量的组分不一定要选用灵敏度高的显色反应 。
?(3)对比度要大 。 即如果显色剂有颜色, 则有色化合
物与显色剂的最大吸收波长的差别要大, 一般要求在 60nm以上 。
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? (4)有色化合物的组成要恒定,化学性质要稳
定 。 有色化合物的组成若不确定, 测定的再
现性就较差 。 有色化合物若易受空气的氧化,
日光的照射而分解, 就会引入测量误差 。
? (5)显色反应的条件要易于控制 。 如果条件
要求过于严格, 难以控制, 测定结果的再现
性就差 。
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?2.显色剂
?(1)无机显色剂
? 许多无机试剂能与金属离子起显色反应, 如 Cu2+
与氨水形成深蓝色的络离子 Cu(NH4)42+,SCN-与 Fe3+
形成红色的络合物 Fe(SCN)2+或 Fe(SCN)63-等 。 但是多
数无机显色剂的灵敏度和选择性都不高, 其中性能较
好, 目前还有实用价值的有硫氰酸盐, 钼酸铵, 氨水
和过氧化氢等 。
?(2)有机显色剂
? 许多有机试剂, 在一定条件下, 能与金属离子
生成有色的金属螯合物 (具有环状结构的络合物 )。
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将金属螯合物应用于光度分析中的优点是,
1,大部分金属螯合物都呈现鲜明的颜色, 摩
尔吸光系数大于 104,因而测定的灵敏度很高；
2,金属螯合物都很稳定, 一般离解常数都很
小, 而且能抗辐射；
3,专用性强, 绝大多数有机整合剂, 在一定
条件下, 只与少数或其一种金属离子络合, 而且同
一种有机螯合剂与不同的金属离子络合时, 生成具
有特征颜色的螯合物
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4,虽然大部分金属螯合物难溶于水,
但可被萃取到有机溶剂中, 大大发展了萃取
光度法 。
5,在显色分子中, 金属所占的比率很
低, 提高了测定的灵敏度 。 因此, 有机显色
剂是光度分析中应用最多最广的显色剂, 寻
找高选择性, 高灵敏度的有机显色剂, 是光
度分析发展和研究的重要内容 。
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? 在有机化合物分子中, 凡是包含有共轭双键的
基团如 —N＝ N—,—N＝ O,—NO2,对醌基, ＝ C＝
O(羰基 ),＝ C＝ S(硫羰基 )等, 一般都具有颜色,
原因是这些基团中的 л电子被光激发时, 只需要较
小的能量, 能吸收波长大于 200nm的光, 因此, 称
这些基团为生色团；某些含有未共用电子对的基团
如胺基 —NH2,RHN—,R2N—(具有一对未共用电子
对 ),羟基 -OH(具有两对末共用电子对 ),以及卤代
基 —F,—Cl,—Br,—I等, 它们与生色基团上的不
饱和键互相作用, 引起永久性的电荷移动, 从而减
小了分子的活化能促使试剂对光的最大吸收, 红移,
(向长波方向移动 ),使试剂颜色加深, 这些基团称
为助色团 。
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? 含有生色基团的有机化合物常常能与许多全
属离子化合生成性质稳定且具有特征颜色的化合
物, 且灵敏度和选择性都很高, 这就为用光度法
测定这些离子提供了很好的条件 。
? 有机显色剂的种类很多, 下面仅将应用较广
泛的几种介绍如下,
? 1.邻二氮菲
? 2.双硫腙
? 3,二甲酚橙
? 4,偶氮胂 III
? 5,铬天青 S
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?（ 二 ） 显色反应条件的选择
? 显色反应能否完全满足光度法的要求, 除了与显
色剂的性质有主要关系外, 控制好显色反应的条件也
是十分重要的, 如果显色条件不合适, 将会影响分析
结果的准确度 。
?1.显色剂的用量
? 显色就是将被测组分转变成有色化合物, 表示,
? M + R = MR
? (被测组分 ) (显色剂 ) (有色化合物 )
? 反应在一定程度上是可逆的 。 为了减少反应的可
逆性, 根据同离子效应, 加入过量的显色剂是必要的,
但也不能过量太多, 否则会引起副反应, 对测定反而
不利 。
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?2.溶液的酸度
? 溶液酸度对显色反应的影响很大, 这是由于溶液
的酸度直接影响着金属离子和显色剂的存在形式以及
有色络合物的组成和稳定性 。 因此, 控制溶液适宜的
酸度, 是保证光度分析获得良好结果的重要条件之一 。
? (1)酸度对被测物质存在状态的影响
? 大部分高价金属离子都容易水解, 当溶液的酸度
降低时, 会产生一系列羟基络离子或多核羟基络离子 。
高价金属离子的水解象多元弱酸的电离一样, 是分级
进行的 。
? 随着水解的进行, 同时还发生各种类型的聚合反
应 。 聚合度随着时间增大, 而最终将导致沉淀的生成 。
显然, 金属离子的水解, 对于显色反应的进行是不利
的, 故溶液的酸度不能太低 。
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? (2) 酸度对显色剂浓度和颜色的影响
? 光度分析中所用的大部分显色剂都是有
机弱酸 。 显色反应进行时, 首先是有机弱酸
发生离解, 其次才是络阴离子与金属离子络
合 。
? M + HR＝ MR + H+
? 从反应式可以看出，溶液的酸度影响着
显色剂的离解,并影响着显色反应的完全程
度。当然，溶液酸度对显色剂离解程度影响
的大小，也与显色剂的离解常数有关,Ka
大时，允许的酸度可大； Ka很小时，允许
的酸度就要小些。
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? 许多显色剂本身就是酸碱指示剂，当溶液酸
度改变时，显色剂本身就有颜色变化。如果显色
剂在某一酸度时，络合反应和指示剂反应同时发
生，两种颜色同时存在，就无法进行光度测定。
例如、二甲酚橙在溶液的 pH＞ 6.3时呈红色，在
pH＜ 6.3时呈柠檬黄色，在 pH＝ 6.3时，呈中间色，
故 pH＝ 6.3时,是它的变色点。而二甲酚橙与金属
离子的络合物却呈现红色。因此，二甲酚橙只有
在 pH＜ 6的酸性溶液中可作为金属离子的显色剂。
如果在 pH＞ 6的酸度下进行光度测定，就会引入
很大误差。
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? (3)对络合物组成和颜色的影响
? 对于某些逐级形成络合物的显色反应,
在不同的酸度时, 生成不同络合比的络合
物 。 例如铁与水杨酸的络合反应, 当
? pH＜ 4 [Fe3+(C7H4O3)2-]+ 紫色
? 4＜ pH＜ 9 [Fe3+(C7H4O3)22-]- 红色
? pH＞ 9 [Fe3+(C7H4O3)32-]3- 黄色
? 在这种情况下, 必须控制合适的酸度,
才可获得好的分析结果 。
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? 3.时间和温度
? 显色反应的速度有快有慢 。 显色反应速度, 几
乎是瞬间即可完成, 显色很快达到稳定状态, 并且
能保持较长时间 。 大多数显色反应速度较慢, 需要
一定时间, 溶液的颜色才能达到稳定程度 。 有些有
色化合物放置一段时间后, 由于空气的氧化, 试剂
的分解或挥发, 光的照射等原因, 使颜色减退 。 适
宜的显色时间和有色溶液稳定程度, 也必须通过实
验来确定 。 实验方法是配制一份显色溶液, 从加入
显色剂计算时间, 每隔几分钟测定一次吸光度, 绘
制 A-t曲线, 根据曲线来确定适宜的时间 。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
? 不同的显色反应需要不同的温度, 一般显色反
应可在室温下完成 。 但是有些显色反应需要加热至
一定的温度才能完成；也有些有色络合物在较高温
度下容易分解 。 因此, 应根据不同的情况选择适当
的温度进行显色 。 温度对光的吸收及颜色的深浅也
有一定的影响, 故标样和试样的显色温度应保持一
样 。 合适显色温度也必须通过实验确定,做 A-C曲线
即可求出 。
? 4.有机溶剂和表面活性剂
? 溶剂对显色反应的影响表现在下列几方面 。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
?（ 1） 溶剂影响络合物的离解度 许多有色化合物在水中的离
解度大, 而在有机溶剂中的离解度小, 如在 Fe(SCN)3溶液中加
入可与水混溶的有机试剂 (如丙酮 ),由于降低了 Fe(SCN)3的离
解度而使颜色加深提高了测定的灵酸度 。
?（ 2） 溶剂改变络合物颜色的原因可能是各种溶剂分子的极性
不同, 介电常数不同, 从而影响到络合物的稳定性, 改变了络
合物分子内部的状态或者形成不同的溶剂化物的结果 。
?（ 3） 溶剂影响显色反应的速度 例如, 当用氯代磺酚 S测定
Nb时, 在水溶液中显色需几小时, 如果加入丙酮后,仅需 30分
钟 。
? 表面活性剂的加入可以提高显色反应的灵敏度, 增加有色
化合物的稳定性 。 其作用原理一方面是胶束增溶, 另一方面是
可形成含有表面活性剂的多元络合物 。
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? 5.共存离子的干扰及消除
? 共存离子存在时对光度测定的影响有以下几种类
型,
? (1) 与试剂生成有色络合物 。 如用硅钼蓝光度法
测定钢中硅时, 磷也能与钼酸铵生成络合物, 同时
被还原为钼蓝, 使结果偏高 。
? (2)干扰离子本身有颜色 。 如 Co2+(红色 ),Cr3+(绿
色 ),Cu2+(蓝色 )。
? (3)与试剂结合成无色络合物消耗大量试剂而使被
测离子络合不完全 。 如用水扬酸测 Fe3+时, Al3+、
Cu2+等有影响 。
? (4)与被测离子结合成离解度小的另一化合物 。 如
由于 F- 的 存 在, 能与 Fe3+ 以 FeF63- 形 式 存 在,
Fe(SCN)3本不会生成, 因而无法进行测定 。
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? 消除干扰的方法主要有以下三种,
? （ 1） 控制酸度
? 控制显色溶液的酸度, 是消除干扰的简
便而重要的方法 。 许多显色剂是有机弱酸,
控制溶液的酸度, 就可以控制显色剂 R的浓
度, 这样就可以使某种金属离子显色, 使另
外一些金属离子不能生成有色络合物 。
? 当溶液的情况比较复杂, 或各种常数值
不知道队则溶液最适合的 pH值须通过实验方
法来确定 。
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?（ 2） 加入掩蔽剂
? 在显色溶液里加一种能与干扰离子反应生成无
色络合物的试剂, 也是消除干扰的有效而常用的方
法 。 例如用硫氰酸盐作显色剂测定 Co2+,Fe3+有干优
可加入氟化物, 使 Fe3+与 F-结合生成无色而稳定的
FeF63-,就可以消除干扰 。
? 在另外的情况下, 也可通过氧化 —还原反应,
改变干扰离子的价态以消除于扰 。
?（ 3）采用萃取光度法 用适当的有机溶剂萃取有
色组分,如用丁二酮肟测定钯时,钯与丁二酮肟所形
成的内络盐,可被氯仿从酸性溶液中选择性地萃取。
许多干扰离子则不被萃取。
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?（ 4） 在不同波长下测定两种显色配合物的吸光度,
对它们进行同时测定 。
?（ 5） 寻找新的显色反应
? 如将二元配合物改变为三元配合物 。
?（ 6） 分离干扰离子
? 在没有适当掩蔽剂时, 干扰离于可用电解法,
淀法或离子交换法等分离除去 。
? 此外, 还可以通过选择适当的测量条件, 消除
干扰离子的影响 。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
二, 吸光光度法的测量误差及测量条件的选择
? 光度分析法的误差来源有两方面, 一方面是
各种化学因素所引入的误差, 另一方面是仪器精
度不够, 测量不准所引入的误差 。
?（ 一 ） 仪器测量误差
? 任何光度计都有一定的测量误差 。 仪器测量
误差主要是指光源的发光强度不稳定, 光电效应
的非线性, 电位计的非线性, 杂散光的影响, 滤
光片或单色器的质量差 (谱带过宽 ),比色皿的透
光率不一致, 透光率与吸光度的标尺不准等因素 。
对给定的光度计来说, 透光率或吸光度的读数的
准确度是仪器精度的主要指标之一, 也是衡量测
定结果准确度的重要因素 。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
光度计主要仪器测量误差是表头透射比的读数误
差 。 光度计的读数标尺上透射比 T的刻度是均匀的,
故透射比的读数误差 ΔT（ 绝对误差 ） 与 T本身的大
小无关, 对于一台给定仪器它基本上是常数, 一般
大 0.002-0.01之间, 仅与仪器身身的精度有关 。
bcTA ???? ln4 3 4.0 Tbc ln434.0 ???
T
dT
bdc ??? ?
4 34.0 TT dTTT dTcdcE r lg4 3 4.0ln ???
。，AeT
T
TT
TdT
TT
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c
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小浓度测量的相对误差最时即吸光度故
令
434.0,368.0
01ln
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)ln1(
)ln(
)'ln()'(
1
22
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?????
?
?（ 二 ） 测量条件的选择
? 选择适当的测量条件, 是获得准确测定结
果的重要途径 。 择适合的测量条件, 可从下列
几个方面考虑 。
? 1.测量波长的选择
? 由于有色物质对光有选择性吸收, 为了使
测定结果有较高的灵镀度和准确度, 必须选择
溶液最大吸收波长的入射光 。 如果有干扰时,
则选用灵敏度较低但能避兔干扰的入射光, 就
能获得满意的测定结果 。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
? 2.吸光度范围的控制
? 吸光度在 0.15-0.80时, 测量的准确度较高 。 为
此可以从下列几方面想办法,
? （ 1） 计算而且控制试样的称出量, 含量高时,
少取样, 或稀释试液；含量低时, 可多取样, 或萃
取富集 。
? （ 2） 如果溶液已显色, 则可通过改变比色皿的
厚度来调节吸光度大小 。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
? 3.参比溶液的选择
? 参比溶液是用来调节仪器工作零点的, 若参比
溶液选得不适当, 则对测量读数准确度的影响较大 。
选择的办法是,
? （ 1） 当试液, 试剂, 显色剂均无色时, 可用蒸馏
水作参比液 。
?（ 2） 试剂和显色剂均无色时, 而样品溶液中其他
离子有色时, 应采用不加显色剂的样品溶液作参比
液 。
?（ 3） 试剂和显色剂均有颜色时, 可将一份试液加
入适当掩蔽剂, 将被测组分掩蔽起来, 使之不再与
显色剂作用, 然后把显色剂, 试剂均按操作手续加
入, 以此做参比溶液, 这样可以消除一些共存组分
的干扰 。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
? 此外, 对于比色皿的厚度, 透光率, 仪器波长,
读数刻度等应进行校正, 对比色皿放置位置, 光电
池的灵敏度等也应注意检查 。
?第五节 吸光光度法的应用
? 吸光光度法除了广泛地用于测定微量成分外,
也能用于常量组分及多组分的测定 。 同时, 还可以
用于研究化学平衡, 络合物组成的测定等 。 下面简
要地介绍有关这些方面的应用 。
?一, 定量分析
?（ 一 ） 单组分的测定
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
?1.一般方法
? A-c标准曲线法
?2.示差法
? 当被测组分含量高时, 常常偏离朗伯 -比耳定律 。
即使不偏离, 由于吸光度太大, 也超出了准确读数的
范围, 就是把分析误差控制在 5%以下, 对高含量成
分也是不符合要求的 。 如果采用示差法, 就能克服这
一缺点, 也能使测定误差降到 ± 0.5％ 以下 。
? 示差法与普通光度法的主要区别在于它采用的参
比溶液不同, 它不是以 c=0的试剂空白作参比, 而是
以一个浓度比试液 cx稍小的标准溶液 cs作参比, 然后
再测定试液的吸光度 。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
? As=-lgTs=κbcs Ax=-lgTx=κbcx
? 实际测得吸光度 Af为
? Af=Ax-As=κb(cx-cs)=κbΔc
? cx=cs+Δc
? 示差法相对普通光度法提高测量准确度
的原因是扩展了读数标尺 。
? 从仪器构造上讲, 示差光度法需要一个
发射强度较大的光源, 才能将高浓度参比溶
液的吸光度调至零, 因此必须采用专门设计
的示差分光光度计 。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
(二 )多组分的同时测定
? 同时测定一种试样中的多种组分的基础是吸
光度具有加合性, 即总吸光度为各个组分吸光度
的总和 。
yyxxyx
yyxxyx
bcbcAAA
bcbcAAA
22222
11111
,,,,
,,,,
?????
?????
??
??
????
????
二, 络合物组成和酸碱离解常数的测定
?（ 一 ） 络合物组成的测定
? 1,摩尔比法
? 应用分光光度法可以测定络合物的组成 (络合比 )
和稳定常数 。 这里简要介绍一下用摩尔比法测定络
合物的络合比 。
? 设络合反应为 M + nR＝ MRn
? 通常是固定金属离子 M的浓度, 逐渐增加络合
剂的浓度 。 配位体为 R,显然, R应是无色的或在选
定的波长范围内无显著吸收 。 然后稀释至同一体积,
得到 [R]／ [M]为 1,2,3……的一系列溶液, 配制相应
的试剂空白, 在一定波长下, 测定其吸光度, 绘制
曲线, 用作图法求得络合比 。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
? 曲线前部分表示, 络
合剂 R浓度不断增加, 生
成的络合物不断增多, 吸
光度逐渐增大 。 当金属离
子 M全部形成络合物后,
络合剂 R的浓度再增加,
吸光度达到最大值而不再
变化 。 曲线峰部分转折不
明锐, 是由于络合物有微
小离解造成的 。 曲线峰两
线, 交于 D点, 由 D点向横
轴作垂线, 交于横轴的一
点, 这点的比值就是络合
物的配合化 。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
2.等摩尔连续变化法
? 此 法 是 保 持 溶 液 中
cM+cR为常数, 连续改变
cR/cM配制出一系列溶液 。
分别测量系列溶液的吸光
度 A,以 A对 cM/(cM+cM)作
图, 曲线折点对应的 cR/cM
值就等于络合比 n。
? 等摩尔连续变化法实
用于络合比低, 稳定性较
高的络合物组成的测定 。
? 此外还可以测定络合
物的不稳定常数 。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
?（ 二 ） 酸碱离解常数的测定
? 酸和碱的离解常数可用分光光度法测定, 离解
常数依赖于溶液的 pH值 。
? 设有一元弱酸 HB,按下式离解,
? HB =H+ + B-
? Ka=[B-][H+]/[HB]
配制三种分析浓度 c=[HB]+[B-]相等而 pH不同的溶液 。
第一种溶液的 pH在 pKa附近, 此时溶液中 HB与 B-共
存, 用 1cm的吸收池在某一定的波长下, 测量其吸
光度,
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
][][ ??? ???? BHBAAA BHBBHB ??
a
a
B
a
HB KH
cK
KH
cHA
?
?
?
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?
?
][][
][ ??
第二种溶液是 pH比 pKa低两个以上单位的酸性溶液, 此
时弱酸几乎全部以 HB型体存在, 在上述波长下测得吸光
度
第三种溶液是 pH比 pKa高两个以上单位的碱性溶液, 此
时弱酸几乎全部以 B-型体存在, 在上述波长下测得吸光
度
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
cA
cHBA
HBHB
HBHBHB
/
][
?
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?
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cA
cBA
BB
BBB
/
][
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将上各式整理得,
上式即为用分度法测定一元弱酸解离常数的基本
公式 。
三, 双波长分光光度法 （ 略 ）
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
AA
AA
pHpK
H
AA
AA
K
HB
B
a
B
HB
a
?
?
??
?
?
?
?
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lg
][
?第四节 吸光光度法分析条件的选择
?一, 显色反应及其条件的选择
?（ 一 ） 显色反应和显色剂
? 1.显色反应
? 在分光光度分析中, 将试样中被测组分转变成
有色化合物的反应叫显色反应 。 显色反应可分两大
类, 即络合反应和氧化还原反应, 而络合反应是最
主要的显色反应 。 与被测组分化合成有色物质的试
剂称为显色剂 。 同一组分常可与若干种显色剂反应,
生成若干有色化合物, 其原理和灵敏度亦有差别 。
一种被测组分究竞应该用哪种显色反应, 可根据所
需标准加以选择 。
?选择显色反应的一般标准,
?(1) 选择性要好 。 一种显色剂最好只与一种被测组
分起显色反应, 这样干扰就少 。 或者干扰离子容易
被消除, 或者显色剂与被测组分和干扰离子生成的
有色化合物的吸收峰相隔较远 。
? (2)灵敏度要高 。 由于吸光光度法一般是测定微量
组分的, 灵敏度高的显色反应有利于微量组分酌测
定 。 灵敏度的高低可从摩尔吸光系数值的大小来判
断, κ值大灵敏度高, 否则灵敏度低 。 但应注意, 灵
敏度高的显色反应, 并不一定选择性就好, 对于高
含量的组分不一定要选用灵敏度高的显色反应 。
?(3)对比度要大 。 即如果显色剂有颜色, 则有色化合
物与显色剂的最大吸收波长的差别要大, 一般要求在 60nm以上 。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
? (4)有色化合物的组成要恒定,化学性质要稳
定 。 有色化合物的组成若不确定, 测定的再
现性就较差 。 有色化合物若易受空气的氧化,
日光的照射而分解, 就会引入测量误差 。
? (5)显色反应的条件要易于控制 。 如果条件
要求过于严格, 难以控制, 测定结果的再现
性就差 。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
?2.显色剂
?(1)无机显色剂
? 许多无机试剂能与金属离子起显色反应, 如 Cu2+
与氨水形成深蓝色的络离子 Cu(NH4)42+,SCN-与 Fe3+
形成红色的络合物 Fe(SCN)2+或 Fe(SCN)63-等 。 但是多
数无机显色剂的灵敏度和选择性都不高, 其中性能较
好, 目前还有实用价值的有硫氰酸盐, 钼酸铵, 氨水
和过氧化氢等 。
?(2)有机显色剂
? 许多有机试剂, 在一定条件下, 能与金属离子
生成有色的金属螯合物 (具有环状结构的络合物 )。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
将金属螯合物应用于光度分析中的优点是,
1,大部分金属螯合物都呈现鲜明的颜色, 摩
尔吸光系数大于 104,因而测定的灵敏度很高；
2,金属螯合物都很稳定, 一般离解常数都很
小, 而且能抗辐射；
3,专用性强, 绝大多数有机整合剂, 在一定
条件下, 只与少数或其一种金属离子络合, 而且同
一种有机螯合剂与不同的金属离子络合时, 生成具
有特征颜色的螯合物
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
4,虽然大部分金属螯合物难溶于水,
但可被萃取到有机溶剂中, 大大发展了萃取
光度法 。
5,在显色分子中, 金属所占的比率很
低, 提高了测定的灵敏度 。 因此, 有机显色
剂是光度分析中应用最多最广的显色剂, 寻
找高选择性, 高灵敏度的有机显色剂, 是光
度分析发展和研究的重要内容 。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
? 在有机化合物分子中, 凡是包含有共轭双键的
基团如 —N＝ N—,—N＝ O,—NO2,对醌基, ＝ C＝
O(羰基 ),＝ C＝ S(硫羰基 )等, 一般都具有颜色,
原因是这些基团中的 л电子被光激发时, 只需要较
小的能量, 能吸收波长大于 200nm的光, 因此, 称
这些基团为生色团；某些含有未共用电子对的基团
如胺基 —NH2,RHN—,R2N—(具有一对未共用电子
对 ),羟基 -OH(具有两对末共用电子对 ),以及卤代
基 —F,—Cl,—Br,—I等, 它们与生色基团上的不
饱和键互相作用, 引起永久性的电荷移动, 从而减
小了分子的活化能促使试剂对光的最大吸收, 红移,
(向长波方向移动 ),使试剂颜色加深, 这些基团称
为助色团 。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
? 含有生色基团的有机化合物常常能与许多全
属离子化合生成性质稳定且具有特征颜色的化合
物, 且灵敏度和选择性都很高, 这就为用光度法
测定这些离子提供了很好的条件 。
? 有机显色剂的种类很多, 下面仅将应用较广
泛的几种介绍如下,
? 1.邻二氮菲
? 2.双硫腙
? 3,二甲酚橙
? 4,偶氮胂 III
? 5,铬天青 S
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
?（ 二 ） 显色反应条件的选择
? 显色反应能否完全满足光度法的要求, 除了与显
色剂的性质有主要关系外, 控制好显色反应的条件也
是十分重要的, 如果显色条件不合适, 将会影响分析
结果的准确度 。
?1.显色剂的用量
? 显色就是将被测组分转变成有色化合物, 表示,
? M + R = MR
? (被测组分 ) (显色剂 ) (有色化合物 )
? 反应在一定程度上是可逆的 。 为了减少反应的可
逆性, 根据同离子效应, 加入过量的显色剂是必要的,
但也不能过量太多, 否则会引起副反应, 对测定反而
不利 。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
?2.溶液的酸度
? 溶液酸度对显色反应的影响很大, 这是由于溶液
的酸度直接影响着金属离子和显色剂的存在形式以及
有色络合物的组成和稳定性 。 因此, 控制溶液适宜的
酸度, 是保证光度分析获得良好结果的重要条件之一 。
? (1)酸度对被测物质存在状态的影响
? 大部分高价金属离子都容易水解, 当溶液的酸度
降低时, 会产生一系列羟基络离子或多核羟基络离子 。
高价金属离子的水解象多元弱酸的电离一样, 是分级
进行的 。
? 随着水解的进行, 同时还发生各种类型的聚合反
应 。 聚合度随着时间增大, 而最终将导致沉淀的生成 。
显然, 金属离子的水解, 对于显色反应的进行是不利
的, 故溶液的酸度不能太低 。
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? (2) 酸度对显色剂浓度和颜色的影响
? 光度分析中所用的大部分显色剂都是有
机弱酸 。 显色反应进行时, 首先是有机弱酸
发生离解, 其次才是络阴离子与金属离子络
合 。
? M + HR＝ MR + H+
? 从反应式可以看出，溶液的酸度影响着
显色剂的离解,并影响着显色反应的完全程
度。当然，溶液酸度对显色剂离解程度影响
的大小，也与显色剂的离解常数有关,Ka
大时，允许的酸度可大； Ka很小时，允许
的酸度就要小些。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
? 许多显色剂本身就是酸碱指示剂，当溶液酸
度改变时，显色剂本身就有颜色变化。如果显色
剂在某一酸度时，络合反应和指示剂反应同时发
生，两种颜色同时存在，就无法进行光度测定。
例如、二甲酚橙在溶液的 pH＞ 6.3时呈红色，在
pH＜ 6.3时呈柠檬黄色，在 pH＝ 6.3时，呈中间色，
故 pH＝ 6.3时,是它的变色点。而二甲酚橙与金属
离子的络合物却呈现红色。因此，二甲酚橙只有
在 pH＜ 6的酸性溶液中可作为金属离子的显色剂。
如果在 pH＞ 6的酸度下进行光度测定，就会引入
很大误差。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
? (3)对络合物组成和颜色的影响
? 对于某些逐级形成络合物的显色反应,
在不同的酸度时, 生成不同络合比的络合
物 。 例如铁与水杨酸的络合反应, 当
? pH＜ 4 [Fe3+(C7H4O3)2-]+ 紫色
? 4＜ pH＜ 9 [Fe3+(C7H4O3)22-]- 红色
? pH＞ 9 [Fe3+(C7H4O3)32-]3- 黄色
? 在这种情况下, 必须控制合适的酸度,
才可获得好的分析结果 。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
? 3.时间和温度
? 显色反应的速度有快有慢 。 显色反应速度, 几
乎是瞬间即可完成, 显色很快达到稳定状态, 并且
能保持较长时间 。 大多数显色反应速度较慢, 需要
一定时间, 溶液的颜色才能达到稳定程度 。 有些有
色化合物放置一段时间后, 由于空气的氧化, 试剂
的分解或挥发, 光的照射等原因, 使颜色减退 。 适
宜的显色时间和有色溶液稳定程度, 也必须通过实
验来确定 。 实验方法是配制一份显色溶液, 从加入
显色剂计算时间, 每隔几分钟测定一次吸光度, 绘
制 A-t曲线, 根据曲线来确定适宜的时间 。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
? 不同的显色反应需要不同的温度, 一般显色反
应可在室温下完成 。 但是有些显色反应需要加热至
一定的温度才能完成；也有些有色络合物在较高温
度下容易分解 。 因此, 应根据不同的情况选择适当
的温度进行显色 。 温度对光的吸收及颜色的深浅也
有一定的影响, 故标样和试样的显色温度应保持一
样 。 合适显色温度也必须通过实验确定,做 A-C曲线
即可求出 。
? 4.有机溶剂和表面活性剂
? 溶剂对显色反应的影响表现在下列几方面 。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
?（ 1） 溶剂影响络合物的离解度 许多有色化合物在水中的离
解度大, 而在有机溶剂中的离解度小, 如在 Fe(SCN)3溶液中加
入可与水混溶的有机试剂 (如丙酮 ),由于降低了 Fe(SCN)3的离
解度而使颜色加深提高了测定的灵酸度 。
?（ 2） 溶剂改变络合物颜色的原因可能是各种溶剂分子的极性
不同, 介电常数不同, 从而影响到络合物的稳定性, 改变了络
合物分子内部的状态或者形成不同的溶剂化物的结果 。
?（ 3） 溶剂影响显色反应的速度 例如, 当用氯代磺酚 S测定
Nb时, 在水溶液中显色需几小时, 如果加入丙酮后,仅需 30分
钟 。
? 表面活性剂的加入可以提高显色反应的灵敏度, 增加有色
化合物的稳定性 。 其作用原理一方面是胶束增溶, 另一方面是
可形成含有表面活性剂的多元络合物 。
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? 5.共存离子的干扰及消除
? 共存离子存在时对光度测定的影响有以下几种类
型,
? (1) 与试剂生成有色络合物 。 如用硅钼蓝光度法
测定钢中硅时, 磷也能与钼酸铵生成络合物, 同时
被还原为钼蓝, 使结果偏高 。
? (2)干扰离子本身有颜色 。 如 Co2+(红色 ),Cr3+(绿
色 ),Cu2+(蓝色 )。
? (3)与试剂结合成无色络合物消耗大量试剂而使被
测离子络合不完全 。 如用水扬酸测 Fe3+时, Al3+、
Cu2+等有影响 。
? (4)与被测离子结合成离解度小的另一化合物 。 如
由于 F- 的 存 在, 能与 Fe3+ 以 FeF63- 形 式 存 在,
Fe(SCN)3本不会生成, 因而无法进行测定 。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
? 消除干扰的方法主要有以下三种,
? （ 1） 控制酸度
? 控制显色溶液的酸度, 是消除干扰的简
便而重要的方法 。 许多显色剂是有机弱酸,
控制溶液的酸度, 就可以控制显色剂 R的浓
度, 这样就可以使某种金属离子显色, 使另
外一些金属离子不能生成有色络合物 。
? 当溶液的情况比较复杂, 或各种常数值
不知道队则溶液最适合的 pH值须通过实验方
法来确定 。
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?（ 2） 加入掩蔽剂
? 在显色溶液里加一种能与干扰离子反应生成无
色络合物的试剂, 也是消除干扰的有效而常用的方
法 。 例如用硫氰酸盐作显色剂测定 Co2+,Fe3+有干优
可加入氟化物, 使 Fe3+与 F-结合生成无色而稳定的
FeF63-,就可以消除干扰 。
? 在另外的情况下, 也可通过氧化 —还原反应,
改变干扰离子的价态以消除于扰 。
?（ 3）采用萃取光度法 用适当的有机溶剂萃取有
色组分,如用丁二酮肟测定钯时,钯与丁二酮肟所形
成的内络盐,可被氯仿从酸性溶液中选择性地萃取。
许多干扰离子则不被萃取。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
?（ 4） 在不同波长下测定两种显色配合物的吸光度,
对它们进行同时测定 。
?（ 5） 寻找新的显色反应
? 如将二元配合物改变为三元配合物 。
?（ 6） 分离干扰离子
? 在没有适当掩蔽剂时, 干扰离于可用电解法,
淀法或离子交换法等分离除去 。
? 此外, 还可以通过选择适当的测量条件, 消除
干扰离子的影响 。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
二, 吸光光度法的测量误差及测量条件的选择
? 光度分析法的误差来源有两方面, 一方面是
各种化学因素所引入的误差, 另一方面是仪器精
度不够, 测量不准所引入的误差 。
?（ 一 ） 仪器测量误差
? 任何光度计都有一定的测量误差 。 仪器测量
误差主要是指光源的发光强度不稳定, 光电效应
的非线性, 电位计的非线性, 杂散光的影响, 滤
光片或单色器的质量差 (谱带过宽 ),比色皿的透
光率不一致, 透光率与吸光度的标尺不准等因素 。
对给定的光度计来说, 透光率或吸光度的读数的
准确度是仪器精度的主要指标之一, 也是衡量测
定结果准确度的重要因素 。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
光度计主要仪器测量误差是表头透射比的读数误
差 。 光度计的读数标尺上透射比 T的刻度是均匀的,
故透射比的读数误差 ΔT（ 绝对误差 ） 与 T本身的大
小无关, 对于一台给定仪器它基本上是常数, 一般
大 0.002-0.01之间, 仅与仪器身身的精度有关 。
bcTA ???? ln4 3 4.0 Tbc ln434.0 ???
T
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4 34.0 TT dTTT dTcdcE r lg4 3 4.0ln ???
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TT
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小浓度测量的相对误差最时即吸光度故
令
434.0,368.0
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1
22
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?
?（ 二 ） 测量条件的选择
? 选择适当的测量条件, 是获得准确测定结
果的重要途径 。 择适合的测量条件, 可从下列
几个方面考虑 。
? 1.测量波长的选择
? 由于有色物质对光有选择性吸收, 为了使
测定结果有较高的灵镀度和准确度, 必须选择
溶液最大吸收波长的入射光 。 如果有干扰时,
则选用灵敏度较低但能避兔干扰的入射光, 就
能获得满意的测定结果 。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
? 2.吸光度范围的控制
? 吸光度在 0.15-0.80时, 测量的准确度较高 。 为
此可以从下列几方面想办法,
? （ 1） 计算而且控制试样的称出量, 含量高时,
少取样, 或稀释试液；含量低时, 可多取样, 或萃
取富集 。
? （ 2） 如果溶液已显色, 则可通过改变比色皿的
厚度来调节吸光度大小 。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
? 3.参比溶液的选择
? 参比溶液是用来调节仪器工作零点的, 若参比
溶液选得不适当, 则对测量读数准确度的影响较大 。
选择的办法是,
? （ 1） 当试液, 试剂, 显色剂均无色时, 可用蒸馏
水作参比液 。
?（ 2） 试剂和显色剂均无色时, 而样品溶液中其他
离子有色时, 应采用不加显色剂的样品溶液作参比
液 。
?（ 3） 试剂和显色剂均有颜色时, 可将一份试液加
入适当掩蔽剂, 将被测组分掩蔽起来, 使之不再与
显色剂作用, 然后把显色剂, 试剂均按操作手续加
入, 以此做参比溶液, 这样可以消除一些共存组分
的干扰 。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
? 此外, 对于比色皿的厚度, 透光率, 仪器波长,
读数刻度等应进行校正, 对比色皿放置位置, 光电
池的灵敏度等也应注意检查 。
?第五节 吸光光度法的应用
? 吸光光度法除了广泛地用于测定微量成分外,
也能用于常量组分及多组分的测定 。 同时, 还可以
用于研究化学平衡, 络合物组成的测定等 。 下面简
要地介绍有关这些方面的应用 。
?一, 定量分析
?（ 一 ） 单组分的测定
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
?1.一般方法
? A-c标准曲线法
?2.示差法
? 当被测组分含量高时, 常常偏离朗伯 -比耳定律 。
即使不偏离, 由于吸光度太大, 也超出了准确读数的
范围, 就是把分析误差控制在 5%以下, 对高含量成
分也是不符合要求的 。 如果采用示差法, 就能克服这
一缺点, 也能使测定误差降到 ± 0.5％ 以下 。
? 示差法与普通光度法的主要区别在于它采用的参
比溶液不同, 它不是以 c=0的试剂空白作参比, 而是
以一个浓度比试液 cx稍小的标准溶液 cs作参比, 然后
再测定试液的吸光度 。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
? As=-lgTs=κbcs Ax=-lgTx=κbcx
? 实际测得吸光度 Af为
? Af=Ax-As=κb(cx-cs)=κbΔc
? cx=cs+Δc
? 示差法相对普通光度法提高测量准确度
的原因是扩展了读数标尺 。
? 从仪器构造上讲, 示差光度法需要一个
发射强度较大的光源, 才能将高浓度参比溶
液的吸光度调至零, 因此必须采用专门设计
的示差分光光度计 。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
(二 )多组分的同时测定
? 同时测定一种试样中的多种组分的基础是吸
光度具有加合性, 即总吸光度为各个组分吸光度
的总和 。
yyxxyx
yyxxyx
bcbcAAA
bcbcAAA
22222
11111
,,,,
,,,,
?????
?????
??
??
????
????
二, 络合物组成和酸碱离解常数的测定
?（ 一 ） 络合物组成的测定
? 1,摩尔比法
? 应用分光光度法可以测定络合物的组成 (络合比 )
和稳定常数 。 这里简要介绍一下用摩尔比法测定络
合物的络合比 。
? 设络合反应为 M + nR＝ MRn
? 通常是固定金属离子 M的浓度, 逐渐增加络合
剂的浓度 。 配位体为 R,显然, R应是无色的或在选
定的波长范围内无显著吸收 。 然后稀释至同一体积,
得到 [R]／ [M]为 1,2,3……的一系列溶液, 配制相应
的试剂空白, 在一定波长下, 测定其吸光度, 绘制
曲线, 用作图法求得络合比 。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
? 曲线前部分表示, 络
合剂 R浓度不断增加, 生
成的络合物不断增多, 吸
光度逐渐增大 。 当金属离
子 M全部形成络合物后,
络合剂 R的浓度再增加,
吸光度达到最大值而不再
变化 。 曲线峰部分转折不
明锐, 是由于络合物有微
小离解造成的 。 曲线峰两
线, 交于 D点, 由 D点向横
轴作垂线, 交于横轴的一
点, 这点的比值就是络合
物的配合化 。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
2.等摩尔连续变化法
? 此 法 是 保 持 溶 液 中
cM+cR为常数, 连续改变
cR/cM配制出一系列溶液 。
分别测量系列溶液的吸光
度 A,以 A对 cM/(cM+cM)作
图, 曲线折点对应的 cR/cM
值就等于络合比 n。
? 等摩尔连续变化法实
用于络合比低, 稳定性较
高的络合物组成的测定 。
? 此外还可以测定络合
物的不稳定常数 。
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
?（ 二 ） 酸碱离解常数的测定
? 酸和碱的离解常数可用分光光度法测定, 离解
常数依赖于溶液的 pH值 。
? 设有一元弱酸 HB,按下式离解,
? HB =H+ + B-
? Ka=[B-][H+]/[HB]
配制三种分析浓度 c=[HB]+[B-]相等而 pH不同的溶液 。
第一种溶液的 pH在 pKa附近, 此时溶液中 HB与 B-共
存, 用 1cm的吸收池在某一定的波长下, 测量其吸
光度,
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
][][ ??? ???? BHBAAA BHBBHB ??
a
a
B
a
HB KH
cK
KH
cHA
?
?
?
? ??
?
?
][][
][ ??
第二种溶液是 pH比 pKa低两个以上单位的酸性溶液, 此
时弱酸几乎全部以 HB型体存在, 在上述波长下测得吸光
度
第三种溶液是 pH比 pKa高两个以上单位的碱性溶液, 此
时弱酸几乎全部以 B-型体存在, 在上述波长下测得吸光
度
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
cA
cHBA
HBHB
HBHBHB
/
][
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cA
cBA
BB
BBB
/
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??
将上各式整理得,
上式即为用分度法测定一元弱酸解离常数的基本
公式 。
三, 双波长分光光度法 （ 略 ）
第 31讲 第十章 吸光光度法 第 2讲
AA
AA
pHpK
H
AA
AA
K
HB
B
a
B
HB
a
?
?
??
?
?
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lg
][
